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我国狂犬病病毒及其传播流行规律
狂犬病病毒为单股不分节段的负链RNA病毒,病毒基因组由11928-11932个核苷酸组成,依次排列着N、P、M、G和L5个狂犬病病毒的结构基因,其长度分别为1 424、991、805、1675、6475个核苷酸,分别编码核蛋白(NP)、磷蛋白(NSP)、基质蛋白(MP)、糖蛋白(GP)和转录酶大蛋白(LP).
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分离鉴定结核分支杆菌索状结构基因
目的:通过比较具有不同索状结构表型菌株的基因表达谱,分离鉴定可能的索状结构基因.
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疏水性区域及稀有密码子对登革2型病毒E基因原核表达影响的分析
登革病毒E蛋白是病毒主要毒力蛋白,带有型特异及属特异抗原决定簇,既能诱导宿主产生保护性的中和抗体,又能诱导产生血凝抑制抗体,与登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)的致病机制有关[1].有学者已经利用包括大肠埃希菌、毕赤酵母、昆虫细胞等多种表达系统对其表达条件进行了探讨,由于受未知因素的影响,登革病毒E蛋白的原核重组表达一直不理想[2～4].本研究对登革病毒E蛋白不同区域的原核表达进行了较为系统的分析,探讨疏水性区域及稀有密码子登革病毒E蛋白表达的影响,并对部分区域进行了高效原核表达.广东省科技计划项目(20006836008005);全军医药卫生科研基金资助课题(06MA129)
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三株登革2型病毒广东分离株结构蛋白E基因序列测定及分析
目的对广东省分离的3株登革2型病毒(DEN2)的结构蛋白E基因扩增、克隆、测定及分析,了解流行株之间的相互关系及基因型.方法应用RT-PCR技术扩增广东省不同年份流行的3株DEN2型病毒的结构蛋白E基因.分别克隆到PMD18 T载体,转化JM109宿主菌,挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定.结果3株DEN2病毒结构蛋白E基因序列长度均为1 485 bp,编码495个氨基酸.其核苷酸(氨基酸)的同源性分别是:GD06/93与GD19/2001为98%(98%)、GD06/93与GD08/98为92%(95%)、GD08/98与GD19/2001为91%(94%).3株DEN2与国际参考株比较表明:GD06/93与澳大利亚TSV01株共享序列非常接近,核苷酸(氨基酸)的同源性为99%(99%);GD19/2001和澳大利亚TSV01株核苷酸(氨基酸)的同源性为98%(98%);GD08/98与泰国株ThNH-P28/93核苷酸(氨基酸)同源性为98%(98%).结论GD06/93、GD19/2001与TSV01亲缘关系较近,属同一基因型.GD08/98与TnNH-P28/93共享序列非常接近,属同一基因型.
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麻疹的分子流行病学与监测
本文为作者在首届全国麻疹实验室网络研讨会的学术报告,由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所许文波副研究员译,中国疾病预防控制中心免疫规划中心王莉霞助理研究员校.麻疹病毒属于副粘病毒科,麻疹病毒属.麻疹病毒属中各病毒核蛋白基因的亲缘关系树状图提示,麻疹病毒与牛瘟病毒相近(图1).麻疹病毒为单股负链核糖核酸(RNA),约16kb,如病毒基因结构示意图(图2)所示,麻疹病毒有6个结构基因,编码6个主要结构蛋白.从基因3′端开始依次为核蛋白(N)、磷酸蛋白、膜蛋白、血溶素也称融合蛋白(F)、血凝素蛋白(HA)和依赖于RNA的RNA聚合酶.病毒核蛋白呈螺旋状,直径18nm.病毒包膜上有2个糖蛋白,为HA和F,其功能是吸附和融合细胞膜,使病毒进入细胞进行复制.麻疹病毒只有一个血清型,但有多个基因型.麻疹病毒只能感染人类和灵长类.感染麻疹的后续并发症包括包涵体脑炎(MIBE)和亚急性硬化性全脑炎(SSPE).
