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042 小鼠胚胎干细胞在遗传和发育毒理学中的应用
小鼠胚胎干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和胚胎癌细胞3种类型,是唯一可以同时研究致突变物对未分化胚胎细胞和分化体细胞致突变性的细胞株,其对致突变物的敏感性因检测终点的不同而有所不同.在胚胎毒性检测方面,由于胚胎干细胞可以同时检测化学物对细胞增殖和分化的影响,从而大大提高了体外替代实验的预测符合率,有望成为化学物致畸试验的体外替代实验模型.同时,转基因技术的广泛应用和人源胚胎干细胞的建系将更有助于提高化学物胚胎毒性和致畸性体外预测符合率,但同时也存在较大的伦理学争议.
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T-2毒素对小鼠胚胎干细胞的氧化损伤作用
目的 应用小鼠胚胎干细胞(mESC)作为模型探讨T-2毒素对mESC的作用靶点与作用机制.方法 选用0.5 ng/ml T-2毒素处理分化过程中的mESC 24、72和120 h,流式细胞术检测mESC的活性氧簇(ROS)的生成,比色法检测mESC的抗氧化防御酶活性,包括超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活力变化,以及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量.结果 0.5 ng/ml T-2毒素作用72与120 h,mESC中ROS大量蓄积,抗氧化防御酶(SOD、GPZ)活力下降,MDA增加,其效应呈现时间依赖关系.自由基清除剂(Trolox,200 μmol/L)预处理可以降低T-2毒素对mESC抗氧化防御酶活力的抑制作用,减轻T-2毒素引起的mESC中ROS的蓄积以及MDA的增加.结论 低剂量T-2毒素染毒引起mESC的氧化损伤是其发育毒性的重要机制之一.
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胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展
近年来,不断有研究证明人胚胎干细胞(hESC)的多能性,以及小鼠胚胎干细胞(mESC)能够分化为早期配子并形成囊胚样结构[1,2].2003年5月,Hubner等[1]研究发现,小鼠胚胎干细胞在体外可分化为卵母细胞.Nayernia等[3]研究发现,mESC可于体外分化为未成熟的精子,并且成功获得了存活的后代.这些研究对发展新的生殖工程学提供了开创性思路,研究胚胎干细胞向生殖细胞的分化将为人类生殖细胞的发育机制带来新认识,并为不孕不育症的治疗提供一种崭新的思路和方法.
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资冲颗粒大鼠含药血清诱导小鼠胚胎干细胞向生殖细胞分化相关基因的表达
目的:研究资冲颗粒含药血清诱导小鼠胚胎干细胞(mESC)生殖分化相关基因的表达.方法:以终浓度5％资冲颗粒含药血清干预mESC,以5％人卵泡液及小鼠卵巢组织共培养作为对照.培养21d后利用实时荧光定量PCR测定干预后细胞内基因Oct4、Stra8、Tp2、Zp3、Itgb1、Gdf9的表达.结果:与mESC未干预状态相比较,3组干预后生殖分化相关基因表达均有明显变化;同人卵泡液组比较,含药血清组细胞内基因Tp2、Gdf9表达量显著上调(P=0.00、P=0.04);同卵巢组织组比较,含药血清组多数基因上调幅度较大,但两组间无统计学意义.结论:3种诱导方法均促使了mESC向生殖细胞方向分化;资冲颗粒含药血清或能加速mESC向生殖细胞方向定向分化的进程.
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左归丸、右归丸复方及相关成分对小鼠胚胎干细胞1B10向生殖细胞方向分化的影响
目的:探索左归丸、右归丸及其相关成分对干细胞向生殖细胞分化的影响.方法:制备左归丸、右归丸、左归丸和右归丸共有成分的大鼠含药血清,以此作为实验药物;以小鼠胚胎干细胞1B10(MESC-1B10)为干细胞代表;然后以上述大鼠含药血清干预MESC-1 B10,干预过程中进行显微照像追踪,干预72 h后,提取相关被干预细胞的RNA,立即合成cDNA,后利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测各干预细胞的10种与生殖分化相关基因的表达模式.结果:左归丸大鼠含药血清(ZGW-RS)显著上调了Oct-4和SCP3,显著下调了GDF-9和Stra8;右归丸大鼠含药血清(YGW-RS)显著上调了Oct-4,GDF-9,Mvh和SCP3,显著下调了Stra8,Itga6和Itgb1;左归丸和右归丸共有成分的大鼠含药血清(ZGWYGW-RS)显著上调了Oct-4,SCP3和ZP3,显著下调了GDF-9,Stra8,Itga6和Itgb1.结论:ZGW-RS能启动MESC-1B10向减数分裂方向变化,但是尚不足以推动1B10向生殖细胞分化;YGW-RS能启动MESC-1B10向减数分裂方向变化,同时推动1B10向雌性生殖细胞分化;ZGWYGW-RS能启动MESC-1B10向减数分裂方向变化,同时能轻微推动MESC-1 B10向雌性生殖细胞分化,但是作用弱于YGW-RS.实验结果一方面增强了对左归丸和右归丸及其相关成分影响干细胞生殖分化的认识,另一方面有助于解释左归丸和右归丸治疗不孕不育症的机制.
