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稳定过表达、干扰RN181的MHCC97L细胞系建立及RN181功能的初步研究
目的 构建过表达和干扰RN181基因的肝癌MHCC97L重组细胞系,并研究RN181对该细胞体外增殖的影响.方法 基于基因克隆技术,构建plncx2-GFP-IRES/RN181重组载体,常规鉴定后,与pVSV-G共转染GP2-293细胞包装逆转录病毒.该病毒与RN181干扰慢病毒分别感染MHCC97L细胞,流式分选表达绿色荧光的细胞,RT-PCR、Western blotting鉴定后,CCK-8实验和软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖情况.结果 重组载体构建成功,重组细胞荧光良好,RT-PCR、Western blotting分别证实重组细胞中RN181的mRNA和蛋白表达水平在重组细胞系间均出现差异有统计学意义(P＜0.05).增殖实验显示RN181上调后细胞生长减慢,克隆数也显著少于对照组(P＜0.05),而RN181干扰后上述现象可得到逆转.结论 成功构建了过表达和干扰RN181的MHCC97L重组细胞系,初步证实了RN181在体外对MHCC97L细胞增殖的抑制作用.
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汉坦病毒H8205株IL-2/G1融合基因在Vero细胞中的稳定表达
目的探讨外源性 IL- 2/G1融合基因在非洲绿猴肾细胞( Vero)获得稳定表达的可行性,为汉坦病毒基因工程疫苗的研制提供一定的实验基础.方法将汉坦病毒 H8205株 G1的 cDNA重组人源 IL- 2基因后克隆到真核表达载体 pcDNA3.1/His,形成重组真核表达质粒 pcDNA3.1/His- IL- 2- G1,在脂质体介导下,将其导入 Vero细胞,通过 G418筛选获得阳性克隆,并继续培养 6周,然后通过间接免疫荧光、 ELSIA、 SDS- PAGE电泳等方法检测 IL- 2- G1基因在 Vero细胞中的稳定表达情况.结果成功构建重组质粒 pcDNA3.1/His - IL- 2- G1,其片段插入方向正确.经间接免疫荧光和 SDS- PAGE电泳证实,转染了真核表达质粒 pcDNA3.1/His- IL- 2- G1后在 Vero细胞培养上清和胞浆中有融合蛋白的表达,其相对分子量为 78 000 u,与预期的相符合.经人 IL- 2 ELISA检测试剂盒检测证实在培养上清和细胞裂解物所表达的融合蛋白有 IL- 2特性. 结论在脂质体介导下,外源性 IL- 2/G1融合基因能够成功导入 Vero细胞并获得稳定表达.
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痘苗病毒D13L基因在BHK21细胞系中的稳定表达
目的建立稳定表达痘苗病毒D13L基因的细胞系.方法克隆D13L基因并将其插入真核表达质粒pEGFP-C2中构建重组质粒pEGFP-D13L,利用脂质体法转染BHK21细胞,G-418进行筛选,有限稀释法获取亚克隆细胞株.荧光显微镜观察和RT-PCR分析表达效果.结果D13L基因在细胞中稳定表达,连续传代10次后仍然能检测到其表达,荧光显微镜下能看到绿色荧光,RT-PCR可以得到1650bp大小的目的条带.结论筛选到了稳定表达D13L基因的细胞株,为下一步构建缺陷型痘苗病毒以及研究D13L基因的功能奠定基础.
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人Ⅰ型干扰素受体亚基稳定表达真核细胞的筛选及鉴定
目的:筛选及鉴定人Ⅰ型干扰素受体亚基(IFNAR1)稳定表达真核细胞.方法:体外扩增IFNAR1基因片段,将双酶切后扩增片段和pcDNA3.1(+)连接构建重组质粒pcDNA3.1-IFNAR1,转化BL21感受态细菌培养,提取重组质粒行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定.重组质粒pcDNA3.1-IFNAR1转染肝癌细胞系HepG2,新霉素筛选挑取阳性克隆细胞,蛋白质印迹试验(Western blotting)分析阳性细胞IFNAR1表达水平.结果:经双酶切和测序验证pcDNA3.1-IFNAR1重组质粒构建成功.pcDNA3.1-IFNAR1转染HepG2经新霉素筛选后获得稳定表达细胞系,蛋白质印迹试验(Westem blotting)证实这些细胞具有较好蛋白表达水平.结论:体外成功构建不同IFNAR1稳定表达水平的HepG2细胞.