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辛德毕斯病毒结构蛋白基因对宿主细胞影响的初步研究
目的 了解辛德毕斯病毒基因结构与功能的关系，阐明其分子致病分子机理。方法 构建了辛德毕斯病毒(XJ-160病毒株)结构基因的真核表达质粒，pcDNA3.1ABC，转染BHK-21细胞后观察其对宿主细胞的影响。结果 转染病毒结构基因的BHK-21细胞，可以发生辛德毕斯病毒感染所出现的细胞毒性反应，表现为：细胞存活率降低；细胞核染色质浓缩、凝集；G1期细胞减少、而处于s期的细胞增多。结论 辛德毕斯病毒结构蛋白基因可引起宿主细胞的凋亡。
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中国佤族人群MBL基因SNP及其单倍型与基因型的研究
甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)通过激活补体凝集素途径和调理吞噬作用清除病原体及受感染细胞,在机体天然免疫中起关键作用[1].已发现MBL基因上存在至少20个单核苷酸多态性(SNP)位点,仅其中6个SNP位点对MBL血清水平有较大的影响,他们分别是启动子区-550(G/C)、-221(C/G)、+4(C/T)3个位点(分别称H/L、X/Y和P/Q等位基因)和结构基因第一外显子CGT52TGT、GGC54GAC、GGA57GAA 3个密码子点突变(分别称为D、B、C等位基因,即A野生型).按照排列组合的规律这6个SNP可随机组合成26种单倍型,但由于结构基因3个SNP位点与不同的启动子单倍型连锁不平衡,至今只检测到7种常见的单倍型.
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异烟肼耐药结核分支杆菌katG基因分析
结核分支杆菌(M tuberculosis, TB)的katG基因是位于细菌染色体上的结构基因,全长2223bp,它的编码产物是过氧化氢-过氧化物酶,而后者在维系异烟肼(Isoniazid, INH)杀菌毒性中,发挥重要作用.因此,katG基因结构的正确性是编码产生功能正常的过氧化氢-过氧化物酶的先决条件,也是发挥INH特有的药理作用的重要基础.通过检测katG基因的分子结构,尤其是检测某些关键位点的碱基突变,可以快速发现TB对INH耐药的变异情况,对及时的指导临床用药,具有重要的意义.
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登革2型病毒广东流行株结构蛋白基因序列测定及分析
目的对广东省90年代以来流行的3株登革2型病毒(DEN2)的结构蛋白基因序列测定及分析,了解流行株之间的相互关系、变异及基因型. 方法应用RT-PCR技术扩增广东省不同年份流行的3株DEN2型病毒的结构蛋白基因(C、PrM、E基因).分别克隆到pMD18 T载体,转化JM109宿主菌,挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定. 结果 3株DEN2病毒结构蛋白基因序列长度均为2?325bp,编码775个氨基酸.三者核苷酸(氨基酸)的同源性分别是:GD06/93与GD19/2001为96%(97%)、GD06/93与GD08/98为94%(97%)、GD08/98与GD19/2001为92%(94%).其在相关毒力位点E383～385处均为GLU-PRO-GLY、E126处均为GLU.3株DEN2与国际参考株比较表明:GD06/93与GD19/2001和澳大利亚TSV01株共享序列非常接近,核苷酸(氨基酸)的同源性为98%(98%);GD08/98与泰国株ThNH-P28/93核苷酸(氨基酸)同源性为98%(98%).此3株DEN2二级结构与对乳鼠不致病的04株比较,主要差别位于其393～400氨基酸处,本室分离的3株对乳鼠致病毒株为EEEEHHHH,而04株为EEEE----;337～343处本室分离的3株对乳鼠致病毒株为HH-------HHHHH,而04株为--------HHHHE-,恰好位于Dengue病毒E基因的Ⅲ区. 结论 GD06/93、GD19/2001与TSV01亲缘关系较近,属同一基因型.GD08/98与ThNH-P28/93共享序列非常接近,属同一基因型.3株DEN2病毒在E蛋白Ⅲ区结构有一定变异,可能与毒力有关.
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56例神经系统疾病患者外周血尼帕病毒N基因片段检测
尼帕病毒(Nipah vires,NiV)为副黏液病毒,Henipavims亚属,单股负链RNA病毒,不分节段.人感染NiV后病死率达4|D%～70%,因此,NiV被列为危险的生物安全4(P-4)级病原.NiV共有6个结构基因,其中N基因高度保守且高效表达,因此被广泛用于NiV感染的诊断和流行病学调查.
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中国HIV-1 CRF01_AE流行株结构基因和调节/辅助基因DNA疫苗的构建和免疫原性研究
目的 构建表达gag-env融合基因和tat-rev-integrase(c-holf)-vif-nef融合基因的DNA疫苗,并评价其免疫原性.方法 按人源密码子使用频率对AE2f株的gag、env、tat、rev、integrase、vif和nef基因序列进行优化,构建真核表达质粒.用Western blot法验证体外表达情况;用ELISPOT法检测小鼠的细胞免疫反应.结果 限制性酶切及DNA测序结果表明两个融合基因质粒构建正确,可以表达相应的融合蛋白.ELISPOT结果显示,Gag-Env特异性的T细胞反应强度为(3010±566)SFC/10~6脾细胞;Tat-Rev-Integrase(C-half)-Vif-Nef融合蛋白特异性的T细胞反应为(948±737)SFC/10~6脾细胞,均显著高于空载体组.结论 构建的表达HIV-1 CRF01_AE流行株gag-env融合基因和tat-rev-integrase(c-half)-vif-nef融合基因的DNA疫苗可以正确表达所编码的融合蛋白并有效地激活机体的T细胞免疫反应.
