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肾组织中检测乙型肝炎病毒DNA和RNA的意义
自Combes等首次报道乙型肝炎病毒(HBV)相关肾炎已近30年,但发病机制仍不很清楚,主要有免疫复合物沉积及HBV感染致病两种观点[1,2].本实验通过原位杂交检测HBV相关肾炎患者肾组织中HBV DNA和RNA,观察HBV在肾组织中的存在及复制情况,探索其在HBV相关肾炎中的致病作用.
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烫伤大鼠肠粘膜PGE2水平变化与肠粘膜损伤的关系
研究大鼠烫伤后肠粘膜损伤与PGE2含量变化的关系.以30%TBSA Ⅲ度大鼠为模型,观测肠粘膜厚度和绒毛长度变化,并测定肠粘膜中DNA的含量,放免法测定肠粘膜中PGE2的含量,原位杂交检测PGT mRNA表达的变化.
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累及皮肤的套细胞淋巴瘤一例
患者男,53岁,躯干四肢紫红色结节、斑块半月,眶周肿胀4d.体检:全身多处浅表淋巴结肿大,脾肿大.血钙3.12 mmol/L,LDH 853 U/L,血免疫固定电泳示单克隆免疫球蛋白IgM阳性(K链型),正电子发射断层显像/X线计算机体层成像检查示全身多处淋巴结肿大,咽后壁肿块,脾脏大.颈部皮肤结节组织病理检查示皮下脂肪组织内大量异形淋巴样细胞弥漫浸润,体积中等偏大,核圆形,核仁较明显,核分裂易见.免疫组化标记示异形细胞L26、CD79a、Bcl-2、细胞周期蛋白D1均阳性,多发性骨髓瘤原癌基因1部分阳性,Ki-67阳性率>80%,CD5、CD21、CD23、CD38、CD3、CD10、Bcl-6、CD45RO、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、髓过氧化物酶(MPO)、CD30、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、CD117、CD34均阴性.荧光原位杂交检测示t( 11;14)CCND1/IGH融合基因阳性.诊断:伴皮肤和眶周受累的套细胞淋巴瘤(母细胞变异型)合并高钙血症.治疗:给予利妥昔单抗注射液联合环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、地塞米松,交替以大剂量甲氨蝶呤及阿糖胞苷静脉注射,第3天血钙降至正常,第6天病情得到迅速控制,皮损及眶周肿胀明显消退,但随访治疗1个月后,患者终死于严重肺部感染.
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人巨细胞病毒先天性感染胎鼠大脑皮质钙调素基因mRNA表达的研究
目的研究先天性人巨细胞病毒(HCMV)感染致脑损害后钙调素(calmodulin,CaM)基因mRNA表达的改变,以探讨先天性HCMV感染所致脑损害的机制.方法选用10周龄Balb/c小鼠,雌雄小鼠腹腔内分别注射1.0ml、0.5ml、0.25ml HCMV后合笼交配以建立先天性HCMV中枢神经系统(CNS)感染小鼠模型,对照鼠腹腔注射1.0ml RPMI 1640液.剖腹取21天胎龄小鼠大脑皮质,以自行设计的CaM cDNA编码区的一对引物与一条CaM特异性探针,分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测CaM mRNA相对含量、用原位杂交检测大脑皮质细胞内相应mRNA的表达及定位.结果母鼠腹腔内接种HCMV量为1.0ml与0.5ml的临产胎鼠大脑皮质分离出相应病毒,病理学检查等确认发现了侵袭性脑膜脑炎性病理改变,证实HCMV可经小鼠宫内传播至胎鼠CNS.1.0ml组与0.5ml组胎鼠RT-PCR产物浓度明显高于0.25ml组及对照组,而1.0ml组与0.5ml组间亦有明显差异.电泳结果显示对照组与0.25ml组胎鼠未见阳性条带,而1.0ml组胎鼠特异性条带信号强于0.5ml胎鼠,仅略低于同组母鼠.原位杂交显示CaM mRNA不但出现在1.0ml组胎鼠大脑皮质大神经元胞核及胞浆内,在中小神经元及胶质细胞的胞核及胞浆亦有高密度表达,阳性细胞的突起中亦有弱信号存在.结论提示先天性感染HCMV胎鼠大脑皮质内CaM mRNA表达量明显增加,且神经元及胶质细胞均有表达,并与感染剂量有依赖关系.提示CaM mRNA表达增高可能直接参与了HCMV先天性感染脑损害的过程.
