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应用PCR-SSP技术检测HLA-B27等位基因
人类白细胞抗原B27(human leukocyte antigen B27, HLA-B27)因其与强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis ,AS)间的强相关性而引人注目.AS患者HLA-B27阳性率高达90%~96%,而普通人群仅为4%~9%. 但HLA-B27在基因水平上还存在着很大的异质性.我们采用序列特异性引物扩增法(sequence specific primer,PCR-SSP)对HLA-B27作进一步亚型分析,与PCR-SSOP(寡核苷酸探针斑点杂交)和直接DNA测序相比,具有简便、快捷、准确的特点,适用于临床及科研应用.
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聚酰胺-胺型纳米载体在基因治疗中的研究现状及展望
一种新型纳米材料--聚酰胺-胺型(polyamidoamine,PAMAM)树枝状高聚物(dendrimers),以下简称PAMAM-D,为放射状对称的球形多聚体,是近各学科中研究热点之一.尤其应用PAMAM-D作为基因转移载体取得成功令人鼓舞.PAMAM-D表面主要为胺基团,具有结合、浓缩DNA及将DNA高效导入各种细胞的能力,体外显示无明显细胞毒性.已有应用PAMAM-D转移寡核苷酸、反义寡核苷酸及寡核苷酸探针的系列报道.同时动物实验结果提示,使用无免疫原性的PAMAM-D可获取有效基因转移率.
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B19微小病毒70-mer寡核苷酸探针的设计
目的设计B19微小病毒诊断基因芯片的寡核苷酸探针.方法以微小病毒B19为例,利用BLAST软件对其序列进行比对并获得特异序列;利用软件Oligo 6设计特异性高、Tm值接近、长度均一的寡核苷酸探针.结果获得12条70-mer寡核苷酸探针,用于芯片打印及病毒检测.结论利用BLAST系统和生物学软件Oligo 6可简便而有效地设计诊断芯片探针.
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结核分支杆菌异烟肼和链霉素耐药基因的杂交检测
异烟肼(INH)、链霉素(SM)作为结核病治疗中主要的一线抗结核药物,对其耐药性的研究日益受到重视.传统的结核分支杆菌耐药性测定由于需要6-8周时间,不能及时指导临床用药.近年来,随着分子生物学技术的不断发展,对结核菌的耐药机制有了进一步认识,认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关,也inhA基因突变也有相关性[1].耐链霉素的产生是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL和16SrRNA的编码基因rrs的缺失和突变所导致[2].我们采用采用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术分别对肺结核病人痰标本临床分离株和结核病人痰标本直接进行KatG基因、inhA基因、rpsL基因、rrs基因的突变检测,现将结果报告如下.
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生物芯片技术在临床病原菌检测中的新进展
生物芯片(Biochip)又称微阵列(Microarray)技术,是近年来生命科学与微电子学等学科相互交叉发展起来的一门高新技犬,是随着人类基因组计划(HGP)的研究发展应运而生.根据芯片上的探针不同,可分为蛋白芯片和基因芯片,如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或靶DNA,称为基因芯片,如果芯片上固定的是肽或蛋白,则称为肽芯片或蛋白芯片.目前生物芯片技术在临床病原菌、毒力基因、抗药性基因、致病因子的快速检测等方面已取得了突破性进展,显示出诱人的应用前景.
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斑点杂交技术在肾结核诊断中的应用
肾结核是由结核杆菌引起的慢性、进行性、破坏性的肾实质病变,肾结核早期诊断非常困难.为了寻找简便,快速,准确诊断肾结核的方法,我们建立了PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术(斑点杂交技术)从分子水平检测结核杆菌.
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结核分支杆菌链霉素耐药性的杂交检测
我国是结核病疫情严重的国家之一,其主要原因是耐药(DR-TB)和耐多药(MDR-TB)结核病的广泛分布和迅速传播.MDR-TB的流行已成为20世纪全球结核病第3次回升的4大原因之一.因此,耐药问题已成为结核病防治工作中迫切需要解决的问题.链霉素(SM)作为主要的一线抗结核药物之一,对其耐药性的研究日益受到重视.国外也有报道[1]:认为结核分支杆菌耐链毒素的产生是由于其核糖体蛋白S12编码基因(rpsL)和16SrRNA编码基因(rrs)的突变所致.我们采用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术检测了47株肺结核病人临床分离株(其中药物敏感株13株,耐SM或含耐SM的耐多药株34株),并对21例结核病人痰标本直接进行rpsL基因、rrs基因突变分析,现将结果报告如下.