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共表达HIV-1与IL-6核酸疫苗质粒诱导小鼠免疫原性的研究
目前我国AIDS的流行已进入快速增长期,因此应用现代生物技术研制新型AIDS疫苗,改进早期开发疫苗的缺陷,提高其质量是当前的迫切任务.本研究利用分子生物学方法在真核表达载体基础上构建HIV结构基因与细胞因子IL-6基因共表达重组质粒作为核酸疫苗,进行小鼠免疫试验,探讨核酸疫苗对机体细胞免疫反应能力及细胞因子IL-6作为免疫佐剂的效果.
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临床常见产AmpC β-内酰胺酶菌株中染色质ampD基因的测定与分析
AmpC β-内酰胺酶(简称AmpC酶)的产生由其产酶基因所控制.细菌染色质上AmpC酶的基因包括结构基因ampC和多种调控基因ampR、ampD和ampG等.
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乙型肝炎病毒新开放读码框架的确定及其意义
乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝部分双链DNA病毒,基因组长度只有3.2kb,结构基因与调节基因序列之间重叠,甚至结构基因序列之间重叠,因此HBV DNA序列的利用率之高实属罕见.1979年首次报告HBV DNA的全基因序列并确定4个主要的开放读码框架(ORF)之后,一直沿用至今.我们在中国流行株HBV基因序列的分析中,在前-Sl和X基因之前,分别发现了2段编码基因序列:前-前-S基因长度135 bp,编码产物为45 aa;前-X基因长度168 bp,编码产物为56aa.在前-前-S基因、前-X基因的上游存在启动子序列,具有指导报告基因表达的活性.对15例慢性乙型肝炎(CHB)患者基因型C型9例、B型1例、B/C混合型5例,共31个克隆测序结果,发现均存在前-前-S基因区.17例CHB患者A型1例、B型3例、C型10例、B/C混合型3例,共测序45个克隆,C型编码前-X区的克隆数占总编码克隆数的60肝,C型不能编码前-X区的原因主要是A2608→C/T替换突变或C/A2733→T替换突变单一突变;而B型、B/C型都不能编码前-X区蛋白,主要因为双突变的存在.在HBV基因组中发现前-前-S和前-X基因序列的存在改写了HBV DNA编码基因序列研究的历史.
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丙型肝炎病毒结构基因转基因小鼠引起肝脏脂肪变
目的:建立持续表达和诱导表达型丙型肝炎病毒(HcV)结构基因(包括核心蛋白和包膜蛋白El、E2编码基因)的转基因小鼠动物模型,探讨HcV结构基因表达导致肝脏脂肪变的病理改变.方法:以含有近全长HcV cDNA的质粒为模板,通过多聚酶链反应(PcR)技术扩增HcV结构基因的DNA片段(约2.2kb),克隆到真核表达载体pcDNA4HisMas和pMT/BiP/V5-HisA中,分别构建成持续表达型表达载体pcDNA4HisMas-HcV core-E2和诱导表达型表达载体pMT/BiP/V5-HisA-HcV core-E2.以限制性内切酶分析和目的DNA片段的核苷酸序列分析,证实构建HcV结构基因的真核表达载体正确无误.以脂质体体外转染cos-7细胞系,利用抗-HcV E2的多克隆抗体进行westem blot杂交分析,证实转染细胞中有HcV E2蛋白的表达.利用小鼠受精卵细胞核微注射方法,导入线性化表达载体的DNA,利用假孕小鼠的受精卵植入方法,建立了表达HcV结构基因的转基因小鼠模型.对于持续表达型转基因小鼠的死胎、6月龄以及硫酸铜诱导表达型的转基因小鼠模型的肝脏组织,进行HE染色和病理学特征的分析.结果:构建了持续性表达和可诱导性表达型的HcV结构基因表达载体pcDNA4HisMas-HcV core-E2和pMT/BiP/V5-HisA-HcV core-E2,体外转染cos-7细胞证实转染细胞中有HcV E2抗原的表达.对于持续表达型转基因小鼠死胎肝脏病理学特征进行分析,发现肝组织尚未分化发育完成,肝内有大量造血细胞,肝细胞空泡变性,单个核细胞聚集现象.对于持续表达HcV结构基因的6月龄转基因小鼠的肝脏进行病理学分析,发现中央静脉区肝细胞小泡型脂肪变性,中央静脉周围细胞溶解坏死,中央静脉明显扩大,少数组织中亦见大泡型脂肪变性.对于可诱导型转基因小鼠的肝脏进行病理学分析,发现肝小叶内中央静脉周围坏死区累及5-10个小叶,周围无淋巴细胞浸润,交界区可见多数肝细胞核异常,或固化,或呈花环状,或溶解为淡蓝色无定形基质.泡浆内残留大量脂肪小泡,肝脏脂肪变与核异常有-移行过程.结论:建立了表达HCV结构基因的转基因小鼠,发现HCV结构基因的转基因小鼠肝脏有典型的脂肪变病理改变,为进一步研究HCV感染引起的慢性丙型肝炎合并脂肪变的特征和机制研究奠定了基础.