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miR-196a-5p抑制小鼠胚胎干细胞的自我更新
目的 研究miR-196a-5p在小鼠胚胎干细胞(mESC)自我更新中的功能.方法 定量PCR法确定miR-196a-5p在mESC早期分化过程中的表达.在胚胎干细胞中过表达miR-196a-5p类似物,通过集落形成实验、细胞周期分析、碱性磷酸酶染色和Oct4染色确定miR-196a-5p过表达对mESC自我更新及增殖的影响.结果 miR-196a-5p在mESC早期分化过程中表达上升(P＜0.05),在mESC中过表达miR-196a-5p类似物后,ESC的集落形成及增殖能力被明显抑制(P＜0.01),碱性磷酸酶活性下降,Oct4蛋白水平也出现明显下降.结论 miR-196a-5p具有抑制mESC自我更新的能力,在mESC早期分化过程中可能发挥重要作用.
关键词： miR-196a-5p 小鼠胚胎干细胞 自我更新 -
小鼠胚胎干细胞的体外培养及诱导分化成酪氨酸羟化酶阳性神经元
探索小鼠胚胎干细胞(ES)在体外培养及向酪氨酸羟化酶阳性神经元诱导分化的可能性.将小鼠胚胎干细胞在含有白血病抑制因子(LIF)的ES培养基中扩增,并通过以下几个步骤:胚胎体的形成、巢蛋白(Nestin)阳性细胞的筛选、Nestin阳性细胞的体外扩增及撤除碱性成纤维细胞生长因子等后观察向酪氨酸羟化酶阳性神经元的分化.结果表明小鼠胚胎干细胞在含有LIF的特定培养基中能够稳定传代并保持不分化状态,经过无血清培养基的筛选和培养,在Sonic Hedgehog(SHH) 及成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor 8,FGF8)等细胞因子的作用下能定向分化成酪氨酸羟化酶阳性神经元.这种方法有望为帕金森病等神经变性病的细胞移植治疗提供充足的细胞来源.
关键词： 小鼠胚胎干细胞 酪氨酸羟化酶阳性神经元 诱导分化 -
小鼠胚胎干细胞与复合丝素膜的生物相容性研究
探索胚胎干细胞与丝素材料结合的可行性及生物相容性,建立一套在丝素膜上小鼠胚胎干细胞的体外培养体系.通过形态观察、MTT比色法、克隆形成率分析、碱性磷酸酶检测、免疫荧光染色、核型分析等方法,研究丝素膜对小鼠胚胎干细胞的黏附、生长情况、未分化状态的维持、胚胎干细胞特性、遗传、分化等方面的影响.结果显示,两者之间具有良好的生物相容性,丝素膜材料支持小鼠胚胎干细胞的体外无限扩增和未分化特征,并保持其正常核型.证实丝素材料可作为胚胎干细胞结合的良好生物材料.
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细胞重编程及其在再生医学中的应用前景——写在2012年诺贝尔生理学或医学奖颁布之际
2012年10月8日,英国发育生物学家约翰·格登爵士(John B.Gurdon)和日本生物医学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)因"发现成熟细胞可以被重编程(reprogrammed)为多能性(pluripotency)"而获奖,这次获奖是在短短五年时间内干细胞领域的第二次获奖,上一次获奖是在2007年,马丁·埃文斯因1981年成功分离出小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)而与另外两名从事"基因打靶"(gene targeting)的科学家马里奥·卡佩基、奥利弗·史密斯共享诺贝尔生理学或医学奖.
