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腺相关病毒介导的人红细胞生成素体外表达
目的:研究腺相关病毒载体介导的人红细胞生成素在293细胞的体外表达.方法:将人红细胞生成素cDNA克隆至AAV表达载体,采用无辅助病毒共转染法生产重组AAV-EPO病毒,利用RT-PCR和ELISA法检测hEpo的体外表达.结果:成功构建和生产了表达hEpo的重组AAV-EPO病毒.重组AAV-EPO病毒感染293细胞后,RT-PCR结果显示有hEpo基因表达,细胞上清中hEpo的表达水平达500U/L.结论:所制备的重组AAV-EPO病毒可以有效表达hEpo,可以进一步用于动物体内实验.
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双拷贝截短型人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的构建、表达和鉴定
目的：增加重组截短型胰岛素样生长因子Ⅰ[des(1-3)IGF-Ⅰ]的表达产量，初步纯化表达产物后并与标准IGF-Ⅰ比较其生物活性.方法：将第二个des(1-3)IGF-Ⅰ基因插入先前构建好的pExSecl/IGF-Ⅰ表达质粒中，形成pExSecl/2(IGF-Ⅰ)的表达质粒.将质粒转化入蛋白酶缺陷的大肠杆菌BL21(DE3)中，培养工程菌并用IPTG于12℃低温诱导des(1-3)IGF-表达.超滤膜过滤和Sephadex G-50凝胶过滤纯化表达产物.用MTF法测定纯化的IGF-Ⅰ的生物活性，并与标准IGF-Ⅰ比较.结果：双拷贝IGF-Ⅰ的表达量达可溶性菌体蛋白的20％，高于单拷贝IGF-Ⅰ的表达产量(12％)；超滤和凝胶过滤后des(1-3)IGF-Ⅰ纯度分别达49％和82％；经凝胶过滤后的IGF-Ⅰ相对生物活性达标准IGF-Ⅰ的77％.结论：pExSecl/2(IGF-Ⅰ)可增加IGF-Ⅰ表达产量约8％；纯化后的des(1-3)IGF-Ⅰ生物活性为标准IGF-Ⅰ的77％.
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过量表达γ-氨基丁酸转运蛋白亚型Ⅰ导致转基因小鼠认知衰退1
目的：研究γ-氨基丁酸转运蛋白亚型Ⅰ(GAT1)在认知中的生理功能.方法：原核显微注射法产生转基因小鼠.Southern-blot和PCR鉴定转基因的整合；半定量RT-PCR分析GAT1 mRNA水平；免疫荧光和免疫组化检测GAT1蛋白质表达.条件性回避行为分析联合型学习能力；新异物体识别行为分析记忆存储能力.电镜检查突触体形态.结果：获得4只含不同拷贝数转基因的建立者小鼠.GAT1在mRNA和蛋白质水平都呈过量表达.与野生型小鼠相比，转基因鼠联合型学习能力显著下降，视觉记忆显著减弱.另外，转基因鼠不对称突触数量减少约24％.结论：在小鼠中过量表达GAT1可导致认知衰退，表明γ-氨基丁酸转运蛋白表达的改变与某些类型认知缺陷的病理机制有关.
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造血干/祖细胞遗传学修饰对4-氢过氧化环磷酰胺、长春新碱和柔红霉素的联合抗性
目的：探讨经醛脱氢酶基因(ALDH-3)和多药耐药基因(MDRl)遗传学修饰的人外周血造血干/祖细胞能否同时增强活性环磷酰胺(4-HC)和MDRl基因靶药的抗性.方法：构建同时含ALDH-3和MDRl双耐药基因的逆转录病毒表达质粒G1Na-ALDH3-IRES-MDRl，经电穿孔导入PA317包装细胞，将免疫磁珠分离系统(MACS)分离纯化后的人外周血CD34+细胞用含有ALDH-3和MDRl双耐药基因重组病毒的上清感染，用PCR、RT-PCR、Southem blot、Northem blot、ACS和MTT等方法检测外源ALDH-3与MDRl基因在CD34+细胞中的转移和表达.结果：用PCR与酶切分析法鉴定了双顺反子逆转录病毒载体构建的正确性，双耐药基因已整合入转染靶细胞中基因组，并获得有效表达，应用集落计数测定基因转导效率为18％.巢式PCR及补救分析均未检测到辅助病毒存在.经双耐药基因修饰的CD34+造血干/祖细胞对4-HC的IC50较对照组提高4.5倍，对多药耐药基因靶药(长春新碱和柔红霉素)的IC50较未转染细胞分别高6.6和7.8倍.结论：逆转录病毒载体介导双耐药基因转导外周血造血干/祖细胞高效共表达可降低联合化疗骨髓毒性.