关键词： 人Ⅰ型干扰素受体亚基 IFNAR1基因 重组质粒 稳定表达 真核细胞 -
小鼠FasL基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达
目的 构建含有小鼠Fas Ligand (FasL)基因的重组真核表达载体,并检测FasL蛋白在其稳定转染的HEK293细胞中的表达情况,为构建表达小鼠Fas L的树突状细胞(DC)模型,深入研究DC联合T细胞防治移植物抗宿主病(GVHD)的新方法奠定基础.方法 从小鼠脾脏中提取RNA并逆转录为cDNA,以该cDNA为模板扩增FasL基因,插入pcDNA3.1(+)载体中构建pcDNA3.1(+)-FasL重组质粒,利用脂质体将其转染HEK293细胞,用G418筛选稳定表达细胞系,Western blot确定重组蛋白的表达.结果 通过酶切及测序证实FasL序列正确插入表达载体pcDNA3.1(+),Westemblot检测证实转染重组质粒的细胞能正确表达FasL蛋白,G418筛选后能够得到稳定表达FasL的抗性细胞株即FasL-HEK293.结论 重组质粒pcDNA3.1(+)-FasL和稳定表达FasL的HEK 293细胞成功构建,为后续FasL-DC细胞的研究打下了坚实基础.
关键词： Fas ligand 基因转染 稳定表达 HEK293细胞 -
雌马酚舒张大鼠脑基底动脉的作用与机制
目的：探讨雌马酚对大鼠脑基底动脉的舒张作用与机制。方法：应用微血管张力仪和全细胞膜片钳技术，分别观察无或有钾通道阻滞剂时，雌马酚对5－HT诱导的脑基底动脉收缩和血管平滑肌大电导钙激活钾通道（ BKCa ）电流的影响，并比较雌马酚对转染人BKCa α亚单位或α与β1亚单位共转染的HEK293细胞电流的作用。结果：雌马酚以非内皮依赖的方式，浓度依赖性（10－10 mol／L～10－5 mol／L）舒张大鼠脑基底动脉，其作用被BKCa阻断剂paxilline和iberiotoxin明显减弱，而不受电压依赖性钾通道阻断剂4－AP或ATP敏感性钾通道阻断剂格列苯脲的影响。10－6 mol／L雌马酚明显增加脑基底动脉平滑肌细胞BKCa电流，此作用因同时应用iberiotoxin而逆转。10－6 mol／L雌马酚对仅表达BKCa α亚单位的HEK293细胞电流无影响，但小于10－6 mol／L可激活稳定表达BKCa α与β1亚单位的细胞电流，同时应用paxilline可使增加的电流完全抑制。结论：雌马酚通过作用于β1亚单位激活BKCa ，舒张大鼠脑基底动脉。
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糖皮质激素受体β对糖皮质激素受体α功能的影响及其意义
目的:通过研究糖皮质激素受体β对糖皮质激素受体α功能的影响,探讨糖皮质激素受体β可能存在的生物学意义.方法:(1)用瞬时转染技术将GRβ和报告基因cat共转染HOS-8603细胞,激素处理后,研究GRβ对糖皮质激素诱导GRα外源性靶基因cat表达的影响;(2)GRβ真核表达载体的构建及GRβ在HOS-8603细胞中的稳定过度表达;(3)用定量RT-PCR和Western印迹法检测糖皮质激素对HOS-8603细胞p21表达的诱导及GRβ的稳定表达对GRα内源性靶基因p21表达的影响;(4)用MPT法检测GRβ的稳定过度表达对糖皮质激素抑制HOS-8603细胞增殖作用的影响;(5)GRβ对糖皮质激素诱导HOS-8603细胞AKP(成骨细胞分化标志酶)活性的影响.结果:(1)GRβ抑制GRα外源性靶基因cat的表达,且具有剂量依赖性特点;(2)GRβ抑制GRα内源性靶基因p21的表达;(3)GRβ的稳定过度表达降低糖皮质激素抑制HOS-8603细胞增殖的作用;(4)GRβ的稳定过度表达抑制糖皮质激素对HOS-8603细胞AKP活性的诱导.结论:糖皮质激素受体β对糖皮质激素受体α的功能有抑制作用,糖皮质激素受体β可能是糖皮质激素受体α的内源性抑制因子.
