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Salubrinal抑制小鼠破骨细胞发育和骨细胞凋亡
骨质疏松是一种以骨量减少和骨微结构破环为特征而导致骨折危险性增加的疾病。 Salubrinal是真核翻译起始因子2α( eIF2α)的选择性抑制剂,保护细胞免于内质网应激。前期工作表明salubrinal可促进骨损伤愈合,但是对骨丢失的作用尚需探索。本实验使用骨量减少的动物模型--鼠尾悬吊小鼠,验证以下假设：salubrinal通过抑制小鼠破骨细胞发育和骨细胞凋亡治疗骨质疏松。 C57 BL/6雌性小鼠(14周龄)随机分为3组：年龄对照组、鼠尾悬吊对照组和治疗组(n=20)。悬吊治疗组每天皮下注射salubrinal (1mg/kg),持续2周,鼠尾悬吊对照组小鼠注射同等体积的溶剂。实验前后分别进行骨密度测量。给药2周后处死小鼠,取左侧股骨固定,石蜡包埋。应用HE和TRAP染色进行股骨的组织形态学分析。收集右侧股骨和胫骨骨髓来源细胞以观测破骨细胞的发育状态。采用TUNEL染色检测骨细胞的凋亡情况。结果显示,与年龄对照组相比,鼠尾悬吊组小鼠骨密度显著下降(P<0.001),骨小梁体积分数(BV/TV)显著减少(P<0.001),表明骨量丢失动物模型建立成功；salubrinal显著改善骨密度的降低( P<0.05),增加骨容量( P<0.001)。 TRAP染色显示悬吊组小鼠多核破骨细胞形成明显增加(P<0.001),给药后明显抑制活跃的破骨细胞(P<0.001)。原代骨髓细胞培养发现鼠尾悬吊后破骨细胞活跃,而salubrinal能抑制破骨细胞的形成、迁移和粘附。鼠尾悬吊后,骨细胞凋亡增加,局部给药可显著减少骨细胞凋亡数目(P<0.05),改善失重性骨丢失。本研究表明,鼠尾悬吊通过激活破骨细胞的发育和促进骨细胞的凋亡导致骨质疏松,是一种成功的骨质疏松和骨量减少动物模型。 Salubrinal给药通过抑制破骨细胞发育减少鼠尾悬吊小鼠的骨量丢失,同时,给药后显著抑制了骨细胞凋亡,并使骨丢失趋势下降。然而,salubrinal抑制失重性骨质疏松的分子机制还有待进一步探讨。我们的研究为salubrinal治疗骨质疏松提供了有力理论依据。
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靶向破骨细胞的骨质疏松治疗药物研究进展
骨质疏松是由多种因素造成的以骨量减少、骨小梁显微结构退化导致骨强度降低为特征的全身性骨骼退行变化，患者常有腰背部或者全身无特征性疼痛，脆性骨折及呼吸系统受影响等症状。骨质疏松是全球性的慢性病。2014年美国休斯敦美国骨矿盐研究会年会报道，美国将会有1/2的老年女性以及1/3的老年男性将会发生骨质疏松性骨折。据调查，巴西绝经后骨质疏松患病率为15%-33%，我国人群40岁以上骨质疏松患病率约20%。骨质疏松患病率高，骨折率高，严重影响了中老年人的生活质量。目前骨质疏松的治疗主要有抗骨吸收与促骨形成治疗。抗骨吸收药物主要有双膦酸盐，雷洛昔芬，奥达卡替，狄诺塞麦等。其中双膦酸盐类药物是现在常用的药物，干扰破骨前体细胞附着；同时诱导破骨细胞凋亡，从而抑制骨吸收。但其长期使用有颚骨坏死，非典型性股骨坏死，损伤心血管系统，肾衰等风险。雷洛昔芬是选择性雌激素受体调节剂，可与不同雌激素受体结合，可以促使破骨细胞凋亡，抑制RANKL诱导的破骨分化，从而抑制骨吸收，但存在潮热与静脉血栓等副作用。狄诺塞麦是RANKL单克隆抗体，特异性阻断RANKL/RANK通路，促进破骨细胞凋亡，减少破骨细胞分化，抑制骨吸收。