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糖尿病患者外周血树突细胞功能活性检查及抑制NF-κB活性的意义
目的 检测糖尿病(DM)患者外周血单个核细胞(PBMNCs)培养树突细胞(DC)的功能表达及其临床意义, 探讨DC成熟过程中核因子 (NF)-κB基因的作用.方法 DM患者及健康成人PBMC体外经GM-CSF和IL-4诱导培养DC,在DC培养中加入NF-κB特异性低脱氧核苷酸(ODN)阻断NF-κB活性,检测细胞表面分子表达以及混合淋巴细胞反应(MLR)检测其功能变化.结果 DM患者外周血培养获成熟DC数量较多,DC表面标志较正常对照表达升高,具有较强的激发MLR的能力,DC成熟高于正常人.但NF-κB ODN可以抑制DC表面标志的表达,阻碍DC发育成熟,降低激发MLR的能力,并不可被脂多糖(LPS) 所逆转.结论 DM患者DC免疫功能高于正常对照DC功能状态,NF-κB是DC发育成熟过程中关键性调控基因.应用NF-κB ODN可抑制DC成熟,诱导生成耐受原性未成熟DC.
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石蜡包埋组织切片原位核酸杂交研究
目的:探讨石蜡包埋组织切片的原位核酸杂交方法,以检测克山病(KSD)尸检心肌中的RNA.方法:应用生物素标记的人工合成寡核苷酸探针,对72例心肌石蜡包埋组织切片进行原位核酸杂交.结果:各型克山病心肌石蜡组织切片的阳性杂交信号为80%~87.9%,而正常对照仅为14.3%.结论:应用人工合成寡核苷酸之原位核酸杂交技术,对长期保存的石蜡组织进行回顾性研究是可行的.
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生物技术药物中残留DNA检测方法的比较
生物技术药物是所有以生物质为原料的生物活性物质及其人工合成类似物通过现代生物技术制得的药物,包括细胞因子、重组蛋白、抗体、疫苗和寡核苷酸等,临床上已开始广泛应用,为制药工业带来了革命性变化.但是生物技术药物中残留DNA可能存在安全性问题,因此应尽可能将产品中残留DNA的水平降到低.新版美国药典将推荐实时定量PCR法作为生物技术药物中宿主残留DNA检定的唯一标准方法.该法的技术优势在于序列特异性高、灵敏度高、重现性好,还可以实现定量检测,使得结果更为精确,从而为生物技术药物企业在工艺研究和成品质量控制方面提供了可靠的检测手段.此综述对4类检测方法进行了比较,重点比较两种实时定量方法.
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寡核苷酸芯片技术检测5种临床肠道病原菌的研究
背景:寡核苷酸芯片是一种检测病原菌的新技术,具有高通量、特异性等特点.目的:采用寡核苷酸芯片技术建立对5种临床常见肠道病原菌(霍乱弧菌、空肠弯曲杆菌、志贺菌、耶尔森菌、单核细胞增生利斯特菌)进行快速、准确鉴定和检测的方法.方法:选取16SrDNA作为检测靶基因,设计通用引物和寡核苷酸探针.病原菌基因组DNA通过16SrDNA通用引物行聚合酶链反应(PCR),扩增后与芯片上的探针杂交.结果:霍乱弧菌、空肠弯曲杆菌、志贺菌、耶尔森菌、单核细胞增生利斯特菌的杂交信号均很强,其他细菌无杂交信号.寡核苷酸芯片的检测时间约5h,其敏感性可达103CFU/ml.寡核苷酸芯片对23例临床腹泻样本的检测结果与传统细菌学培养结果完全一致.结论:寡核苷酸芯片的特异性、稳定性、重复性均较好,是检测临床肠道病原菌准确、可靠、实用性强的方法.
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乙型肝炎病毒基因多态性检测芯片的临床应用
在乙型肝炎病毒(HBV)持续感染的过程中,其基因组可自然地或在治疗诱导下出现各种变异而呈多态性,给乙型肝炎的诊断、治疗及判断预后带来许多临床问题.DNA芯片技术是近几年发展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法,我们根据HBV基因多态性位点及突变热点的几种可能突变情况,设计了多条寡核苷酸探针,与聚合酶链反应(PCR)扩增的HBV基因相应区段杂交,根据特定位置上杂交信号的有无和与之相应的探针序列来判定基因突变的类型.同时,测定了99例临床样本和40例献血员样本,取得了较满意的结果,现初步报告如下.
