首页 > 文献资料
-
登革2型病毒E基因的表达及应用于血清学检测
目的 利用大肠杆菌表达登革病毒2型外膜蛋白,获得重组抗原应用于血清学检测.方法 用RT-PCR法扩增登革2型病毒去除C端100个氨基酸的外膜蛋白基因片段,与表达载体pET-30a连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白用电洗脱法进行纯化.纯化的重组蛋白用间接ELISA法检测登革2型感染者血清,检测结果 与间接免疫荧光法、澳大利亚Panbio试剂进行比较.结果 重组质粒构建成功,经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达重组蛋白.纯化的重组蛋白用于检测登革2型感染者血清,以IFTA作为参照标准,其敏感性为95.6%,特异性为96.8%.与澳大利亚Panbio IgG捕获法ELISA试剂盒检测结果 相比,两种方法 对登革2型IgG的检出率无统计学意义(P>0.05).结论 成功通过大肠杆菌表达登革2型去除C端疏水区的外膜蛋白,重组抗原可应用于血清学检测.
-
温度对DEN-2型病毒在白纹伊蚊体内外潜伏期的影响
目的 研究温度对登革2型病毒在蚊体内的外潜伏期的影响.方法 登革2型病毒人工经口感染白纹伊蚊,冻麻挑出吸饱血的雌蚊放入新的蚊笼,分别置于18℃、21℃、26℃、31℃和36℃中饲养,第3 d、4 d、5 d,7 d、10 d、14 d、20 d、25 d分别收集并解剖白纹伊蚊,以间接免疫荧光法分别检测蚊虫头部、唾液腺和胸腹部的登革2型病毒抗原.结果 置于18℃、21℃、26℃、31℃和36℃饲养的白纹伊蚊分别在第25 d、7 d、5 d、4 d、3 d时胸腹部中开始检出阳性.21℃、26℃、31℃和36℃饲养的蚊虫唾液腺阳性检出的时间分别为10 d、7 d、4 d、4 d,18℃在感染后的25 d内,唾液腺均未检出阳性.结论随着温度的升高,登革2型病毒在白纹伊蚊体内外潜伏期逐渐缩短.
-
登革病毒IgM抗体快速检测试纸条检测效果的初步研究
目的 初步评价登革病毒IgM抗体免疫层析试剂条的检测效果.方法 应用4种血清型登革病毒重组外膜抗原,组装登革病毒IgM抗体通用型和分型免疫层析试纸条,检测登革病毒IgM抗体,结果与捕获法ELISA比较.同时观察分型试纸条的血清学分型效果.结果 以4型抗原混合组装的通用型试纸条检测结果与捕获法ELISA检测结果比较,二者的总体符合率为90.56%,检测结果无显著差异(P>0.05).在与其它传染病交叉反应测试中,通用型检测试剂较捕获法ELISA具有更低的交叉反应.分型结果表明,除登革I型外,其它型别试纸条均能检出非对应型别的IgM抗体.结论 利用登革病毒重组抗原组装的通用型IgM抗体免疫层析试纸条与捕获法ELISA检测效果相近,具有实际应用的潜力,但需要进一步做大样本的评估.而分型试纸条分型效果不佳,需要进一步的改进.
-
登革2型病毒包膜蛋白在毕赤酵母中的表达和病毒样颗粒的组装
目的 在组成型的毕赤酵母系统中表达登革2型病毒包膜蛋白E和前膜蛋白prM,并研究病毒样颗粒在酵母细胞中的组装特性.方法 以登革2型病毒ZS0I/01株mRNA为模板,扩增编码prM/E蛋白的基因.将目的 基因克隆至表达载体pGAPZaA的多克隆位点,并转化毕赤酵母GS115.经Zeocin抗生素筛选和PCR鉴定后获得酵母菌重组克隆,并进行表达和鉴定.结果 成功克隆登革2型病毒prM/E基因,SDS-PAGE和Western blot检测表明包膜蛋白E在组成型的毕赤酵母系统中得到高水平表达;利用透射电镜在重组酵母胞浆内检测到30-50 nm的登革2型的病毒样颗粒,并发现类似登革病毒感染的双层膜结构;免疫电镜结果证实重组病毒样颗粒可以与抗登革2型病毒血清反应,具有免疫反应性.结论 成功的建立了组成型表达登革2型病毒样颗粒的毕赤酵母系统,为登革病毒样颗粒疫苗的制备奠定了基础.
-
II型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达
目的 获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原.方法 RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1.并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1.在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1.rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白.结果 成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性.结论 II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础.
