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BAK基因过表达对胃癌细胞的诱导凋亡作用及其分子机制
目的:探讨转染外源性BAK基因及其过表达对胃癌细胞的诱导凋亡作用和分子机制.方法:构建携带有BAK基因的真核表达载体并转染胃癌MKN-45细胞1-5d后,RT-PCR和Western Blotting法检测BAK基因表达;细胞计数、MTT比色法检测癌细胞生长活性,流式细胞仪分析细胞周期时相改变,透射电镜、末端TdT酶标记技术检测癌细胞凋亡;比色法检测癌细胞内Caspase-3活性改变.结果:转染1-5 d后,癌细胞BAK mRNA和蛋白表达水平显著增强(P＜0.01),癌细胞体外生长抑制11.6-35.3%(P＜0.01),增生活性抑制10.2-32.4%(P＜0.01),细胞周期出现G0/G1期阻滞,部分癌细胞出现胞体缩小、核固缩等凋亡形态学改变,凋亡率为21.4%(P＜0.01);癌细胞Caspase-3活性增强4.45倍(P＜0.01).结论:转染外源性BAK基因使其过表达能激活Caspase-3,显著诱导胃癌MKN-45细胞凋亡,有望成为胃癌治疗的新途径.
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幽门螺杆菌和非甾体消炎药对胃上皮细胞动力学的影响
目的:观察幽门螺杆菌(Hpylori)和非甾体消炎药(NSAID)对胃上皮细胞增生凋亡的影响.方法:胃癌细胞株AGS与H pylori和/或消炎痛,阿司匹林体外共培养,通过MTT比色法,增生细胞核抗原(PCNA)的Western Blotting检测技术,观察细胞增生青况,FITCAnnexin-V/PI双染色流式细胞仪检测,DNA凝胶电泳,透射电镜方法等检测细胞凋亡.结果:MTT比色法和蛋白质印迹检测细胞PCNA表达结果表明细胞毒素相关基因A(CagA)阳性的H pylori菌株NCTC11637能够促进细胞增生,此外,低密度(3.2×107-4×109CFU/L)NCTC11637能促进细胞的增生,而高浓度(＞2×1010CFU/L)则抑制细胞的增生.消炎痛和阿司匹林能抑制细胞的活力.当AGS细胞与H pylori和NSAID共同孵育时,细胞的生长亦明显受到抑制.FITC-AnnexinV/PI双染色流式细胞仪检测表明消炎痛和阿司匹林可诱导细胞凋亡明显增强,而Hpylori组则未见凋亡的增强,当二者共同作用于AGS细胞时,细胞凋亡率明显升高,但与非甾体消炎药单独作用组相比,则有所下降.透射电镜和DNA琼脂糖凝胶电泳进一步证实了FITC-Annexin-V/PI双染色流式细胞仪检测的结果.结论:CagA阳性的Hpylori更加容易促进胃上皮细胞的增生.H pylori对细胞生长的影响与H pylori的密度有关.Hpylori和NSAID间的作用是相互拮抗的.
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银杏叶制剂对低氧肺动脉平滑肌蛋白激酶Ca表达的影响
银杏叶提取物可明显抑制低氧性肺动脉高压的发生并阻止低氧介导的右心室肥厚的形成[1-3],但机制尚未明确.我们应用原位杂交、免疫细胞化学及四甲基偶氮唑盐(MTT)微量比色法等技术观察了银杏叶制剂(BN52021)对低氧肺动脉平滑肌细胞(PA SMC)增殖速率及蛋白激酶C(PKC)α mRNA表达的影响,以探讨银杏叶制剂治疗低氧性肺动脉高压的机制.
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急性压力超负荷致心肌肥大过程中心肌内分泌因子活化及相互作用
目的探讨急性压力超负荷致大鼠心肌肥大过程中心肌内分泌活化及相互间的作用.方法放免法、比色法及免疫组组织化学检测腹主动脉缩窄高血压大鼠心肌组织中血管紧张素Ⅱ、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白表达及一氧化氮含量的变化,并观察卡托普利对它们的作用.