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腺病毒载体介导的人分泌型α(1，2)岩藻糖基转移酶的表达降低Galα(1，3)Gal抗原表位水平
目的：检测人分泌型α(1，2)岩藻糖基转移酶降低Galα(1，3)Gal表位(gal表位)水平.方法：以人腺病毒载体表达人分泌型α(1，2)岩藻糖基转移酶.流式细胞术比较H血型抗原和gal表位的表达水平.MTT法分析小鼠NIH3T3细胞对人天然抗体和补体介导的细胞裂解作用的敏感性.结果：设计并构建了表达人分泌型α(1，2)岩藻糖基转移酶基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5hSeFT.流式细胞分析结果表明，NIH3T3细胞及Ad5null和Ad5hSeFT感染后的NIH3T3细胞，UEA-I凝集素结合细胞的平均荧光强度(MFI)分别为2.3±0.6，2.1±1.0和36.5±5.9；GS-IB4凝集素结合细胞的MFI值分别为167±23，170±19和100±14；人天然IgG和IgM抗体结合细胞的MFI值分别为31±3，32±4和22±4.结论：NIH3T3细胞被Ad5hSeFT感染后在细胞表面表达了H血型抗原，导致细胞表面gal表位的表达下降了40％，并且这种下降增强了细胞对正常人血清裂解作用的抵抗力.
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丹酚酸A对培养的大鼠肝星状细胞增殖与胶原生成的作用
目的：研究丹酚酸A对培养的大鼠肝星状细胞增殖与胶原生成的影响．方法：用链酶蛋白酶与胶原酶对肝脏进行原位灌流消化，Nycodenz密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞，传一代培养．MTT法与[3H]TdR掺人法测定细胞增殖．丽春红染色、图象分析法半定量细胞胶原沉积量，ELISA法测定细胞培养上清中I型胶原分泌量，检测细胞层总蛋白量校正细胞数．RT-PCR法分析前胶原α2(I)基因的表达．结果：丹酚酸A 100 μmol／L引起部分细胞脱壁与死亡，有一定毒性反应．丹酚酸A0．1一10 μmol／L对细胞形态无明显影响．丹酚酸A l一100 μmol／L浓度依赖性抑制细胞增殖，降低胶原沉积量与I型胶原分泌量．丹酚酸A 1-10 μmol／L对前胶原α2(I)mRNA表达均有明显抑制作用．结论：丹酚酸A抑制肝星状细胞增殖与胶原表达，是丹参抗肝纤维化的主要有效成分之一，抑制肝星状细胞活化是其抗肝纤维化的主要作用机制．
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以腺病毒为载体表达猪α(1，3)半乳糖基转移酶反义RNA抑制Galα(1，3)Gal抗原表位的表达
目的：尝试以反义RNA的方法抑制Galα(1，3)Gal抗原表位(gal抗原)的表达.方法：以人腺病毒载体表达猪α(1，3)半乳糖基转移酶基因的反义RNA.流式细胞术比较H血型抗原和gal抗原的表达水平.结果：构建了表达反义RNA的重组腺病毒载体Ad5anti-sGT600和Adanti-sGTll00.反义RNA的表达使NIH3T3细胞表面的gal抗原表位下降约30％.另外，反义RNA与人分泌型α(1，2)岩藻糖基转移酶的共同作用可使gal抗原表位的水平进一步下降.结论：重组腺病毒Adanti-sGT600和Ad5anti-sGTll00可有效降低gal抗原表位的表达.