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T淋巴细胞生与死的决定
目的:T淋巴细胞抗原受体复合物(TCD/CD3)介导的信号传递途径决定其生存与死亡,而TCR的刺激信号是通过CD3各亚基胞内区免疫酪氨酸受体激活基序(ITAM)传递的.国内外和本实验室的一系列研究发现CD3ε-ITAM中的两个酪氨酸(Y170,Y181)对T淋巴细胞的生存与死亡起不同的调节作用,其中任何一个或两个酪氨酸同时突变为苯丙氨酸均可影响T淋巴细胞激活,并阻断T细胞死亡的信号传递.T细胞接受抗CD3抗体刺激后,CD3ε-ITAM的Y170可募集Lck、3-磷酸肌醇激酶的P85α亚基和Shc,而Y181可募集ZAP70与其结合,从而介导不同的信号极联,决定细胞生(激活)或死(凋亡)的不同命运.方法和结果:在CD3ε介导的细胞凋亡过程中,凋亡基因Fas及其配体FasL的表达增加.进一步的研究发现,核转录因子Nur77在细胞激活时表达上调,在细胞接受持续刺激并出现凋亡时,Nur77的表达进一步增加.为阐明Fas、FasL和Nur77三者表达的相关性,建立了稳定表达Nur77的T细胞株,构建了Fas及FasL启动子驱动的荧光素酶报告基因表达载体并转染该细胞株,研究Nur77过量表达对Fas及FasL转录的影响,结果表明Nur77可以上调Fas的表达,但对FasL的表达没有影响.Nur77上调Fas的表达,从而增加了Fas+细胞和细胞凋亡.结论:Nur77具有决定细胞"生"(细胞激活)或"死"(细胞凋亡)的关键作用.
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结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究
目的:结核病疫情再度增高给结核病的防治提出了新的挑战,由于卡介苗对结核病的预防效果极不稳定,发展新型结核病疫苗势在必行,本研究通过对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行克隆与表达研究,旨在为结核病新型疫苗研制提供新的靶点.方法:根据结核杆菌H37Rv株免疫保护性抗原Ag85A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物,以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板通过PCR扩增获得具有完整开架读码框(ORF)的Ag85A抗原基因,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体pBKCMV构建重组质粒,重组质粒转入大肠杆菌后IPTG诱导表达,并对其表达产物进行Western-blotting分析.结果:①PCR扩增获得了具有完整开架读码框的Ag85A抗原基因;②构建了Ag85A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体;③Ag85A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达.结论:本研究成功地对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行了基因克隆与表达,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础.
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下调Sam68基因表达促进急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡
目的：探讨Sam68蛋白对白血病细胞Jurkat凋亡的影响。方法：针对Sam68靶点构建pLKO－Tet－On条件性真核表达干扰载体，制备慢病毒并感染Jurkat细胞，诱导干扰载体表达，筛选稳定表达shRNA细胞；采用实时荧光定量和免疫印迹技术检测干扰效率；应用流式细胞术检测细胞凋亡，采用免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白表达水平变化情况。结果：Sam68基因表达下调的细胞凋亡数量增多，伴随caspase－3活化水平增加和PARP活化水平下降，Akt磷酸化水平下降，Erk和Bcl－xL表达水平无明显变化。结论：Sam68基因表达下调可通过影响Akt信号通路影响caspase－3和PARP蛋白表达，从而促进Jurkat细胞凋亡。
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miR－630通过靶向MTDH抑制乳腺癌进程
目的：研究miRNA－630（miR－630）在乳腺癌中的表达水平及在乳腺癌发生发展中的功能。方法：采用反转录实时定量PCR方法对其在乳腺癌病人标本及乳腺癌细胞系中的表达进行检测；利用克隆形成实验、划痕实验、细胞迁移能力检测等方法对其在乳腺癌高转移细胞株MDA－MB－231及 BT549中的功能进行研究；利用慢病毒感染方法构建稳定表达miR－630的MDA－MB－231细胞株，研究其在小鼠体内转移能力；通过生物信息学分析、萤光素酶报告基因分析和Western blot方法对miR－630的靶基因进行筛选和鉴定。结果：miR－630在乳腺癌病人癌组织以及乳腺癌细胞株中的表达显著降低；在 MDA－MB－231和BT549细胞中过表达miR－630显著抑制细胞的克隆形成能力及迁移侵袭能力。在体内实验中，稳定过表达miR－630抑制MDA－MB－231细胞的肺转移能力。后， MTDH被鉴定为miR－630的靶基因，参与miR－630赋予细胞的各种功能。结论：miR－630通过靶向MTDH在乳腺癌的转移过程中发挥重要功能。
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人乙酰肝素酶稳定表达CHO细胞株的建立
目的 在CHO细胞中表达人乙酰肝素酶(HPA)并建立该酶的稳定表达细胞株.方法 在脂质体的介导下,用本实验室构建的pEGFP-N1-HPA重组质粒转染CHO细胞,经G418筛选稳定表达的细胞.通过荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况,同时通过RT-PCR检测HPA基因转录水平、免疫细胞化学法检测HPA蛋白表达、MTT方法测定外源基因对CHO细胞增殖的影响.结果 荧光显微镜下可见转染的CHO细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在HPA基因mRNA的表达,成功获得HPA的稳定表达细胞株.结论 成功建立人HPA稳定表达CHO细胞株,为该酶的功能研究奠定了基础.