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丝裂霉素C联合抗Fas单抗、C2神经酰胺对人膀胱癌T24细胞的抑制作用
化学治疗是膀胱癌术后治疗的重要方法,但药物的毒副作用和肿瘤的耐药现象常使治疗归于失败.合理的联合用药可以获得协同作用,减少用药剂量,降低毒副反应,延缓耐药性产生.本研究于2004年9月至11月于2004年9月至11月应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测丝裂霉素C(MMC)、抗Fas单抗和C2神经酰胺(C2-Cer)对人膀胱癌T24细胞株生长的抑制作用,并应用Chou-Talalay联合指数法[1]判定药物之间联合应用的效果.
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扫描仪和Photoshop在口腔科Vita比色板色阶分析中的应用
临床上确定牙齿颜色的方法常常是以视觉为主的比色法,但要想准确描述牙齿的颜色还存在一定困难.我们利用计算机和扫描仪对Vita比色板进行测试分析,以了解Vita比色板的色度学规律,为临床应用提供依据.
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脱氧氟尿苷用于提高人卵巢癌细胞株对顺铂敏感性的研究
肿瘤细胞减灭术及术后化学药物治疗(化疗)是目前治疗卵巢癌的主要手段,以铂类为基础的联合化疗明显改善了晚期卵巢癌患者的治疗效果,但耐药性的产生严重影响其化疗效果.本研究采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、免疫细胞化学链霉菌抗生物素-过氧化物酶连接(SP)法和流式细胞术等方法,分析了脱氧氟尿苷(FUDR)作用后卵巢癌细胞株CAOV3对顺铂敏感性的变化,并初步探讨其机理,为临床制定有效的联合化疗方案提供理论依据.
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胃癌细胞原代培养药敏检测的临床应用研究
目的:探讨胃癌对不同化疗药物的敏感性差异,从而对围手术期辅助化疗及晚期患者化疗起指导作用.方法:应用MTT比色法测定了151例体外原代胃癌细胞对化疗药物的敏感性.结果:无论是单药组间比较,还是联合药物组间比较,其敏感性的差异均有极显著意义,P<0.01;其中,单药以羟基喜树碱(HCPT)和丝裂霉素(MMC)的敏感性为好,其敏感率分别为62.91%、52.98%;联合药物以5-氟尿嘧啶(5-FU) 加HCPT和5-FU加MMC的敏感性为好,其敏感率分别为76.82%、60.93%.各单药分别与其对应的联合药物比较,除MMC与5-FU加MMC、多柔比星(ADM)与5-FU加ADM及斑蝥酸钠(奇宁)与5-FU加奇宁的敏感性差异无显著意义外P>0.05,其余药物的敏感性差异均有显著意义,P<0.05.结论:体外肿瘤细胞药敏试验对临床肿瘤化疗用药有很强的预见性,且能发现耐药病例;胃癌对联合药物的敏感性明显优于单药.
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肿瘤患者外周血淋巴细胞与肿瘤细胞体外化疗药敏研究
目的:研究肿瘤患者外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBL)的体外化疗药物敏感性,以及与肿瘤细胞化疗药敏的相关性.方法:采用MTT法测定了142例肿瘤患者PBL及其肿瘤细胞对17种临床常用化疗药物的敏感性.结果:神经胶质瘤患者PBL与肿瘤细胞对15种化疗药的敏感性相关性好,差异无统计学意义,P>0.05;骨肉瘤患者PBL与肿瘤细胞对13种化疗药的敏感性相关性好,差异无统计学意义,P>0.05;乳腺癌患者PBL和肿瘤细胞对12种化疗药物的敏感性差异有统计学意义,P<0.05或P<0.01.结论:神经胶质瘤和骨肉瘤患者PBL对化疗药物的敏感性具有良好的正相关性,提示PBL的体外化疗敏感性检测对这两种肿瘤的临床化疗药物的选择具有重要的参考价值.