但是狄诺塞麦的长期疗效仍需进一步探究。奥达卡提是组织蛋白酶K抑制剂，可抑制破骨细胞功能，从而抑制骨吸收；其特异性高，可逃避溶酶体，体内半寿期较长，使用前景乐观。但仍需进一步实验数据评估其是否其对人体的不良效果。促骨形成的药物主要有甲状旁腺素类药物，其虽可重建骨微环境、增加骨密度，但价格昂贵且有肿瘤风险。随着对骨分子生物学的深入认识，靶定治疗骨质疏松的药物正在逐渐增多。不同药物具有不同的适应症，单一抑制骨吸收或促进骨形成都有其局限性。 Salubrinal是一种小分子量合成药物，可通过抑制真核翻译起始因子 eIF2α的去磷酸化，同时抑制破骨细胞发育。研究证明，此药是内质网应激的抑制剂，且对神经细胞、软骨细胞、肝细胞等均有积极作用。因此该药对骨质疏松的治疗前景十分乐观。至今，我们已证实Salubrinal对卵巢去势动物所致的骨质疏松具有增加骨密度和提高骨容积的疗效。但Salubrinal对骨质疏松治疗具体的分子机制至今未明。因此，下一步我们将继续研究Salubrinal治疗中的分子机制。
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三阴性乳腺癌肝肺转移治疗的研究进展
乳腺癌是常见的严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一。每年全世界约有130万人被诊断为乳腺癌,而有约40万人死于该病。近年来,乳腺癌发病率在我国呈明显上升趋势,在城市妇女中,约30人中就有1人患乳腺癌,且以每年3%至4%的增长率上升。三阴性乳腺癌( TNBC)为雌激素受体( ER),孕激素受体( PR)和人表皮生长因子受体2( HER-2)均为阴性的乳腺癌,占乳腺癌的10%~15%,具有恶性程度高、易复发、生存率低的特点。三阴性乳腺癌远处转移率高,早期易发生内脏转移,以肺和肝转移多见,高转移率也是死亡率较高的主要原因。患肺转移后,中位生存期为12个月；而患肝转移后的中位生存期仅为1个月。目前,三阴性乳腺癌的治疗方案主要有：含铂类如TC方案(紫杉醇联合卡铂)；非铂类方案如单药紫杉醇或联合卡培他滨或蒽环类药物,FLN(氟尿嘧啶+甲酰四氢叶酸+长春瑞滨)方案,但均有明显副作用,且患者总生存率无明显改变,因此急需研究有效且副作用小的治疗药物和方法。内质网应激( ERS)可以激活未折叠蛋白反应( UPR ),以保护内质网应激引起的细胞损伤,早期内质网应激可促使细胞存活,但长时间或严重的内质网应激可诱导细胞产生凋亡等效应,这使得基于内质网应激的抗肿瘤药物研发成为了一种可能。 Salubrinal是一种化学合成药物,可选择性的抑制真核翻译起始因子2α( eIF2α)的去磷酸化,对抗内质网应激诱导的细胞凋亡,而起到细胞保护作用,通过内质网应激起到抗肿瘤作用成为一种可能。近研究表明,Salubrinal对三阴性乳腺癌表型的4 T1细胞系和MDA-MB-231细胞系有一定的抑制生长作用,但其对三阴性乳腺癌肝肺转移的作用还未见报道。因此,我们旨在通过建立乳腺癌的小鼠模型,探讨Salubrinal在乳腺癌肝肺转移过程中的作用及可能的机制,为寻找新的三阴性乳腺癌研究靶点、增强患者生存率提供新的思路。
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乳腺癌骨转移治疗的药物研究进展