-
Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定
目的 制备并鉴定Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1(DV2-NS1)的血清型特异性单克隆抗体.方法 以具有良好抗原性的重组DV2-NS1蛋白与灭活的Ⅱ型登革病毒(DV2)混合免疫Ba1b/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法、IFA法筛选,ELISA、IFA及Western Blot对mAbs的类型及亚类、交叉实验及特异性等进行鉴定.结果 免疫的Ba1b/c小鼠经多次融合筛选,共获得14株血清型特异性抗DV2-NS1蛋白的mAbs,其亚类测定两株为IgG2b,余均为IgG1.ELISA和免疫印迹显示这些mAbs与重组DV2-NS1蛋白和DV2抗原均特异性结合,IFA结果显示这14株单抗特异结合Ⅱ型登革病毒,与其它3型登革病毒无交叉.结论 成功获得了特异性针对DV2-NS1蛋白的mAb,为进一步研究NS1蛋白的结构和功能以及研制早期诊断试剂奠定基础.
-
登革1型病毒广州分离株全长E基因序列测定与分析
目的 对两株登革1型病毒广州分离株(DV1-GZ01/03、DV1-GZ02/03)E基因进行序列测定及分析,了解此次分离的登革病毒流行株的可能来源及其生物学特性.方法 应用RT-PCR扩增两分离株E基因,克隆到pGEM-T载体进行序列测定,应用计算机软件与国内外参考株及流行株进行同源性分析,绘制系统进化树.并作毒株感染细胞及乳鼠毒力试验.结果 两分离株全长E基因为1 485 bp,与登革1型Austria/83株的同源性高,核苷酸同源性均达96.6%,氨基酸同源性分别达97.4%、97.8%;与登革1型GD23/95株次之.构建的系统进化树将19株登革1型病毒分为3个基因群.两分离株与Austria/83、GD23/95同属于基因型Ⅳ型,在同一进化分支内.两分离株颅内接种乳鼠均发病,但发病时间较晚.结论 DV1-GZ01/03、DV1GZ02/03属于基因型Ⅳ型,与广东1995年流行株关系密切.乳鼠的神经毒性较弱可能与其基因变异有关.
-
我国登革2型病毒分离株E蛋白B抗原区的表达与鉴定
目的 登革2型病毒(DEN2)E蛋白B抗原区的融合表达、纯化和抗原性初步分析.方法 将DEN2 GZ14株E蛋白B抗原区基因连接到克隆载体pGEM-T并转染E.coli DH5α,酶切后连接至表达载体pET-32a(+)并转染E.coli BL21,IPGT诱导表达,Western Blot和间接ELISA分析表达产物的抗原性.结果 含有DEN2 E蛋白B抗原区基因质粒的表达菌表达了相对分子量为31kDa的融合蛋白,Western Blot分析表明其能与小鼠多克隆抗体发生特异性反应,间接ELISA分析其与10例登革2型病毒感染者血清发生阳性反应.结论 获得的DEN2 GZ14株E蛋白B抗原区的基因表达蛋白有良好的抗原性.
-
福建省登革1型病毒基因组序列测定及进化分析
目的 对分离自福建省的1株登革1型病毒(FJ231/04)进行全基因组序列测定,并同其它病毒株全基因序列进行比较,了解其序列特征和可能的传播来源.方法 采取分段扩增、克隆、测序的方案,设计10对引物分别扩增不同的片段,基因组5'末端序列采用RACE技术进行扩增,扩增产物随后克隆到质粒载体并测序.通过末端重叠序列进行拼接后组成全长病毒基因组序列.结果 拼接后的病毒全基因组全长10 735 nt,编码一个长的开放读码框.参考已公布的登革1型病毒的全基因序列,对该病毒株进行进化分析.序列的进化分析表明,该福建省分离株属登革1型病毒中的第1群(基因1型)病毒.在遗传距离上,该毒株和2002年的泰国分离株为接近(差异为0.53%).根据病毒发现时间及其核酸差异,推测该病毒可能是通过在东南亚一带感染者或病人带入福建.结论 通过对登革病毒全基因组序列的测定可以获得毒株的特征.此外病毒序列的进化分析,还可为了解病毒可能的来源以及传播途径,正确了解登革病毒在我省的流行病学概况提供重要的线索.