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复方花刺参粘多糖对髂动脉内皮剥脱家兔内膜增生的影响及机制
为了观察复方花刺参粘多糖对动脉损伤家兔内膜增生的影响及其作用机制,将雄性新西兰大白兔37只随机分为正常组、模型组、花刺参组和辛伐他汀组,髂动脉损伤术后6周全部家兔处死,取受损动脉,HE染色观察动脉形态学改变并图像分析测量动脉内膜、中膜厚度,原位杂交检测血小板源生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1的表达,免疫组织化学染色观察凋亡基因bcl-2和bax表达的改变.结果发现,与模型组相比,花刺参组和辛伐他汀组动脉内膜厚度及内膜中膜厚度比均明显减小(P<0.01),血小板源生长因子及转化生长因子β1的表达明显降低(P<0.05),bax表达明显升高(P<0.05),但bcl-2表达无明显差异;花刺参组与辛伐他汀组之间各指标均无显著差异.结果提示,复方花刺参粘多糖可有效减轻家兔髂动脉损伤血管内膜厚度和管腔狭窄,其作用机理与抑制血管平滑肌细胞增殖和促进凋亡有关.
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感染性休克大鼠肺组织内TNFα、IL-1β表达及行气破瘀汤的调节作用
目的:感染性休克常并发多器官功能障碍综合征(MODS) ,病死率高,肺脏是此时易发生损害的靶器官.在此过程中肺泡巨噬细胞(AM)持续、过度激活,导致局部组织细胞和全身性损伤.本实验观察了感染性休克时AM表达细胞因子TNFα、IL-1β的情况及中药"行气破瘀汤”的调节作用,以期进一步揭示AM激活导致肺损伤的机制,并为中西医结合疗法提供理论依据.方法: 健康Wistar大鼠90只 ,体重220-260 g,雌雄各半,随机分成3组:①对照组(n=28):开腹后钝性剥离阑尾周围组织后关闭腹腔.②模型组(n=30):阑尾根部结扎,阑尾尖端穿孔,关闭腹腔,成功制作感染性休克动物模型.③中药治疗组(n=32):造模后给予行气破瘀汤( 败酱草、丹皮、桃仁、冬瓜子、大黄、乳香、没药、山甲、皂刺、香白芷、陈皮)4 mL灌胃 ,每日2次.造模后72 h无菌条件下用生理盐水灌洗肺脏,收集肺泡巨噬细胞.巨噬细胞收获后调细胞浓度至1×109/L,分别加入24孔板内,置37℃,5%CO2孵箱内培养48 h,收集培养上清液,采用MTT法进行细胞因子活性测定.TNF活性以细胞毒效应百分比数(%) 表示.IL-1活性以×103 U/L表示.取各组动物新鲜肺组织块,OCT包埋,液氮速冻 ,制作5 μm厚冰冻切片,寡核苷酸探针原位杂交检测TNFα和IL-1的mRNA.结果: 模型组肺泡巨噬细胞分泌IL-1(108 120±10 510 U/L)、TNF(78.06%±4.65%) 的水平显著高于假手术对照组(21 500±3 310 U/L)、7.85%±1.25%,P<0.01)和中药治疗组(58 320±4 210 U/L,43.52%±2.18%,P<0.01).肺组织内IL-1β、TNF α的mRNA杂交信号主要位于组织内浸润的巨噬细胞内.模型组的表达量和表达细胞数均明显高于对照组和中药治疗组.结论: 感染性休克时肺泡巨噬细胞处于一种活化状态.这种活化状态,一方面可增强吞噬和杀菌功能,另一方面释放中性粒细胞趋化因子及各种炎症介质,加重局部的炎症反应,导致组织细胞的损害.中药"行气破瘀汤”具有明确的调节作用.
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扶正抑癌方对裸小鼠实验性大肠癌肝转移作用的研究
目的:建立裸鼠大肠癌肝转移模型,从转移成功率、转移瘤的大小等方面评价扶正抑癌方的疗效,并从MMP-2、VEGF、CEA的表达水平以及CD44v6的转录水平初步探讨其可能机制.方法:将40只BALB/C裸鼠随机分为5组:模型组、中药组、防治组、联合组、化疗组,以1×109cells/L浓度的LoVo细胞悬液0.2 mL接种于裸鼠脾脏,建立大肠癌肝转移模型.后四组分别予扶正抑癌方治疗、扶正抑癌方防治、扶正抑癌方+5-Fu治疗、5-Fu治疗,观察扶正抑癌方的疗效.观察各组转移成功率和转移瘤大小;免疫组化检测肝转移瘤中的MMP-2和VEGF含量;原位杂交检测肝转移瘤中CD44v6的转录水平;ELISA检测血清中CEA的含量.