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一。全球范围内每9-10个女性中就会有1个罹患乳腺癌,每年约有120万女性诊断为乳腺癌,约有50万人死于晚期乳腺癌,发达国家发病率明显高于发展中国家。中国自1990年开始乳腺癌发病率以每年3%的速度增长,已成为我国女性发病率和死亡率高的恶性肿瘤,且城市发病率高于农村,并呈年轻化趋势。乳腺癌转移发病率很高,约有70%以上的乳腺癌患者伴有骨转移,转移多发于下肢骨,远超过次常见的肝、肺等部位转移。乳腺癌骨转移患者常见的表现为骨痛、病理性骨折、脊髓压迫、高血钙症等骨相关事件,严重影响了其生活质量。罹患骨转移后,中位生存期只有2年,5年生存率只有20%。乳腺癌骨转移应尽早发现尽早治疗,以控制疾病的发生以及骨转移时间。目前治疗乳腺癌骨转移的主要药物为双磷酸盐和RANKL特异性抗体狄诺塞麦等,可减少骨转移患者骨相关事件、骨折以及骨痛的情况。然而,这些药物并没有减弱骨转移的发生,不能刺激新骨的形成,还会引起药物性下颌坏死等副作用,患者的生存率没有明显改变,因此研究新的治疗乳腺癌骨转移的药物具有重要意义。 Salubrinal 为化学合成药物,是一种真核翻译起始因子eIF2α的特异性磷酸酶抑制剂,可以抑制内质网应激介导的细胞凋亡。我们研究发现Salubrinal通过抑制eIF2α去磷酸化,促进成骨细胞形成,抑制破骨细胞发育,刺激新骨形成,增强骨损伤愈合。另有研究表明,Salubrinal对乳腺癌细胞系凋亡有促进作用,抑制肿瘤细胞生长。但是,在体内Salubrinal对乳腺癌的作用国内外尚无报道。因此,我们下一步的工作将阐明Salubrinal治疗乳腺癌和乳腺癌骨转移的作用及其相关机制。
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酵母双杂交技术筛选人白细胞中与乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白基因
目的:筛选并克隆人白细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,进一步探讨HBxAg的生物学功能.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBxAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人淋cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBxAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落50个,其中含真核翻译延伸因子2基因20个,真核翻译延伸因子1基因1个,真核翻译起始因子3基因2个,急性髓样白血病MTG8蛋白基因2个,髓样关联分化蛋白基因1个,髓样分化主反应蛋白基因1个,皮肤T细胞淋巴瘤肿瘤抗原基因1个,大组织相容性复合物Ib抗原基因3个,白细胞抗原CD37基因1个,慢性白细胞性白血病相关抗原基因1个,α白细胞整联蛋白基因1个,生长停止和DNA损伤诱导因子34基因1个,转录变异因子1基因2个,蛋白磷酸酶1调控抑制因子15A基因1个,单核细胞系胞苷脱氨酶基因1个,巨噬细胞钙离子依赖型凝集素2基因1个,KIAA1949蛋白基因3个,尿激酶型血浆素原激活剂基因1个,GDP分解抑制因子基因3个,软骨素4磺基转移酶基因1个,锌指蛋白1A亚目基因1个和未知蛋白基因1个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒X蛋白的结合蛋白,为进一步研究HBxAg的生物学作用提供了新的线索.