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人参皂苷对慢性炎症型老年大鼠海马IL-1β和IL-6mRNA表达的影响
目的：研究人参皂苷对大鼠海马IL-1β和IL-6 mRNA增龄性变化的影响，为进一步阐明人参皂苷的药理作用及应用于某些神经退行性疾病提供依据.方法：应用腹腔注入脂多糖造成慢性炎症刺激的老年大鼠模型，并以青年和成年大鼠为对照.用半定量反转录－聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定海马IL-1β和IL-6 mRNA含量.结果：大鼠海马IL-1β和IL-6 mRNA含量：青年组(3月龄)无表达；成年组(9月龄)分别为1.54±0.21和1.63±0.21；老年组(24月龄)分别为1.98±0.21和1.91±0.11；人参皂苷10mg/kg组分别为1.61±0.20和1.62±0.22；人参皂苷20mg/kg组分别为1.59±0.21和1.60±O.21；人参皂苷40mg/kg组分别为1.66±0.23和1.64±0.21.老年组和成年组相比较，P<0.01或P<0.05；人参皂苷不同剂量组和老年组相比较，P<0.05或P<0.01.结论：大鼠海马IL-1β和IL-6mRNA的表达水平随增龄而升高.人参皂苷能有效地抑制这一表达.
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左旋千金藤立定诱导6-羟基多巴胺损毁大鼠的纹状体Fos、前脑啡肽mRNA、前强啡肽mRNA表达与旋转行为的关系
目的：研究左旋千金藤立定(SPD)调节6-羟基多巴胺(6-OHDA)损毁大鼠纹状体的Fos、前脑腓肽(PENK)和前强啡肽(PDYN)mRNA表达水平与旋转行为的关系.方法：用免疫细胞化学法观察Fos表达，用地高辛非同位素法标记的寡核苷酸探针检测纹状体PENK和PDYN mRNA，进行图像处理作半定量分析.结果：(1)SPD给予1，3，7 d后，损毁大鼠旋转行为仍维持在高水平；(2)SPD诱导双侧纹状体Fos显著表达，尤以损侧为甚.SPD重复应用使双侧纹状体的Fos诱导表达下降，尤以健侧为显著；(3)与健侧相比，损毁侧纹状体的PENK mRNA表达水平增加非常显著.SPD重复应用7 d，使这种增加的PENK mRNA水平明显下降.同时，SPD也使健侧PENK mRNA水平降低.然而，6-OHDA损毁和SPD处理对双侧纹状体的PDYN mRNA水平无明显影响.结论：SPD激发6-OHDA损毁大鼠旋转行为维持在高水平，与损侧纹状体的Fos表达和PENKmRNA水平下降是同步的.但是，6-OHDA损毁和SPD均未显示出对PDYN mRNA表达的影响.
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甲硫氨酸脑啡肽增强TNF-α产生,NK细胞活性和IL-12p35 mRNA的表达
研究甲硫氨酸脑啡肽对机体免疫监督功能的影响.方法:测定met-enk对NK活性,抗癌细胞因子如:TNF-α和IL-12的产生和基因表达的影响.结果:Met-enk(1×10-8-1×10-5mol·L-1)能增强NK细胞活性.体外,体内均能刺激TNF-α的产生.ip 0.1及1 mg·kg-1×6 d可增强IL-12 p35 mRNA的表达.结论:Met-enk上调抗癌细胞因子及NK活性,在癌症监督中起一定的作用.
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AVE3085对ADMA损伤人冠状动脉内皮细胞保护作用
目的 探讨AVE3085对非对称二甲基精氨酸(ADMA)损伤的人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)的保护作用.方法 将原代培养的HCAEC分为对照组、ADMA组、ADMA+ AVE3085组、ADMA+二甲基亚砜(DMSO)组4个组,在含相应药物的培养基中培养24 h后,应用逆转录-聚合酶链反应技术检测细胞中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的表达;应用Western-blot方法检测细胞中eNOS和磷酸化eNOS(p-eNOSser1177)的表达量;应用荧光探针检测细胞中NO的释放量和活性氧(ROS)的生成量;应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 与对照组比较,ADMA组细胞中eNOS表达量下降,NO释放量降低,ROS生成增加,凋亡细胞的数量显著增加,差异均有显著性(F=361.55～1 041.17,q=23.55～80.50,P＜0.01).与ADMA组相比,ADMA+ AVE3085组细胞中eNOS的表达显著增高,NO释放增加,ROS的生成下降,凋亡细胞的数量显著减少,差异均有显著性(q=21.91～36.83,P＜0.01).结论 ADMA对HCAEC有损伤作用.AVE3085通过上调eNOS基因的表达、促进细胞NO释放、抑制细胞ROS的产生和细胞凋亡对HCAEC起到保护作用.