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中药天癸方对雄激素致不孕大鼠下丘脑Leptin受体及神经肽Y mRNA的影响(摘要)
目的 从基因转录水平探讨中药天癸方对雄激素致不孕大鼠(ASR)肥胖及无排卵的影响。方法 采用α-32P标记瘦素(leptin)受体(OB-R)及神经肽Y(NPY)寡核苷酸探针原位杂交、放射自显影技术结合图像分析,观察中药治疗前后下丘脑弓状核(ARC)两种物质tRNA的表达变化。结果 ASR中ARC的NPY基因表达水平明显增加(P<0.01),OB-R基因表达水平明显降低(P<0.01),ASR呈肥胖、无排卵状态。用中药天癸方治疗后,NPY基因表达下降,OB-R基因表达上升至正常大鼠水平。结论 ADR肥胖及无排卵可能与NPY mRNA过度表达、OB-R tRNA数目异常有关,中药可调节NPY和O1B-RmRNA表达而发挥减肥及促排卵作用。 [全文刊登于中国中西医结合杂志2000.20(5):362]
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检测7种疱疹病毒的基因芯片法及其初步应用
目的 建立一种快速分型检测临床常见的7种疱疹病毒的新方法.方法 以7种人疱疹病毒的DNA多聚酶基因区为靶序列,设计多重引物及寡核苷酸分型探针,点样制成基因芯片.用所建基因芯片检测282份疑似病毒感染患儿血标本,以荧光定量PCR法作对照,评价该芯片的诊断价值.结果 基因芯片法低检出浓度为10拷贝/μl,HBV、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌及人基因组DNA等无杂交信号.282份血标本共检出阳性59份,以荧光定量PCR法检测结果为标准,其敏感性为96.7%,特异性为99.5%,Youden指数为0.962;两法总符合率98.9%.结论 研制的基因芯片可同时检测7种人疱疹病毒,且特异敏感、快速简便,有临床应用价值.
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16S~23S rDNA间隔区序列寡核苷酸探针不同显色方法对结核患者痰标本的检测
目的评价16 S~23 S rDNA间隔区序列寡核苷酸探针碱性磷酸酶显色与辣根过氧化物酶化学发光法对结核患者痰标本检测的应用价值.方法采用生物素标记5′端18 bp的寡核苷酸探针斑点杂交的碱性磷酸酶显色反应及辣根过氧化物酶化学发光检测90例结核患者和30例非结核患者痰标本.结果痰标本基因组DNA直接与探针杂交,碱性磷酸酶显色反应检测阳性率为22.2%,辣根过氧化物酶化学发光检测阳性率为33.3%;痰标本经引物PL1、PL2扩增(扩增产物350 bp,)与寡核苷酸探针杂交,碱性磷酸酶显色反应检测阳性率为77.8%,辣根过氧化物酶化学发光检测阳性率为83.3%;痰标本经引物b扩增(扩增产物250 bp)与探针杂交,碱性磷酸酶显色和化学发光检测阳性率分别为75.6%、80.0%,检测的敏感性高于痰涂片.寡核苷酸探针与30例非结核患者痰标本DNA杂交则全为阴性.结论寡核苷酸探针和250 bp PCR扩增产物相结合,经化学发光显色是分枝杆菌检测的一种有效方法.
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反向斑点杂交技术快速鉴定泌尿生殖道致病性支原体的研究
目的 建立PCR反向斑点杂交方法(PCR-RDB)快速鉴定泌尿生殖道常见致病性支原体.方法 以4种支原体[微小脲原体(Up)、解脲脲原体(Uu)、生殖支原体(Mg)、人型支原体(Mh)]的16SrRNA基因为靶序列设计通用引物和探针,将4种特异的寡核苷酸探针固定于尼龙膜上.利用巢式PCR扩增Up、Uu、Mg和Mh,扩增产物变性后与各特异性探针进行杂交、显色并分析结果,并对检测体系的敏感性、特异性进行测试.同时检测分析60例临床拭子标本.结果 4种特异性探针只与相应的支原体DNA杂交,与其他病原体无交叉反应,其敏感性是1 CFU.60例临床拭子标本PCR-RDB方法共筛选出支原体阳性19例,其中3例为支原体混合感染的标本(Up+Uu 2例,Uu+Mg 1例).结论 该方法可快速、敏感、准确地鉴定引起泌尿生殖道感染的致病性支原体.