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人大肠癌转移相关基因片段的筛选和鉴定
目的:初步筛选和鉴定大肠癌转移相关基因,阐述大肠癌转移的分子机制.方法:利用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),在一对来自同一亲本、转移能力不同的人大肠癌细胞株SW620和SW480间,已成功构建了人大肠癌转移促进基因和转移抑制基因的两个cDNA消减文库.从以上两个文库中随机挑取约200个菌液PCR片段,利用Differential screening(DS)方法筛选真正差异表达的cDNA片段,之后通过Northern blot对部分差异cDNA片段的DS筛选结果进行验证.后对筛选出的差异cDNA片段进行测序和同源检索,分析其性质并初步探讨其在大肠癌中转移中的可能机制.结果:约200个菌液PCR片段经过DS筛选后,共获得29个真正差异表达cDNA片段,利用Northern blot对其中4种cDNA片段的表达情况进行验证,结果与DS筛选一致.然后对29个差异cDNA片段进行测序和同源性分析,得到25个差异表达基因,10个为已知基因,其中5个基因在高转移细胞株SW620中差异表达,可能有促进转移的作用,包括热休克蛋白10(heat shock protein10,HSP10)、细胞色素氧化酶Ⅱ(cytochrome C oxidaseⅡ,COXⅡ)、有丝分裂调控蛋白dis3人同源物(mitotic control protein dis3 homolog,DIS3)、骨骼肌αl-肌动蛋白(skeletal muscle actin alpha1,ACTAl)及血浆淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA);另外5个基因的表达仅见于在SW480低转移细胞株,具有潜在的转移抑制作用,包括egl nine homolog 2(EGLN2)、真核翻译起始因子4A(eukaryotic translation initiation factor4A,EIF4A)、人细胞色素氧化酶Ⅲ的类似物(similar to cytochrome c oxidase Ⅲ,COXⅢ)、谷胱甘肽S转移酶3(glutathione S-transferase mu 3,GSTM3)及线粒体DNA(mitochondrion DNA,mtDNA).10个已知基因基本上是一些与细胞生长分化、代谢合成、转录、凋亡及信号转导等相关的基因.除DIS3和SAA外,其余基因与大肠癌转移的关系在本研究中首次被报道.此外,还筛选到15个未知基因片段,通过与人基因组序列进行比对,发现其中6个基因定位于5号染色体上,包括4个可能促进大肠癌转移的基因和2个抑制基因.目前这15个未知基因片段已经被GeneBank dbEST库收录,GeneBank登陆号为CD485499-CD485513.结论:DS技术是一种筛查表达文库的有效途径;细胞的生长分化、转录、凋亡、信号转导等变化可能在大肠癌转移过程中发挥重要作用;5号染色体上可能存在多个与大肠癌转移相关的新基因位点.
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Salubrinal对慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺组织内质网应激凋亡的保护作用
既往COPD的发病机制主要以炎症学说、蛋白酶失衡学说及氧化应激等为主,近的研究结果表明,除上述机制外,内质网应激导致肺泡上皮细胞凋亡也是COPD发病的重要机制之一[1].Salubrinal是一种研究内质网应激的有用工具,是从19 000多种保护小鼠嗜铬细胞瘤发生内质网应激所致凋亡的化合物中筛选出的一种小分子物质,可通过选择性诱导真核翻译起始因子2α亚单位(eukaryotic translation initiation factor 2 subunitα,eIF2α)磷酸化和抑制其去磷酸化,以保护细胞免于内质网应激所致凋亡,Salubrinal已被用于多种疾病的研究,如糖尿病、白血病和神经退行性病变等[2-4],并将作为疾病的治疗靶点.本实验以脂多糖和香烟烟雾诱导的COPD大鼠肺泡上皮细胞作为研究对象,观察Salubrinal对肺泡上皮细胞凋亡的保护作用及其可能的机制.
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真核翻译起始因子4E
真核翻译起始因子4E（eukaryotic translation ini-tiation factor 4E, eIF4E）在肿瘤形成和进展过程中起重要作用。目前，直接或间接针对eIF4E的治疗药物的研究已取得很大进展。深入了解eIF4E的功能及其在翻译起始阶段调节肿瘤形成的作用，为更好地研制新型有效的抗肿瘤药物提供理论依据。
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真核翻译起始因子5A2在胰腺癌中的表达及与预后的相关性
目的 研究真核翻译起始因子5A2(EIF5A2)在胰腺导管腺癌中的表达及其与患者临床病理特征和预后的相关性.方法 收集北京协和医院2007年3月至2008年12月收治的胰腺导管腺癌患者的手术标本,采用免疫组织化学方法检测EIF5A2在胰腺肿瘤组织中的表达水平.所有患者均采集到完整的临床病理资料,分析EIF5A2与临床病理参数之间的相关性及其在预后评估中的作用.结果 73例患者中,43例有EIF5A2的高表达.EIF5A2与病理T分期(P＜0.001)、N分期(P=0.004)、M分期(P=0.039)和TNM分期(P=0.005)显著相关.Kaplan-Meier分析结果显示,EIF5A2低表达组的总生存时间显著高于高表达组(P=0.003).Cox单因素分析结果显示,EIF5A2是胰腺癌患者预后的潜在预测指标.结论 EIF5A2可能是胰腺癌患者预后不良的一个潜在分子指标.