-
TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测登革病毒
目的建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Dengue Virus, DV)鉴定方法.方法根据DV 3'端非编码区基因保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan MGB探针.利用1998～2004年收集的26份登革热病人临床血清标本,15例乙脑病人血清,DV 4个血清型标准毒株及23株1978～1997年DV 地方流行株和相关西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒等毒株,同时用克隆了1型DV 基因组3'端非编码区序列片段的质粒DNA作为阳性对照,检测所建立方法的特异性、敏感性.结果所建立方法的低检测限约为每反应5个基因拷贝.用该方法检测4个血清型DV 标准毒株、23株DV 地方流行株和26例分离到DV 的阳性血清标本,检出率为100 %;用该方法检测15例乙脑病人血清、10例麻疹病人血清和西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒,结果均为阴性.结论新建的TaqMan MGB探针检测DV 方法是实验室早期诊断登革热较理想的方法.
关键词： 登革病毒 Taqman MGB探针 实时聚合酶链反应 -
登革病毒感染后ECV304单层细胞通透性与微丝关系的研究
目的研究登革病毒感染后,ECV304单层细胞通透性与病毒滴度及细胞微丝骨架形态变化的关系.方法以人血管内皮细胞株 ECV304和HUVEC 为研究对象,用免疫荧光法观察登革病毒感染对微丝排列的影响;用transwell模型研究登革病毒感染后单层ECV304细胞通透性的变化;用噬斑法检测培养上清的病毒滴度.结果登革病毒感染后1 h内,ECV304细胞和HUVEC微丝骨架均发生了重新排布;感染后第3天,上清登革病毒滴度在达到峰值,同时ECV304细胞的微丝排列及通透性也有显著改变.结论登革病毒感染后所引起的微丝重排可能与ECV304单层细胞通透性的改变有着密切联系.
-
Ⅱ型登革病毒E基因的克隆及其酵母表达
目的克隆2型登革病毒E基因并用酵母真核表达,获得全长的重组E蛋白,为其结构与功能的研究提供条件.方法从感染DEN2(NGC株)后病变的C6/36细胞上清中提取RNA,通过RT-PCR扩增E基因片段,与载体pPICZαB连接筛选得到重组质粒,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P.pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut+菌诱导表达,SDS-PAGE、免疫印迹检测表达产物.结果 RT-PCR得到1.5 kb的E基因片段,酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长E基因;Mut+酵母转化菌可分泌表达约69 kDa的蛋白,与DEN2 E单抗的免疫印迹证实它为型特异的重组E蛋白.结论成功将克隆的全长DEN2 E基因在酵母菌中表达,获得的重组E蛋白具有免疫反应性.
-
登革病毒prM基因真核表达载体的构建及在白纹伊蚊细胞C6/36中的表达
目的构建登革病毒prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6/36中表达.方法将prM基因亚克隆入真核表达载体pEGFP-N3,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆进行PCR及酶切鉴定,将获得的重组质粒以脂质体法转化白纹伊蚊C6/36细胞并使其表达,利用RT-PCR法检测目的基因的转录,Western-blot检测融合蛋白的表达.结果成功构建了pEGFP-prM重组质粒,RT-PCR证明prM基因在蚊细胞内的转录,Western-blot检测到prM-GFP融合蛋白的表达.结论成功构建登革了病毒prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6/36中表达,为进一步研究细胞内免疫的分子机制及构建转基因蚊虫奠定了基础.
关键词： 登革病毒 prM基因 RT-PCR Western blot 真核表达 -
登革病毒感染患者血清IFN-γ和TNF-α的检测及意义
目的探讨登革病毒感染患者血清IFN-γ和TNF-α在登革病毒感染致病中的作用。方法应用酶联免疫吸附法(ELISA)测定广州地区30例DV-1感染患者血清IFN-γ和TNF-α的水平。实验数据采用两样本均数t检验法处理。结果30例登革病毒感染者血清IFN-γ和TNF-α水平比正常健康对照组明显增高(P＜0.05、P＜0.01）。感染病程第一天，患者血清IFN-γ水平开始升高，第二天达高峰，然后逐渐下降。患者血清TNF-α水平第2天明显升高，第3天达高峰，然后逐渐下降。结论TNF-γ和TNF-α在登革病毒的致病与免疫过程中可能起重要作用。
-
特异切割DEN-2基因的核酶基因的合成与克隆
为探索有效的登革热治疗方法,根据DEN-2基因结构的特点, 按照锤头状核酶的结构模型和作用模式,设计、合成了针对172～174GUC位点的核酶基因;其末端分别加上Sac I和 Sal I接头,定向插入质粒pGEM-3zf(+)的Sac I和Sal I位点之间;其引导序列中的Pvu II位点,提供了快速简便的核酶克隆的鉴定方法.Pvu II酶切鉴定的核酶基因克隆经序列分析, 结果与预期完全一致.证明得到了特异切割DEN-2基因的核酶基因克隆,为进一步核酶抗D EN-2的研究打下了基础.