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反向斑点杂交技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体及基因分型
目的建立反向斑点杂交技术,对泌尿生殖道沙眼衣原体感染进行检测和基因分型.方法用0ligo软件设计寡核苷酸探针,采用巢式聚合酶链反应(PCR)扩增ompl基因的VS1-VS2序列,反向斑点杂交技术对沙眼衣原体进行检测和基因分型.结果巢式PCR扩增ompl基因的VS1-VS2序列的敏感性与质粒PCR符合率为98.2%(56/57).优选出11条型特异性(A、B+Ba、C、D、E、F、G、H、I、J和K)和3条群特异性寡核苷酸探针:B群(B、Ba、D和E型),C群(A、C、H、I、J和K型)和中间群(F和G型).特异性经过基因库中的BLAST程序比较和试验优化,结果显示各探针均与标准株呈特异性杂交.56例VS1-VS2 PCR阳性的临床标本杂交法检测均阳性,共检出59株沙眼衣原体,包括8个基因型,其中以E、F、D和H型为主,占77.9%,分别为25.4%,22.0%,16.9%和13.6%.发现3例混合感染占5.4%,分别为D/E、D/F和F/K.结论反向斑点杂交技术简便且快速,可直接对临床标本沙眼衣原体进行检测和基因分型.
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牙胚组织原位杂交方法学探讨
目的 探讨牙胚组织原位杂交的佳方法.方法 用牙本质涎磷蛋白DSPP特异性寡核苷酸探针,检测不同时期牙胚DSPP mRNA的表达.结果 各种牙胚的成牙本质细胞和前成釉细胞均检测到DSPP mRNA的表达,各阴性对照组均未检测到信号.结论 所用的牙胚组织原位杂交方法敏感性高,特异性高.
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99Tcm-hTERT mRNA反义分子探针荷MCF-7乳腺癌裸鼠显像
目的 制备99Tcm-人端粒酶催化亚单位(hTERT)mRNA反义寡核苷酸(ASON)显像分子探针并验证其在荷MCF-7乳腺癌裸鼠早期诊断中的价值.方法 采用双功能螯合剂法制备99Tmc hTERT mRNA无义寡核苷酸(SON)、ASON探针.建立荷MCF-7乳腺癌裸鼠模型,运用阳离子脂质体介导法进行活体显像.采用SPSS 12.0软件进行单因素方差分析.结果 99Trc-hTERT mRNAASON标记率达到(76±5)%,放化纯>96%,比活度达到1850 kBq/μg,室温放置和健康人血清孵育24 h后的放化纯均>93%,SON与ASON的标记率基本一致.注射后4 h反义组荷瘤裸鼠右上肢接种肿瘤部位可见放射性摄取,6-8 h后显影清晰;无义组始终未见肿瘤部位放射性浓聚.反义组有和无脂质体介导的肿瘤/非肿瘤组织放射性(T/NT)比值分别为8.02±0.03和7.55±0.12,差异无统计学意义(t=-1.99,P>0.05);无义组有和无脂质体介导的T/NT比值分别为1.23±0.06和1.33±0.15,差异无统计学意义(t=0.42,P>0.05).但是分别比较反义组与无义组、脂质体介导组与无介导组间差异均有统计学意义(t=26.30和28.71,P均<0.001).结论 99Tcm-hTERT mRNAASON在荷瘤裸鼠活体内可与高表达hTERT基因的人乳腺癌MCF-7肿瘤组织特异靶向结合,在肿瘤分子功能显像中具有潜在应用价值.
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多寡核苷酸探针同步标记在Northern blot多基因分析中的应用
目的:建立一种多探针同时标记同步杂交检测多基因的简化的Northern blot方法.方法:通过T4多聚核苷酸激酶5'末端放射性磷酸化标记法对Northern blot中多寡核苷酸探针同时标记,实现对同一张转移印迹膜上的多基因同步杂交显影检测.结果:与常规mRNA逐一检测的效果进行比较,同步简化法的各目的基因同时得到较好的检测.结论:同步简化法简化了实验过程,缩减了实验时间,节省了实验试剂,并使各基因表达丰度之间的比较具有更高的准确性,提高了Northern blot的检测效率和成功率.
关键词: Northern blot 寡核苷酸探针 多探针标记 多基因分析