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胚胎干细胞诱生的胰岛素分泌细胞分泌胰岛素的研究
目的:研究小鼠胚胎干细胞ES-D3诱生的胰岛素分泌细胞(IPCs)分泌胰岛素的能力及其所分泌的胰岛素的活性.方法:将ES-D3细胞培养于经处理的鼠胚成纤维细胞滋养层上保持未分化状态扩增,对数生长期时转入无血清含bFGF的DMEM液进行诱导,隔天换液,21 d后,采用DTZ染色、免疫细胞化学染色和ELISA等方法检测胰岛素的生成与分泌情况;用RT-PCR法检测PDX-1、Insulinl、Insulin2和Glut2等胰岛素分泌细胞相关基因mRNA的表达,并通过动物实验研究生成的IPCs所分泌的胰岛素的降糖活性.结果:在诱导21 d,DTZ染色法观察到被DTZ染成洋红色的IPCs;免疫细胞化学染色法显示诱导体系中有胰岛素特异性免疫反应阳性的细胞群;ELISA法测定结果表明IPCs受高糖刺激后分泌胰岛素,动物实验证明所分泌的胰岛素具有降糖活性;RT-PCR法检测到有Insulin2和PDX-1 mRNA的表达,Insulinl呈弱表达,Glut2不表达.结论:小鼠胚胎干细胞ES-D3诱生的IPCs能够合成并分泌胰岛素,而且分泌的胰岛素具有降糖活性.
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维生素C促进小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究
目的:利用经典的悬滴培养法形成拟胚体(EBs),诱导小鼠胚胎干细胞(mESCs)在体外分化为心肌细胞,观察维生素C作为诱导剂对mESCs体外诱导分化为心肌细胞的影响,进而寻找一种高效、安全的诱导方法.方法:复苏mESCs,传代培养后,利用悬滴法使mESCs形成拟胚体,用含0.1mg/mL维生素C的分化培养基对其进行诱导分化,以不添加任何诱导剂作为对照组,观察出现搏动拟胚体的时间,搏动拟胚体的数量,计算分化比率,统计搏动频率,并进行免疫荧光染色测定心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达.结果:小鼠胚胎干细胞可自发分化为心肌细胞,但效率较低,0.1mg/mL的维生素C能明显提高mESCs分化为心肌细胞的效率,约83.3％的EBs出现搏动,显著高于未添加任何诱导剂组,搏动频率为(81.2±7.8)次/分钟.两组搏动心肌细胞cTnT免疫染色阳性.结论:维生素C能够显著提高mESCs向心肌细胞分化效率,应用维生素C体外诱导mESCs向心肌细胞分化是一种较为理想的体外诱导方式.
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高浓度青-链霉素诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化
目的 研究青-链霉素(双抗)对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)向心肌细胞分化的影响.方法 采用常规悬滴法培养mESC形成拟胚体(embryonic body,EB),在分化培养基中加入不同浓度的双抗(1.0％、5.0％和10.0％)培养贴壁的EB,选择不同的时间点分化的细胞通过流式细胞术(FCM)、细胞免疫荧光、western blotting等分析心肌特异性蛋白表达水平的差异.结果 小鼠多能干细胞表面标志物SSEA-1表达呈阳性(绿色),H.E染色显示核质比＞＞1.正常自分化细胞免疫荧光显示cTnT、MLC2阳性(绿色),肌节清晰可见.高浓度双抗组,cTnT+阳性细胞率高于对照组和低浓度(1.0％)双抗组,western blotting显示其心肌特异性蛋白cTnT、cTnI、MLC2、connexin43等表达增加(p＜0.05).结论 高浓度双抗促进mESCs向心肌细胞分化,且有浓度依赖性.
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CREG促进小鼠胚胎干细胞向血管平滑肌细胞分化及成熟
目的：深入探讨小鼠胚胎干细胞（ESC）在定向诱导剂作用下向血管平滑肌细胞（VSMC）分化过程中CREG的作用，为VSMC相关的血管性疾病的防治提供理论依据；综合评价CREG基因修饰的ESCs定向分化为VSMC后的生物学效能，为未来组织工程血管的构建提供新的手段；CREG调节VSMC分化及功能成熟的分子机制研究。
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一种简单诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的方法
目的：小鼠胚胎干细胞（mESCs）具有多向分化潜能，包括向心肌细胞分化，被广泛应用于心脏再生、细胞治疗与免疫治疗中。目前，mESCs向心肌细胞分化的诱导剂主要有DMSO，5-aza，RA，ICA，vitaminC以及中药丹参等。据报导，一定浓度的青链霉素（双抗）对mESCs的有丝分裂具有一定的抑制作用。然而，双抗诱导mESCs向心肌细胞分化却未见报导。我们的研究旨在探讨双抗诱导mESCs向心肌细胞分化作用。
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EGF对原始生殖细胞来源小鼠胚胎干细胞分离克隆的影响
目的 观察表皮生长因子对原始生殖细胞来源的小鼠胚胎干细胞分离克隆的影响.方法 以小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层,从原始生殖细胞中分离克隆小鼠胚胎干细胞的过程中,在基础细胞培养液中加入不同浓度的表皮生长因子,观察小鼠胚胎干细胞集落形成数和各组的高传代数.结果 表皮生长因子添加与否对原始生殖细胞来源的小鼠胚胎干细胞原代培养无显著的影响,而对后继培养有显著影响.结论 在原始生殖细胞来源的小鼠胚胎干细胞分离的过程中,可以不添加表皮生长因子,而在胚胎干细胞的后续传代中,尤其对于较高代细胞的克隆过程中添加表皮生长因子有利于细胞的生长.