-
白纹伊蚊经口感染、刺叮传播和经卵传递登革病毒的实验研究
为评价白纹伊蚊在我国传播登革病毒(DEN)的媒介效能和了解自然界蚊媒体内病毒的保存机制，应用C6／36细胞培养结合间接荧光抗体试验(IFA)，研究证明经口感染DEN的白纹伊蚊，不仅对DEN有较高的感染率(32.1％-32.8％)，而且通过直接叮咬敏感乳鼠，也能传播DEN。对感染♀蚊的子1和子2代♀♂成蚊分别进行全蚊匀浆病毒分离和直接叮咬乳鼠法检测，也证明白纹伊蚊能经卵传递DEN，至少可传2代以上。说明白纹伊蚊对DEN能起较大的媒介效能。且在维持DEN的自然循环中，也起重要作用。
-
蚊虫细胞表达登革病毒受体蛋白的研究进展
登革病毒(DENV)是登革热病原体,它经一个感染蚊于摄取血餐期间将病毒传播至人类.登革感染是世界范围内的一个严重公共卫生问题.一个病毒连接至一个宿主细胞是感染过程关键性第一阶段,其过程所涉及细胞蛋白鉴定与机制大部分仍然未知.本文就蚊细胞表达登革病毒的连接分子研究概况进行综述.
-
登革病毒感染动物模型研究进展
登革病毒感染可以引起登革热、登革出血热和登革休克综合征,是威胁人类生命的重大公共卫生问题.为解决这一问题,迫切需要构建出适宜的动物模型.登革病毒可以在非人灵长类动物体内相关的细胞内复制并引起免疫反应,但无明显症状.具免疫活性的小鼠感染了登革病毒后一般不会出现症状,颅内接种病毒的小鼠可出现麻痹,使用高剂量病毒感染的新小鼠模型可以发生出血的症状.某些改良的免疫缺陷小鼠感染了登革病毒后可以表现出与人类登革出血热相似的症状.人源化小鼠模型支持登革病毒的复制并且可表现出登革热的部分症状.目前的模型各有优缺点,可分别为登革病毒感染的致病机理、免疫机制以及抗病毒药物和疫苗的临床前研究服务.
-
登革热血清学诊断研究进展
登革热(dengue fever, DF)是由黄病毒属的登革病毒(dengue virus, DENV) 通过埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播引起的一种急性蚊媒传播疾病,现已成为全球性的严重公共卫生问题.目前登革病毒诊断方法主要包括病毒分离、分子生物学检测和血清学方法.其中,前者作为登革病毒诊断的金标准,不但可以检出病毒的存在,还能对病毒的型别进行鉴定,但该方法比较耗时,而且需要一定的仪器设备和专业技术人员[1];从Banditti早期报道的巢式RT-PCT检测到现在实时荧光PCR检测的应用以及核酸序列扩增技术,分子生物学检测技术在这近十几年来有了较大的发展,其敏感性、特异性和重复性都有了很大的提高,但该方法也存在较高的实验室设备和专业技术人员要求;而利用抗原或抗体检测原理的血清学实验方法,具有操作方便、试剂廉价、诊断快速等特点,较适用于现场诊断,并得到了广泛的应用.
-
登革热媒介伊蚊种群多样性研究进展
种群多样性是指在物种的分布区域内,存在2个以上不同的种群,且在同一个种群内也存在2种以上不同遗传类型的个体[1].登革热是由登革病毒引起的急性虫媒传染病,主要是由埃及伊蚊和白纹伊蚊引起的[2].传播登革热的虫媒存在着种群遗传多态性.研究登革热虫媒的遗传多态性现象,主要包括染色体多态、蛋白质多态、基因多态等三方面的研究,可从蚊虫的群体水平看出遗传结构的变化规律,不同区域蚊种差异,登革病毒易感性的差异,从而对蚊虫的分类和防治有重要意义[3].目前用于研究蚊虫种群多样性技术或标志主要有同工酶分析技术、微卫星标志、线粒体基因分析、RAPD、PCR-SSCP和AFLP技术等.本文结合不同分子技术或标志的运用,对登革热媒介伊蚊种群多样性研究进展进行综述.