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阿尔茨海默病病人外周血单核细胞CD14的表达
目的 探讨阿尔茨海默病(AD)病人外周血单核细胞(PBMC) CD14的表达及其意义.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法、流式细胞术分别检测63例AD病人(AD组)和64例健康查体者(对照组)PBMC中CD14 mRNA及蛋白表达水平.结果 AD组PBMC中CD14阳性细胞率为(68.08±10.59)％,明显高于对照组的(39.91±10.36)％(t=4.868,P＜0.01).AD组PBMC中CD14 mRNA表达水平(0.392±0.214)高于对照组(0.284±0.172),差异有统计学意义(t=5.991,P＜0.01).AD组病人CD14阳性细胞率与简易智力状况检查法(MMSE)评分呈负相关(r=-0.35,P＜0.01).结论 CD14是AD的风险因子,PBMC中CD14阳性细胞率和CD14 mRNA表达可显著影响AD病人的智力状况.
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EB病毒编码基因BARF1对鼻咽癌细胞增殖和迁移影响
目的 探讨EB病毒(EBV)编码基因BARF1对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响.方法 构建BARF1基因慢病毒表达载体,转染EBV阴性鼻咽癌细胞系CNE,杀稻瘟菌素筛选稳定感染细胞克隆,RT-PCR鉴定目的基因表达.以不含目的基因的慢病毒感染细胞为对照,进行MTT细胞增殖实验、细胞周期检测和细胞迁移实验.结果 与对照组比较,转染BARF1基因的细胞增殖能力和增殖指数无明显变化(P＞0.05),但是迁移能力显著增强(t=9.71,P＜0.05).结论 EBV BARF1基因可通过增强鼻咽癌细胞迁移能力而增强其肿瘤原性.
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EBVaGC肿瘤差异表达的基因表达谱芯片筛选
目的 应用全基因组表达谱芯片技术,分析EB病毒(EBV)阳性胃癌细胞系与EBV阴性胃癌细胞系基因表达谱差异,筛选EBV相关胃癌(EBVaGC)相关基因.方法 采用TRIzol一步法提取3种EBV阳性胃癌细胞系(GT38、PT、SNU-719)和3种EBV阴性胃癌细胞系(SGC7901、HGC-27、MKN-45)总RNA并纯化,逆转录合成cDNA,利用荧光染料(Cy3)标记aaUTP,转录合成标记的cRNA,与Agilent人类全基因组表达谱芯片杂交,扫描荧光信号图像,对芯片原始数据扣除本底和归一化处理,利用倍数差异和t检验计算筛选差异表达的基因,采用上海博豪生物在线分析系统进行基因的功能注释和关联分析,明确差异基因的生物学功能.将处理前后差异表达倍数＞2.0或＜0.5,且在不同样本间的具有统计学差异的基因判断为差异表达基因.选取特定的差异表达基因,应用实时荧光PCR技术验证芯片结果的可靠性.结果 聚类热图及矩阵图分析显示,EBV阳性胃癌细胞系与阴性胃癌细胞系之间表达谱存在明显差异.EBV阳性胃癌细胞系与阴性胃癌细胞系之间有322条基因的表达有明显差异,其中与肿瘤相关的基因涉及转录翻译、信号转导、黏附、细胞增殖和凋亡以及免疫应答等多种生物学过程.选取6条差异基因进行验证,结果有3条基因表达上调,3条基因表达下调,表达趋势与芯片结果一致.结论 EBV阳性胃癌细胞系与阴性胃癌细胞系基因表达存在明显差异,提示EBV感染可影响胃癌细胞相关基因的表达,分析这些差异表达基因有助于阐明EBV感染在EBVaGC发生发展中的作用机制,为进一步筛选EBVaGC特异性肿瘤标记物以及进行生物治疗提供理论依据.
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人Ndfip1基因在转染MES23.5细胞中的表达
目的 应用携带人Ndfip1(Nedd4 family interacting protein 1)基因的质粒pCMV6-XL5-Ndfip1转染MES 23.5多巴胺能神经细胞,检测其在细胞中的表达.方法 应用Lipofectamine法转染MES 23.5细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MES 23.5细胞中Ndfip1 mRNA的表达.结果 该表达载体转染MES23,5细胞后,细胞内Ndfip1 mRNA的表达水平明显增加(t=-8.295,P＜0.01).结论 Ndfip1基因可在MES23.5细胞内表达,从而为进一步研究Ndfip1在神经元保护中的作用奠定了基础.