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慢病毒载体介导的miR?126稳定高表达促进胃癌AGS细胞的迁移和侵袭
目的:构建稳定高表达miR?126的胃癌AGS重组细胞系,并研究miR?126在体外对该胃癌细胞系增殖、转移能力的影响.方法:构建慢病毒Lv?has?miR?126感染AGS细胞系,经qRT?PCR检测miR?126表达差异,确认miR?126稳定高表达重组细胞系构建成功后,应用CCK?8和平板克隆形成实验检测细胞体外增殖能力变化;Transwell迁移及侵袭实验检测细胞在体外的迁移、侵袭能力.结果:重组细胞系构建成功,绿色荧光表达良好,qRT?PCR证实重组细胞miR?126的表达水平较对照细胞显著增高(P<0.05).CCK?8增殖及克隆形成实验显示上调miR?126后胃癌细胞生长及克隆形成数无明显差异;而在迁移及侵袭实验中miR?126高表达组细胞迁移及侵袭能力显著高于对照组(P<0.05).结论:成功构建了稳定高表达miR?126的AGS重组细胞系,初步证实了miR?126具有促进胃癌AGS细胞迁移与侵袭的作用,提示miR?126可能与胃癌的转移密切相关.
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循环miRNA在结直肠癌诊断中的应用价值
结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，早期症状不明显，且目前缺乏有效的敏感性诊断指标，早期诊断率较低。随着近年来分子生物学的飞速发展，发现一类微小RNA（miRNA）与大肠癌关系密切，且其在血液循环中稳定表达，显示出特异的 miRNA 表达谱。从而使外周血中miRNA有望成为诊断结直肠癌潜在的新型生物标志物。本文就循环miRNA在结直肠癌中的诊断筛查、预后监测方面的进展做一综述。
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共聚物的应用和研究进展
随着分子生物学的飞速发展,基因治疗的研究备受人们关注,如何将目的基因安全、高效、靶向性地导入人体特定器官组织并在相应的靶细胞内稳定表达,是目前的研究热点之一.近年来,一些研究表明,共聚物可作为携带基因的载体,提高局部组织、细胞的基因转染和表达,在基因治疗上显示出诱人的前景.
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人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂在果蝇细胞中的稳定表达及鉴定
目的：在果蝇S2细胞中表达人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂（ SLPI ）并对其生物学性质进行初步测定。方法以A549细胞RNA为模板，利用反转录PCR方法扩增得到SLPI蛋白的编码序列，并将其克隆到表达载体pMT/V5-His A中，构建pMT/V5-SLPI 表达质粒，通过与抗性筛选质粒pCoHygro 共转染S2细胞，经潮霉素B筛选3～4周，得到能够稳定表达SLPI蛋白的多克隆细胞系。经CuSO 4诱导表达后，用RT-PCR及Western blot分析SLPI基因的转录和表达。结果获得了抗性稳定的多克隆S2细胞株S2/SLPI，CuSO4诱导后，RT-PCR证明SLPI在S2/SLPI细胞中能高效转录，Western blot 在细胞培养上清中检测到表达的重组SLPI蛋白。结论在果蝇S2细胞中成功表达了人SLPI，SLPI的成功表达为进一步开展SLPI促进免疫应答及其在抗病毒感染等方面的作用研究提供了重要基础。
关键词： 分泌性白细胞蛋白酶抑制剂 果蝇表达系统 稳定表达 -
一种以B细胞为基础并快速检测病原体的传感器
英国学者Todd等报告了一种以B淋巴细胞为基础、能快速灵敏地检测病原体的传感器,命名为细胞分析及抗原风险度产物的识别(cellular analysis and notification of antigen risks and yields,CANARY).先运用基因工程技术,从IgM阳性的B淋巴细胞系中构建出一株能在其胞浆中稳定表达维多利亚水母发光蛋白(该蛋白对钙离子敏感)的细胞;然后用带有抗体轻重链恒定区和可变区基因片段(该区对病原特异)的质粒进行转染,使其在细胞膜表面表达病原体特异性膜偶联抗体,经此第二次转染所得到的细胞能特异性识别相应的病原体,通过病原体与膜表面抗体的相互识别作用,使膜表面抗体交联,这种交联作用将在数秒内引起细胞内钙离子浓度增高,从而激发发光蛋白发光,通过对发光强度的测定即可达到对病原体进行定性、定量检测的目的.