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尼美舒利逆转人胃癌细胞耐药的实验研究
目的:研究环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制剂尼美舒利(nimesulide,NIM)对丝裂霉素 (mitomycin,MMC)抑制体外培养人胃癌细胞株SGC 7901及其耐药亚系SGC 7901/VCR的细胞增殖及诱导凋亡的影响,初步探讨NIM逆转人胃癌细胞耐药的机制.方法:1) MTT比色法及集落形成实验研究NIM对MMC抑制人胃癌细胞SGC 7901,及其耐药亚系SGC 7901/VCR细胞增殖的影响;2)流式细胞仪技术及吖啶橙(acridine orange,AO)荧光染色研究NIM对MMC诱导人胃癌细胞SGC 7901,及其耐药亚系SGC 7901/VCR细胞凋亡的影响.结果:1) 联合应用NIM与单用MMC比较,SGC 7901细胞株中,MMC对SGC 7901细胞的半数抑制浓度(IC50)降低0.74 μg/mL,集落形成率下降46.4%.SGC 7901/VCR细胞株中, IC50从>2.0 μg/mL下降到0.65 μg/mL,集落形成率下降31%;2) SGC 7901细胞株及其耐药亚系SGC 7901/VCR细胞株中, NIM+MMC组的染色阳性细胞数分别为47.00±1.00、30.33±4.16,较其他组别均有显著升高,流式细胞仪分析细胞凋亡结果与其基本一致.结论:1) COX-2选择性抑制剂NIM能增强MMC抑制人胃癌细胞株SGC 7901,及SGC 7901/VCR的细胞增殖和诱导其凋亡的作用;2)NIM对体外培养的人胃癌细胞株的多药耐药有一定的逆转作用.
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MTT法体外药敏试验指导下胃肠癌的预见性化疗
目的:研究MTT法体外药敏试验指导下胃肠癌预见性化疗的临床意义.方法:取27例新鲜胃肠癌标本进行体外MTT法药物敏感试验(MTT试验组),27例同期胃肠癌患者作经验对照组.试验组按药敏试验结果化疗,耐药者按临床经验化疗;对照组按临床经验化疗.结果:27例药敏试验完成实验,药敏阳性者胃癌8例,肠癌5例;阴性者胃癌7例,肠癌7例.临床化疗结果:试验组中对药物敏感者化疗有效率76.9%,耐药者中有效率14.3%,经统计学处理差异有显著性,x2=10.7,P<0.01;试验组总有效率为44.4%.经验对照组化疗后有效率为25.9%,经统计学处理两组疗效差异有显著性,x2=9.5,P<0.01.MTT实验结果与临床化疗结果的符合率为81.48%(10+12/27).结论:MTT法检测癌细胞对抗癌药或敏感试验可以预见胃肠癌的化疗.
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消化道肿瘤细胞与外周血淋巴细胞体外药敏试验相关性的研究
目的:通过MTT法检测外周血淋巴细胞能否替代消化道肿瘤细胞进行体外药敏试验,为不能进行肿瘤细胞药敏检测的消化道肿瘤患者提供化疗依据.方法:消化道肿瘤患者术前取血,术中取肿瘤组织,均采用单层细胞培养法对临床常用的7种抗肿瘤药进行药敏实验,以MTT法进行检测.结果:7种化疗药物体外对肿瘤细胞与外周血淋巴细胞抑制率比较,除卡铂、顺铂P＜0.05,其余5种均差异无统计学意义；外周血淋巴细胞与肿瘤细胞对各化疗药药敏符合度为72.5％～85.0％,药敏相关性r值为0.506 9～0.745 8,P值均＜0.01.结论:消化道肿瘤患者肿瘤细胞和外周血淋巴细胞药敏结果存在着正相关性,在无法获取肿瘤标本时,外周血淋巴细胞可替代肿瘤细胞进行药敏试验.