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TTVDNA在肝细胞中的表达及其致病性研究
1997年12月日本学者Nishizawa等先从一例输血后非甲非庚型肝炎患者血清中分离到一种DNA病毒克隆(N22),命名为TT病毒(transfusion transmitted virus,TTV).并报道感染TTV后表现为一过性或持续性病毒血症,且病毒滴度与ALT升高相关,推测TTV可能是未知病毒致肝损害的病因之一[1].为探讨这一新型病毒在肝组织中的表达与分布特点,我们在TTV ORFl的保守区设计一对引物,采用PCR扩增法,以地高辛标记TTVORFl部分基因序列(1914-2186nt),获得双链TTV DNA探针.用此探针对部分肝病患者肝组织TTV DNA进行原位杂交检测,并对其中一株TTV ORFl部分基因进行分子克隆与核苷酸序列分析,现报道如下.
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乙型肝炎病毒感染的自然史研究进展
乙型肝炎病毒(HBV)感染机体后临床表现及转归差别很大,感染者在发生肝硬化和原发性肝癌(HCC)之前的任何阶段感染都可自行消失,而抗病毒药物如干扰素(INF)、核苷类物也可抑制病毒而影响感染的自然过程。弄清其自然史及其影响因素,有助于乙型肝炎的预后判断、药物疗效的分析及药品经济学评估,为其防治提供佐证。那么,HBV感染后的长期过程究竟是怎样的一种状况呢?现就有关研究作一简要综述。HBV可以感染任何年龄的人,不同的感染方式和年龄有不同的自然过程。HBV感染后的慢性携带率与感染的年龄密切相关,年龄越小,慢性化的可能越大。新生儿感染HBV后慢性携带率高达71%~90%,学龄前儿童感染后25%呈慢性携带,青少年和成人在3%以下。因此,母婴传播所造成的慢性携带率较高,中国HBV慢性携带者中40%~50%是通过母婴传播的。有报道在225名HBsAg阳性母亲的新生儿中145人在出生后一年内HBsAg阳转(占64.4%)。至于宫内感染,刘崇柏等[1]用原位杂交检测了HBsAg阳性母亲的引产儿肝片,计算出宫内感染率约5%,与新生儿免疫接种的预防效果相符。而田庚善等[2]也采用分子杂交对HBsAg阳性母亲的引产儿肝脏进行了检测,却发现胎儿感染率高达26.7%,与新生儿免疫预防效果不相符的原因认为与胎儿肝脏中HBV DNA为非复制型或整合型不表达HBsAg有关。
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单纯TTV感染的临床病理
1.资料与方法:原因不明性急慢性旰炎患者27例,血清病毒学标记甲-戊、CMV、EBV(酶联免疫吸附法)及肝活检组织免疫组织化学检测H B s A g、HBcAg、HCVNS5Ag、EBVAg、原位杂文检测HGV RNA均阴性.所有患者均无饮酒(或偶尔少量饮酒)、损肝药物、自身免疫性疾病及输血史.肝组织行TTVDNA原位杂交检测,对其阳性病例的血清采用PCR及斑点杂交检查TTV核酸.肝小叶内炎症及纤维化评估采用组织学活动指数(HAI,KHodell计分法).肝功能主要包括ALT、TBil等,采取自动化分析检测,以临近肝穿日期值为准.
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大鼠基因工程化神经干细胞的建立
自从九十年代初科学家们分离、培养出神经干细胞以来,人们相继从各种动物及人的中枢神经系统内分离、培养了神经干细胞,因其具有很强的分裂、增殖及自我更新能力,打破了传统的认为中枢神经系统细胞不能再生的观念,为中枢神经系统损伤修复及某些疾病的治疗带来了新的希望.随着基因工程技术的发展,人们可根据不同的科研及治疗目的,对神经干细胞进行不同的遗传学修饰、以制成基因工程细胞,这些细胞极具科研和应用价值,受到广泛关注.本实验利用无血清培养技术,分离、培养了胚鼠端脑神经干细胞,并用巢素(Nestin)免疫组化染色鉴定;诱导神经干细胞分化,用神经丝-200(NF-200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 免疫组化染色鉴定分化细胞.再用含有脑源性神经营养因子(BDNF)的复制缺陷型腺病毒感染神经干细胞,并用原位杂交检测.结果显示:①获得了大量未分化,呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,且能诱导分化为神经元和神经胶质细胞.②约80-90%神经干细胞能被腺病毒感染,经传代培养12代后仍具干细胞特性.因此,本实验从胚鼠端脑分离培养的细胞具有自我更新能力和多潜能分化能力,为中枢神经系统的干细胞.经基因工程化及传代后 ,仍具干细胞特性,获得了大量基因工程化的神经干细胞,以期为神经干细胞的基础研究和中枢神经损伤修复及疾病治疗提供基础资料.