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真核翻译起始因子3c 在人脑胶质瘤组织中的表达及临床意义
目的：探讨人脑胶质瘤组织中真核翻译起始因子3c（ eIF3c）的表达及意义。方法采用免疫组织化学SP技术检测83例人脑胶质瘤组织及25例正常人脑组织中eIF3c蛋白的表达情况，并分析eIF3c蛋白表达与脑胶质瘤临床病理特征的关系。结果人脑胶质瘤组织中eIF3c阳性表达率显著高于正常人脑组织（χ2＝57．02，P＝0．00＜0．01），其表达与患者的年龄、性别、部位及肿瘤大小无关（P＞0．05），与脑胶质瘤恶性程度有关（ P＜0．05）。结论 eIF3c在人脑胶质瘤组织中存在过度表达，可能在脑胶质瘤的发生发展机制中发挥着重要作用，有望成为脑胶质瘤分子治疗新的靶点。
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eIF3a与肿瘤发生、演进和干预的研究进展
真核翻译起始因子3(Eukaryotic translation factor 3,eIF3)是由多个亚单位组成的复合因子,其中eIF3a是其大的亚单位.很多研究表明在酵母和哺乳动物细胞中,eIF3都参与了mRNA翻译起始,并对蛋白质的合成有很好的调控作用.值得一提的是eIF3a通过调控一系列与肿瘤的生成、细胞周期的调控DNA修复等过程相关的mRNA的翻译从而在肿瘤的发生、演进和干预中发挥重要作用.此外,研究发现eIF3a对RAF-MEK-ERK信号通路有抑制作用.eIF3a对蛋白质翻译的调节及其对RAF-MEK-ERK信号通路的影响使其有望成为肿瘤治疗的新靶点.本文将着重围绕eIF3a在肿瘤发生、演进和干预中的作用进行概述.
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真核翻译起始因子eIF4E与恶性肿瘤的研究进展
真核翻译起始因子eIF4E对mRNAs的翻译起重要作用,其过度表达可影响细胞的生长和分化,与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关.
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真核翻译起始因子-3c在结肠癌细胞中的表达及其对细胞增殖的影响
目的:探讨真核翻译起始因子-3c(eukaryotic translation initiation factor 3c,eIF3c)在结肠癌细胞中的表达及其对细胞增殖的影响.方法:在5种结肠癌细胞株(RKO,HCT116,SW480,SW620和LoVo)中检测eIF3c的mRNA水平.构建eIF3c特异性siRNA慢病毒载体,用其感染结肠癌细胞,并设对照组.采用Real-time PCR和Western blotting方法分别从mRNA和蛋白质水平检测eIF3c基因的表达情况,通过MTT和集落形成实验观察结肠癌细胞的增殖率,评估eIF3c对结肠癌细胞增殖能力的影响.结果:5种结肠癌细胞株中eIF3c均为高表达,以RKO细胞中eIF3c表达高,故被用于进一步RNA干扰研究.成功构建eIF3c-shRNA干扰体系并稳定转染RKO细胞后,与对照组比较,干扰组eIF3c mRNA下降了70％(P＜0.001),蛋白表达水平明显降低;MTT结果显示,干扰组细胞增殖水平明显低于阴性对照组(1∶60,P＜0.01);沉默eIF3c导致RKO细胞的集落数量显著减少,为对照组的35％ (P＜0.01),集落大小显著小于对照组;eIF3c与细胞周期相关,沉默eIF3c导致G0/G1期细胞的比例增加了8％ (P＜0.001),G2/M期细胞的比例增加了5％(P＜0.01),S期细胞的比例显著减少(12％),P＜0.001.结论:eIF3c在结肠癌细胞中高表达,沉默eIF3c基因可显著抑制结肠癌细胞的增殖能力,提示eIF3c在结肠癌的发生、发展中起重要作用,抑制eIF3c的表达有望被用于治疗结肠癌.