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宫颈癌患者血浆溶血磷脂酸表达临床意义的探讨
目的:探讨血浆溶血磷脂酸(LPA)在宫颈癌中的表达及临床意义.方法:利用化学比色法检测135例宫颈癌和85例宫颈良性疾病患者及40位健康体检者(对照组)血浆溶血磷脂酸含量,同时采用电化学发光法检测血浆CYFRA21-1含量并作对比分析.结果:宫颈癌组患者血浆LPA水平为(5.11±1.92)μmol/L,明显高于对照组的(2.31±0.45)μmol/L,P＜0.01；宫颈良性疾病组患者血浆LPA水平为(2.46±1.05) μmol/L,与对照组比较差异无统计学意义,P＞0.05.血浆LPA对宫颈癌诊断的灵敏度和特异度分别为67.4％和97.5％,CYFRA21-1的灵敏度和特异度分别为41.5％和95.0％,LPA均优于CYFRA21-1.血浆LPA和CYFRA21-1在宫颈鳞状上皮癌的表达分别为71.0％和43.5％,均高于腺癌+腺角化癌的27.3％和18.2％,P值均＜0.05.宫颈癌晚期(Ⅲ+Ⅳ期)CYFRA21-1阳性率53.2％,明显高于早期(I+Ⅱ期)的14.6％；有远处转移的宫颈癌患者血浆LPA阳性率91.9％,明显高于无远处转移者的24.5％,P＜0.05.结论:LPA可能与宫颈癌的浸润和转移有关；血浆LPA检测对宫颈癌的诊断及鉴别诊断具有一定的临床应用价值.
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E钙黏蛋白对MNNG诱导GES-1增殖影响及其与Gli1基因相关性研究
目的:研究E钙黏蛋白(E-Cad)在甲基硝基亚硝基胍(MNNG)作用于人胃黏膜GES-1永生化细胞生成MC细胞后对增殖能力的影响,并探讨其与Gli1基因的相关性.方法:MTT比色法观察GES-1细胞组、MC细胞组及环靶明干扰细胞组的生长周期表达.半定量RT-PCR观察3组细胞Shh和Gli1基因的表达.荧光共聚焦观察3组细胞E-Cad的表达.结果:MTT比色实验绘制生长曲线显示,MC组＞环靶明干扰组＞GES-1细胞组,差异有统计学意义,P＜0.05.半定量RT PCR显示,MC细胞组的Gli-1mRNA相对表达水平为0.454 2±0.008 4,高于环靶明干扰组的0.244 8±0.002 6,t=6.735,P=0.015；荧光免疫显示,GES-1细胞组与环靶明干扰细胞组E-Cad的平均荧光强度分别为719±114与278±43,均明显高于MC细胞组的64±14,t值分别为9.437和4.357,P值分别为0.001和0.002.结论:Gli1可能参与调控E-Cad的表达,使其在MC细胞的表达减少,增强MC细胞的体外增殖活性.