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荧光原位杂交检测SRY基因诊断46,XY女性性反转一例
患者 15岁,社会性别女,因原发闭经来我院就诊.查体:身高155 cm,体重56 kg,双乳未发育.外阴呈正常女性,直肠腹部双合诊检查子宫卵巢未及.B超检查显示双乳有少量腺体,未见子宫和卵巢(图1、2),腹股沟及腹部未检到睾丸组织.查内分泌激素,促卵泡激素11.2 U/L,促黄体生成激素11.7U/L,雌二醇<18.35 pmol/L,睾酮3.41 nmol/L,泌乳素1.48nmol/L,皮质醇487.6 nmol/L.
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46,XY性分化异常一例
患者 社会性别女,29岁,未婚.原发闭经,身高159 cm,体重48 kg,智力正常,女性面容,无喉结,乳房发育可,无腋毛.妇科检查:外阴幼稚型,无阴毛,处女膜完整,可容一指,阴道深约3 cm,呈U形盲端,未及宫颈,顶端可触及皱襞.B超提示:始基子宫,卵巢缺如.血清性激素测定:促卵泡刺激素为14.2 U/L,促黄体生成素为22.7 U/L,泌乳素为0.637 nmol/L(参考值<0.91 nmol/L),雌二醇为187 pmol/L,孕酮为2.85 nmol/L,睾酮为20.09 nmol/L.细胞遗传学检查:染色体核型为46,XY.荧光原位杂交检测:计数100个细胞,均为X、Y两个信号.
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荧光原位杂交技术产前诊断一例45,X
孕妇女,29岁,干部,身体状况一般.无急、慢性传染病史,非近亲婚配.因产前检查发现胎儿发育与孕月不符,羊水少,即行B超检查,提示:胎儿皮下组织增厚,四肢水肿.追问病史,既往曾在载波室工作,孕前已离开原工作单位约1年.夫妇均无放射及病毒接触史,其丈夫为机关干部,身体健康.对孕妇进行血生化检查,排除了Rh阴性及ABO血型不符.细胞遗传学检查:对孕妇及其丈夫外周血作常规培养,G显带计数中期细胞分裂相各30个,结果夫妇双方核型正常;羊水及脐血常规培养,G显带核型分析50个分裂相,核型为45,X.用X着丝粒探针对(地高辛间接标记DNA特异性探针)染色体非整倍体进行荧光原位杂交检测(fluorescence in situ hybridization, FISH),发现染色体X着丝粒上和间期细胞核中均显示1个黄绿色杂交信号(图1).
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蛋白翻译起始因子C2在原发性肝细胞肝癌中表达的意义
[张庆,刘杰,张力,李青,王新,樊代明. 世界华人消化杂志,2001;9(5):533-537] 目的研究C2 mRNA及其蛋白在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达及意义. 方法用原位杂交检测C2 mRNA在21例HCC及其癌旁组织中的表达,ABC免疫组化法检测C2蛋白在60例HCC及其42例癌旁组织中的表达,Western blot检测C2蛋白在HCC及其癌旁组织中的表达. 结果 21例HCC及其癌旁组织中,C2 mRNA阳性率分别占23.8%(5/21)和85.7%(18/21). 60例HCC及42例癌旁组织中,C2蛋白阳性分别占27.3%(17/60)和83.3%(35/42). 27例肝硬变中,C2蛋白阳性率为77.8%(21/27). χ2检验:C2 mRNA及其蛋白在HCC癌旁组织中表达明显高于癌组织(P<0.001);C2蛋白在肝硬变中的表达明显高于HCC癌组织(P<0.001);C2的表达与患者年龄、HBsAg及AFP有明显关系(P<0.001);碉与癌组织的分化程度、肿瘤大小、淋巴转移无关;Western bolt与免疫组化结果一致. 结论 C2基因表达下调可能与HCC的发生、发展及早期诊断. (何扬举)