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融合型自杀基因Fcy::Fur/5-FC对人卵巢癌细胞杀伤作用的研究
目的 研究融合型自杀基因Fcy::Fur联合5-氟胞嘧啶(5-FC)对人卵巢癌细胞株(SKOV3)的杀伤作用.方法 构建含有融合型自杀基因Fcy∶∶Fur的荧光真核表达质粒,转染SKOV3细胞,筛选稳定表达的细胞株,RT-PCR和Western blot检测Fcy∶∶Fur表达.以MTT法和FCM法检测5-FC对Fcy∶∶Fur转基因细胞的杀伤效应.结果 测序鉴定证实插入片段正确.细胞转染24 h后,60%转染细胞发出绿色荧光.经G418筛选,RT-PCR和Western blot法检测到Fey::Fur 表达.加入5-FC后,MTT法检测到明显杀伤效应,FCM法检测到显著凋亡峰.结论 融合型自杀基因Fey::Fur联合5-FC驿人卵巢癌细胞SKOV3有明显的刹伤作用.
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PDGF-A基因逆转录病毒载体的构建及其在猪骨髓间充质干细胞中表达的研究
目的 克隆血小板衍生生长因子A链(platelet-derived growth factor A chain,PDGF-A)基因,以逆转录病毒载体pLXSN为骨架携带PDGF-A基因转染猪骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs),为应用PDGF-A基因修饰bMSCs进行创面修复奠定基础.方法 采用RT-PCR二步分离法,以人肝癌细胞总RNA为模板,扩增PDGF-A基因的全长cDNA编码序列,构建PDGF-A基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并将其导入病毒包装细胞PA317中,经G418筛选并扩增,以病毒液感染NIH3T3细胞,选出抗性克隆,测其病毒滴度,将高滴度病毒液感染bMSCs.采用RT-PCR、Southern blot和ELISA法,分别检测PDGF-A基因转染bMSCs的效率及PDGF-A在bMSCs中的表达水平;光镜、MTT法、成骨与成脂诱导分别检测bMSCs转染PDGF-A基因后的生长状态、增殖情况及干细胞特性.结果 经测序验证,克隆到PDGF-A基因的全长cDNA序列与GenBank所报告的该基因序列完全一致.成功构建了PDGF-A链基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并实现了PDGF-A基因在bMSCs的稳定表达.bMSCs转染PDGF-A后的生长状态、增殖情况良好,且仍具干细胞特性.结论 成功地将PDGF-A基因克隆到pLXSN载体中,并实现了PDGF-A基因在bMSCs中的稳定表达.bMSCs转染PDGF-A后仍具于细胞特性.
关键词： 逆转录病毒载体 血小板衍生生长因子A链基因 骨髓间充质干细胞 稳定表达 -
慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建
目的 利用慢病毒载体系统构建稳定表达HIF1α的A549细胞系.方法 以NCBI人HIF1α基因编码序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增HIF1α.酶切回收的HIF1α片段与制备的慢病毒载体HBLV-RFP-Puro重组反应.PCR和基因测序鉴定重组质粒.重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞.包装好的病毒经过滤、浓缩后,利用稀释计数法测定病毒滴度.制备好的慢病毒感染A549细胞,采用药物筛选稳定转染细胞系.荧光显微镜及Western blot检测观察转染及筛选效果.结果 PCR扩增HIF1α片段经鉴定成功,重组质粒经PCR、基因测序鉴定构建成功.成功包装获得高滴度LV-HIF1α.LV-HIF1α感染A549细胞后经药物筛选,荧光显微镜下细胞带有红色荧光,Western blot结果显示LV-HIF1α组HIF1α的表达水平明显高于对照组.结论 慢病毒载体介导HIF1α稳定表达的A549细胞系构建成功.