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HSP70-TKD诱导NK细胞对胰腺癌细胞杀伤作用及其机制的探讨
目的:探讨从人外周血单核细胞(PBMC)由干细胞培养基扩增得到的NK细胞,在热休克蛋白70短肽(HSP70-TKD)刺激下杀伤细胞膜HSP70表达阳性胰腺癌细胞的机制.方法:用干细胞培养基从健康人PBMC中高效扩增得到CD3-CD56+ NK细胞,ELISA方法测定HSP70-TKD诱导的NK细胞分泌IFN-γ的水平；ELISPOT方法分析其颗粒酶-B的表达情况；用MTT法测定HSP70-TKD诱导的NK细胞,对细胞膜HSP70表达阳性的胰腺癌细胞Colo+和表达阴性的胰腺癌细胞Colo-杀伤活性；从而分析其杀伤活性与IFN-γ分泌和颗粒酶-B表达的相关性.结果:由外周血扩增NK细胞在2.0 μg/mL的HSP70-TKD刺激下,其IFN-γ分泌从刺激前的(8.9±0.7)ng/mL增加到(30.2±1.3) ng/mL,差异有统计意义,P＜0.05;而颗粒酶-B的表达从(3.2±0.3)％增加到(21.2±0.6)％,差异有统计意义,P＜0.05.HSP70-TKD诱导的NK细胞对Colo-杀伤活性低,与未经诱导的NK细胞比较差异无统计学意义；而对Colo+杀伤活性高,诱导组与未诱导组之间差异有统计学意义；当TKD浓度为2.0μg/mL时,杀伤活性高为(60.1±2.8)％,而未诱导的NK细胞杀伤活性为(27.8±2.6)％.结论:NK细胞在2.0 μg/mL的HSP70-TKD诱导下,其IFN-γ分泌、颗粒酶-B的表达和对Colo+杀伤活性达到高,推断HSP70-TKD诱导NK对细胞膜HSP70表达阳性细胞的杀伤可能与其IFN-γ分泌和颗粒酶-B的表达有关.
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DEK基因沉默对宫颈癌CaSki细胞增殖和凋亡影响的研究
目的:通过观察DEK基因沉默后对CaSki细胞增殖、细胞周期及凋亡影响,探讨DEK原癌基因siRNA对宫颈癌细胞的影响和机制.方法:将DEK siRNA真核表达载体转入CaSki细胞,转染48 h后,采用MTT法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期改变情况.结果:与对照组和未转染组相比,转染psiRNA-hHDEK组CaSki 细胞增殖的抑制率和凋亡率均增高,分别为53.2%和(13.84±3.19)%,P值分别为0.038和0.002;psiRNA-hHDEK转染组G0/G1期细胞比率(82.65±5.23)较对照组(74.36±7.49)和未转染组(70.25±5.11)增多,差异有统计学意义,P=0.003;psiRNA-hHDEK转染组细胞增殖指数(17.35%)明显低于未转染组(29.75%)和对照组细胞(25.64%),差异有统计学意义,P=0.02.结论:DEK基因抑制可能诱导CaSki细胞凋亡,并能影响肿瘤细胞内DNA的复制和合成,抑制细胞的正常分裂,从而抑制细胞增殖.
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维甲酸对胃癌细胞生长抑制及凋亡的诱导作用
目的:研究9-顺-维甲酸(9-cis-RA)对人胃低分化黏液腺癌细胞(MGC80-3)的作用.方法:MTT比色法观察9-cis-RA对MGC80-3细胞株的生长抑制作用,倒置显微镜观察细胞形态变化,Hoechst33342/PI双荧光染色和DNA凝胶电泳技术分析细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期的改变.结果:9-cis-RA可抑制MGC80-3细胞生长,半数抑制浓度(IC50)为8.07×10-6mol/L;显微镜观察可见细胞凋亡特征性改变;10-5mol/L浓度的9 cis RA药物作用后96 h可明显诱导MGC80-3细胞凋亡,琼脂糖凝胶电泳检测到DNA梯带;流式细胞仪检测肿瘤细胞出现典型亚二倍体凋亡小峰,G0/G1期细胞百分率明显升高,由对照组的(61.5±2.2)%增加到(74.3±4.7)%,F=149.795,P=0.000;同时处于S期的细胞数减少,由对照组的(26.3±1.3)%减少到(17.2±1.4)%,F=143.936,P=0.000.细胞周期出现G1期阻滞.结论:9-cis-RA对MGC80-3细胞有明显的生长抑制和诱导凋亡作用.