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乙型肝炎病毒基因组中前-前-S区编码基因的界定
目的:乙型肝炎病毒(HBV)基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠,是基因组序列高度集中利用的-个典型.早期研究中确定了编码病毒蛋白的4个开放读码框架(ORF),本研究通过对于中国HBV感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较,阐明基因组结构的特点,并探索是否存在新型ORF的可能性.方法:考虑到HBV基因组序列的准种特点以及多聚酶链反应(PCR)技术的精确度,我们采用的技术是长距离且精确PCR(LA-PCR)技术,根据中国HBV患者的病毒基因序列设计PCR扩增用引物,自慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列,克隆入pGEM Teasy质粒,挑选克隆进行全基因组DNA测序,与其他HBV基因组序列进行比较.结果:测序结果5株HBV全基因组核苷酸序列存在一新的ORF,定义为前-前-S区,并发现该区之前存在一TA富集区,提示存在新型启动子的可能性.新界定的前-前-S区ORF编码氨基酸序列为MQLIITSKLGⅡYILCGRLVFYIREKLHAVPHFVGHHILGNKSYS,与前-S1、前-S2和表面抗原主蛋白编码基因框架一致表达.结论:在HBV基因组中存在有一新的ORF,命名为前-前-S区.
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肿瘤转移抑制基因KAI1对MHCC97-H肝癌细胞粘弹性的影响
目的:探讨肿瘤转移抑制基因KAI1对高转移潜能肝癌细胞MHCC97-H粘弹性的影响.方法:采用微管吸吮技术研究我们前已转染人类KAIl全长正或反义结构基因的人肝癌MHCC97-H细胞粘弹特性.结果:MHCC97-H肝癌细胞的粘弹性系数K1,K2,μ在转染KAI1正义基因后明显增加(P=0.007),在转染KAI1反义基因后明显降低(P=0.000),而转染空载体后则无明显变化(P=0.444).结论:KAI1基因对肝癌细胞的粘弹性有明显影响,这为肝癌侵袭和转移机制的研究提供了重要线索.
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探针杂交法快速检测耐甲氧西林葡萄球菌
葡萄球菌获得甲氧西林耐药性主要是由于产生了一种与β内酰胺类抗生素亲和力低的青霉素结合蛋白PBP2a,mecA基因是编码PBP2a的结构基因,可作为甲氧西林耐药的一个分子标志.编码耐热核酸酶的nuc基因是金黄色葡萄球菌(金葡菌,SA)的特异基因,通过检测nuc基因,可以诊断SA感染.
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HIV-1基因分型及其研究意义
艾滋病病毒1型(HIV-1)属于单股正链核糖核酸(RNA)逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒亚科(Lentivirinae),其成熟病毒粒子含2个基因组,每个基因组全长约9.8kb,含3个结构基因、6个调节基因和两侧长末端重复序列.该病毒因具有高突变率、高重组率和高复制率等特点,故其基因组能快速变异,产生大量变异株,从而顺利逃脱宿主的免疫压力,致使HIV感染者/艾滋病(HIV/AIDS)患者总数日趋增多.至2003年底,全球HIV/AIDS患者总数已超过4 000万,每天仍有约1.4万人新感染HIV[1].通过对HIV-1基因片段或全长特异性扩增、测序及种系分析,可将其变异株做基因分型,这对于HIV-1监测、诊断、疫苗和药物治疗等发现具有重要的指导意义.
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苦味酸天狼星红对胶原纤维染色的方法
现在证明不同类型的胶原分别由不同的结构基因所决定,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、V、Ⅺ型可形成纤维故称胶原纤维.其它七型不能形成纤维故称非胶原纤维.人体组织中的胶原主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型,其它类型含量甚微.