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沙蚕激酶全基因在大肠杆菌中表达及溶栓作用检测
目的 使沙蚕激酶全基因在大肠杆菌中高效表达获得沙蚕激酶,并检测其溶栓活性.方法 通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切将沙蚕激酶全基因克隆进载体pGEX4T-2,诱导表达后SDS-PAGE证实该基因正常表达.构建大鼠颈动-静脉旁路血栓模型,进行目的 蛋白溶栓作用检测.结果 沙蚕激酶使血栓湿质量减小,优球蛋白溶解时间(ELT)缩短(F=19.112、20.390,P<0.05),但对纤维蛋白原(FIB)影响不明显(F=1.333,P>0.05).结论 沙蚕激酶基因表达的目的 蛋白有抑制血栓形成、激活纤溶活性的作用.
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p185、p53、bcl-2和nm23H1蛋白在胆管癌组织的表达及其意义
目的 探讨p185、p53、bcl-2和nm23H1蛋白在胆管癌组织表达的表达及临床意义.方法 应用免疫组化方法检测46例胆管癌和10例正常胆管组织中p185、p53、bcl-2及nm23H1蛋白表达,并结合临床病理特征进行分析.结果 胆管癌中p185及p53阳性表达率均显著高于正常胆管组织(χ2=8.50、5.30,P<0.05),而bcl-2及nm23H1阳性表达率显著低于正常胆管组织(χ2=5.91、4.08,P<0.05).p185、p53高表达和bcl-2、nm23H1低表达与胆管癌的分化程度、TNM分期和转移相关(χ2=4.00～6.88,P<0.05).结论 p185、p53、bcl-2和nm23H1蛋白可作为评估胆管癌生物学行为和预后的参考指标.
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慢性粒细胞白血病smac和survivin基因表达及意义
目的 检测慢性粒细胞白血病(CML)病人smac和survivin mRNA的表达情况,以探讨其在CML病情进展及预后中的意义.方法 应用半定量RT-PCR技术检测71例CML病人和10名健康者上述基因的表达.结果 smac和survivin mRNA在CML病人的阳性表达率分别为90.1%、63.4%,均明显高于正常对照组(χ2=22.176、6.773,P＜0.01、0.05),二者在CML的加速期、急变期的表达水平明显高于慢性期(t=10.708～16.725,P＜0.01),且二者在CML病人的表达水平呈正相关(r=0.833,P＜0.01).结论 smac和survivin基因与CML的病情进展密切相关,是监测CML病情进展及判断预后的有价值的分子标记物.
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大肠杆菌表达人IL-21融合蛋白的纯化和抗原性分析
目的 在大肠杆菌中表达人IL-21编码基因,并进行蛋白纯化和抗原性分析.方法 以经PHA刺激的人扁桃体细胞cDNA 文库为模板,经PCR获得IL-21全基因片段.测序确认后,分别设计含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,经PCR获得IL-21成熟肽的编码基因.将此IL-21基因插入表达载体pGEX-4T-2,重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α,进行IPTG诱导表达.经琼脂糖珠结合的纯化方法所得产物用Western Blotting作抗原性分析.结果 SDS-PAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α表达与理论相符的条带,并获得了与理论值相符的纯化条带,在进一步的Western Blotting分析中发现表达的蛋白能与IL-2的单抗产生结合反应.结论 人IL-21编码基因克隆载体在大肠杆菌中成功表达,同时建立了该蛋白的琼脂糖珠纯化方法,通过免疫印迹实验揭示了原核表达的IL-21蛋白与IL-2之间结构的相似性.
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卵巢癌组织中uPA与PAI-1 mRNA表达及意义
目的 探讨尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)mRNA在卵巢癌组织中的表达及其临床意义.方法 采用逆转录-聚合酶链反应技术,检测38例卵巢癌、21例卵巢良性上皮性肿瘤及17例正常卵巢组织中uPA及PAI-1 mRNA的表达,并分析其与病理分化程度的相关性.结果 uPA 及PAI-1 mRNA在卵巢癌中的表达水平均较卵巢良性上皮性肿瘤、正常卵巢组织显著升高(F=184.51、51.00,q=11.34～26.69, P＜0.05).在不同分化程度的卵巢癌组织中uPA 及PAI-1 mRNA的表达量随肿瘤分化程度的降低而增加(F=110.62、38.43,q=3.10～6.86,P＜0.05).结论 卵巢癌组织中uPA及PAI-1 mRNA呈高表达,且与卵巢癌的病理分化程度相关.