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几种化疗药物对肝癌耐药细胞BEL7404/ADM端粒酶活性的影响
目的:研究顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、多柔比星(ADM)和长春新碱(VCR)4种化疗药物对人肝癌细胞株BEL-7404、耐阿霉素肝癌细胞株BEL-7404/ADM的细胞毒作用及其对端粒酶活性影响的关系.方法:采用MTT法测定常用4种(DDP、MMC、ADM和VCR)化疗药物对人肝癌细胞株BEL-7404、BEL-7404/ADM的体外抑制作用;以TRAP-PCR-ELISA法检测化疗药物作用后两种细胞端粒酶的活性.结果:DDP、MMC、ADM、VCR对BEL-7404均敏感,各种化疗药物IC50大小比较,DDP和ADM比VCR和MMC均小;而对BEL-7404/ADM这几种化疗药物敏感性均不同程度下降,其中以ADM及VCR尤其明显,耐药倍数分别为100.0倍、60.14倍.未加药前,肝癌亲本细胞BEL-7404和耐药细胞BEL-7404/ADM端粒酶活性均表达,加入化疗药物后,亲本细胞端粒酶活性下降明显,并呈现时间-剂量关系,而对于耐药细胞,只有高浓度的化疗药物才能抑制其端粒酶活性.结论:端粒酶活性的抑制与耐药细胞对药物敏感性存在一定关系,端粒酶可作为化疗敏感的潜在标志.
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胃与大肠癌体外药物敏感性与临床病理特征关系的探讨
目的:研究消化道肿瘤体外化疗药敏性与其临床病理因素的关系.方法:时35例胃癌、37例大肠癌进行MTT法肿瘤细胞原代培养药物敏感性实验,同时检测了癌组织P-gp、GST-π和p53蛋白的表达.结果:9种化疗药物对肿瘤细胞抑制率在性别、肿瘤直径间差异变化均不明显,P均>0.05;5-氟尿嘧啶(5-FU)、奥沙利铂(L-OHP)、表柔比星(EADM)、吡柔比星(THP)和丝裂霉素(MMC)对<65岁者的肿瘤抑制率高于≥65岁者(P均<0.05)}5-FU、Vp-16、L-OHP、EADM和THP对胃癌的抑制率高于大肠癌,P<0.05;5-FU、Vp-16、PTX、L-OHP和DDP对低分化腺癌的抑制率高于高中分化癌(P<0.05);仅HCPT、L-OHP的抑制率在Ⅲ～Ⅳ期明显高于Ⅰ～Ⅱ期,P值为0.047和0.007;高中分化腺癌组织中P-gP和GST-π表达明显高于低未分化癌(u=0.002 1、u=0.007 5,P<0.01).结论:胃肠道癌耐药性与患者的年龄、组织学分级有关,消化道肿瘤临床病理部分特征也具有一定预测肿瘤化疗敏感性的价值.
关键词： 消化系统肿瘤/病理学 比色法 药物筛选试验 抗肿瘤 -
牛蛙核糖核酸酶的表达和鉴定及功能检测
目的:在大肠埃希菌中高效表达牛蛙核糖核酸酶(rana catesbeiana ribonuclease, RC-RNase),并对其纯化产物进行噻唑蓝(tetrazolium blue, MTT)实验,观察对肝癌细胞的抑制效果.方法:用异丙基硫代-D-半乳糖苷(isopropylthio-D-galactoride, IPTG)诱导原核表达质粒PET32a-RC-RNase在大肠埃希菌E.coli Bl21(DE3)plysS中表达.菌体经超声、离心后,用Ni-NTA Agarose亲和层析法对包涵体进行纯化.采用MTT法检测纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞的杀伤活性.结果:纯化的目的蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel eletrophoresis, SDS-PAGE)蛋白电泳表明,RC-RNase在大肠埃希菌中是以包涵体的形式表达.用MTT法的结果中可以看出,纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞具有一定的抑制效果,其IC50值(半抑制浓度)是22.44 μg/mL.结论:牛蛙核糖核酸酶在大肠埃希菌中得到大量表达,为进一步研究其生物学特性以及功能打下了良好的基础.