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利用CRISPR-Cas9系统建立Prmt1敲除的小鼠胚胎干细胞系
目的 利用CRISPR-Cas9系统构建Prmt1敲除的E14小鼠胚胎干细胞系,并分析验证其敲除效果.方法 利用第3代基因编辑技术CRISPR-Cas9系统,针对Prmt1第4、5、6、7外显子设计4条gRNAs,gRNA两两组合转染E14细胞,特异性的敲除E14细胞中的Prmt1,并在蛋白质水平,mRNA水平和基因组水平分别验证敲除效果.结果 与对照组相比,两组敲除实验组都检测不到Prmt1蛋白质和mRNA的表达,基因组测序结果分析显示,两实验组中Prmt1的mRNA均出现无义突变,使其mRNA的翻译异常终止.同时,实时定量PCR结果显示,精氨酸甲基转移酶家族其他成员Prmt2,Carm1和Prmt6 mRNA表达不受影响.结论 成功获得特异性敲除Prmt1的E14细胞系,为研究Prmt1在胚胎干细胞中的作用提供了重要工具.
关键词： CRISPR-Cas9 PRMT1 小鼠胚胎干细胞 -
造血和血管共同的祖细胞--血液血管干细胞
自从1998年第一次从内细胞团分离到人的胚胎干细胞,基于早期的小鼠胚胎干细胞可以分化为几乎所有三个胚层的细胞的研究,胚胎干细胞的全能性使人们很快认识到胚胎干细胞在再生医学中的潜在应用价值.人们相信干细胞的研究将带来临床治疗各种疾病的革命,如心血管疾病、神经退行性疾病,糖尿病及癌症等.
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小鼠胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞的实验研究
1981年,英国Evans等[1]首先报道了由小鼠囊胚内细胞群经体外培养而成功获得胚胎性干细胞(embryonic stem cells,ES).同年,美国Martine[2]建立了小鼠ES细胞系,由于ES细胞具有分化的全能性,在体外培养过程中加入合适的诱导分化剂可以诱导出所需要的特殊类型细胞和组织,从而引起了人们的极大关注.ES细胞向心肌细胞定向分化的研究将为临床心肌损害的治疗提供一条新的思路.
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重组人促红细胞生成素对小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的影响
目的 初步观察外源性细胞因子重组人促红细胞生成素(rhEPO)对小鼠胚胎干细胞(ESC)向心肌细胞分化的影响.方法 将rhEPO加到细胞培养基中配成终浓度分别为05、1.0、5.0 U/ml的诱导分化液,分别在分化第8、12天观察ESC自发及在rhEPO诱导情况下心肌细胞分化率;在分化第7天应用RT-PCR检测自发分化组及rhEPO诱导组心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2.5mRNA的相对表达.结果 在分化第8、12天rhEPO诱导(1.0 U/ml)心肌细胞分化率分别显著高于对应分化天数的自发心肌细胞分化率(0.11±0.02对0.05±0.01,P＜0.05;0.86±0.02对0.65±0.05,P＜0.05);与自发分化组比较,rhEPO干预(1.0 U/ml)上调GATA-4、Nkx2.5 mRNA的相对表达.结论 外源性rhEPO早期干预能够促进ESC向心肌细胞分化.
关键词： 重组人促红细胞生成素 小鼠胚胎干细胞 心肌细胞 -
对成体干细胞可塑性的新认识及其在再生医学中的意义
根据个体发育过程中出现的先后次序不同,干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞.胚胎干细胞出现在胚胎发育的胚囊内层,高水平表达端粒酶.1981年Martin Evans首次从小鼠胚囊中分离出小鼠胚胎干细胞,后被证实具有自我复制能力,且可分化为诸如神经细胞、心肌细胞、肝细胞、β-胰岛细胞、骨细胞、造血细胞等200多种组织器官的原始细胞.