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Intermedin通过减轻内质网应激和炎症反应而抑制同型半胱氨酸诱导的心肌纤维化
目的：探讨intermedin（ IMD）1－53在apoE－／－小鼠心肌纤维化中的作用和机制。方法：同型半胱氨酸（ Hcy）处理apoE－／－小鼠和心脏成纤维细胞。结果：IMD1－53显著抑制Hcy处理apoE－／－小鼠心肌间质胶原沉积、I型和III型胶原mRNA和蛋白表达，直接抑制Hcy诱导的心脏成纤维细胞I型和III型胶原的蛋白表达，抑制心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。此外， IMD1－53抑制Hcy处理的apoE－／－小鼠心脏组织及心脏成纤维细胞内质网应激标志分子如葡萄糖调节蛋白78（ GRP78）、GRP94、激活转录因子6（ATF6）、ATF4、蛋白激酶受体样内质网激酶、真核翻译起始因子2α、肌醇需求酶1α和剪切的X盒结合蛋白1的激活。 IMD1－53抑制Hcy处理的apoE－／－小鼠心脏组织及成纤维细胞炎症相关分子如肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、白细胞介素1、核因子κB、转化生长因子α1和c－Jun氨基末端激酶的激活。结论：IMD1－53显著抑制心肌纤维化，其机制可能与IMD减轻内质网应激和炎症反应有关。
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(His)6 -eIF3s4融合蛋白在人乳腺癌细胞Bcap37中的表达
目的:构建真核细胞翻译起始因子3第4亚单位(eIF3s4)真核表达载体用于进一步功能研究.方法:设计引物, 以K562细胞的总RNA为模板, 采用RT-PCR方法扩增eIF3s4的全长编码区cDNA, 克隆于pGEM-T Easy载体, 经DNA测序并与GenBank数据库序列进行比对后, 将该cDNA序列亚克隆于真核表达载体pcDNA4/HisMaxB载体, 构建成(His)6-eIF3s4融合蛋白的表达载体, 用Lipofectamine TM2000瞬时转染人乳腺癌细胞株Bcap37, 利用Western blot方法检测(His)6-eIF3s4融合蛋白的表达.结果:DNA序列测定表明, 利用RT-PCR方法克隆的eIF3s4全长编码区cDNA序列与GenBank数据库序列一致, Western blot结果证实(His)6-eIF3s4融合蛋白在Bcap37细胞中获得预期表达.结论:成功地构建了eIF3s4的真核表达载体并在人乳腺癌细胞Bcap37中表达, 为建立稳定的eIF3s4高表达细胞系, 进而研究eIF3s4与肿瘤细胞多药耐药相关性打下了基础.
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真核翻译起始因子家族与恶性肿瘤相关性的研究进展
真核翻译起始因子（EIFs）是一类参与真核细胞蛋白质翻译起始过程并发挥不同作用的蛋白质。其家族成员大约有20余种，近年来研究发现，EIF 家族除了参与真核细胞蛋白质翻译起始进程外，其中多数成员在多种肿瘤细胞中存在过度表达或低表达，其表达量的异常与恶性肿瘤的发生、演化、预后关系及研究进展较为密切。
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真核翻译起始因子家族在真核细胞翻译中的研究进展
真核翻译起始因子在真核细胞蛋白翻译起始过程中起到了至关重要的作用，在细胞发育、分化乃至基因表达等众多方面发挥深远的影响。本文将对其家族中的六位重要成员eIF1，eIF1 A，eIF2，eIF3，eIF4E，eIF5等，在真核细胞蛋白翻译中的作用研究作一综述，以期浅析eIFs家族对真核细胞发生发展的重要意义。
