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海藻糖用于小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的研究
目的 探讨海藻糖对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的影响. 方法 采用12只小鼠控制性超排卵获得的360枚成熟的卵母细胞,分别放入含1.0、0.5、0.3及0 mol/L的海藻糖中孵育3h.部分卵母细胞进行碘化丙啶(PI)染色；320枚卵母细胞进行玻璃化冷冻和复苏,并进行体外受精,观察卵母细胞成活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率. 结果 0.3 mol/L海藻糖组复苏率、受精率与对照组无显著差异(92.59％ vs.90.90％,70.67％ vs.61.43％),但是卵裂率、囊胚形成率均高于对照组(83.02％ vs.44.19％,72.72％ vs.47.37％)(P＜0.001)；0.5 mol/L海藻糖组复苏率、受精率、囊胚形成率与对照组无显著差异,但是卵裂率高于对照组(65.22％ vs.44.19％)(P＜0.05)；0.3 mol/L海藻糖组囊胚形成率高于0.5 mol/L海藻糖组(72.72％ vs.50.00％)(P＜0.001);1.0 mol/L海藻糖组卵母细胞复苏率、受精率、卵裂率、囊胚形成率均低于对照组低(P＜0.001). 结论 一定浓度范围的海藻糖对小鼠卵母细胞的玻璃化冷冻有保护作用,0.3 mol/L海藻糖浓度比较适合小鼠卵母细胞玻璃化冷冻.
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三种人精子优化方法对精子参数及获能比较研究
优化处理精子是决定卵细胞受精率高低，受精卵卵裂好坏的前提［1］，而提高精子体外活动能力又是精子能否具有受精能力的重要指标，精子在体外培养基中孵育一段时间后，充分获能才具有受精能力。本研究观察3种方法优化精子及精子在体外获能过程，探讨在体外受精(IVF)胚胎移植(ET)过程中较合适的精子处理方法。
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ASC:180SE化学发光免疫分析仪常见故障排除
康宁 ASC: 180SE是一台任选式免疫分析仪,由一个自动处理轨道移动一次性的测试反应皿,移动中完成预热、加样、加试剂、孵育、分离以及测定过程,样本和试剂探针用来执行所有转运样本和试剂的动作,在进行磁性分离和清洗颗粒之后,加入试剂开始化学发光反应,光度计累积 5秒钟的信号,通过标准曲线将数据还原.
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AIA600Ⅱ免疫发光仪故障一例
故障现象:仪器开始工作不久,出现异常声音,自带打印机提示EMERGENCY ERROR:PICK-UP FAILUAR,并且不停打印乱码.故障维修:操作人员关机后打开仪器,发现孵育盘处有吸头卡住.取下吸头重新开机,仪器经自检后开始工作,不久仪器打印机提示EMERGENCY ERROR:ROTOR,并且不停打印乱码,关机后打开仪器检查,发现有一检测杯斜立于孵育盘内.
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低温冷冻和孵育对人精子氧化应激水平的影响
目的:探讨低温冷冻和孵育对人精子氧化应激水平的影响.方法:60份精液,每份分成5份分别列入5组(处理前对照组、低温冷冻空白实验组、低温冷冻样本组、孵育空白实验组和孵育样本组).以晚期氧化蛋白产物(AOPP)为蛋白氧化指标,丙二醛(MDA)为脂质过氧化指标,用分光光度法分别检测AOPP和MDA的水平.结果:低温冷冻样本组MDA水平明显高于处理前对照组和低温冷冻空白实验组(P＜0.05),但AOPP水平无明显差异(P＞0.05).孵育样本组AOPP和MDA水平均高于处理前对照组、孵育空白实验组及低温冷冻样本组 (P＜0.05).结论:精子的低温冷冻和孵育,均存在氧化应激损伤.低温冷冻主要造成精子的脂质过氧化损伤,孵育可致精子的脂质过氧化损伤和蛋白氧化损伤.
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真空负压法在ER、PR免疫组化染色中的应用
免疫组化染色是一个较为复杂的过程,步骤繁多,染色时间较长.为此,我们采用真空负压法对ER、PR做免疫组化染色,并在一抗孵育及切片洗涤方法上加以改进,取得了良好效果,现介绍如下.
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EDTA缓冲液在原位杂交中的应用
蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,以增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时,都会对细胞的结构有一定的破坏,导致组织切片的脱落,细胞核的消失,从而影响杂交结果.EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用,解决上述出现的问题,并能达到理想的染色效果.
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免疫组化技术(三)
2.3 标记物2.3.1 酶标记酶是在免疫组化中广泛使用的标记.通过标准的免疫组化方法,酶能够与色原一起进行孵育,产生适用于光学显微镜的稳定有色的反应终产物.
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中性红摄入法检测幽门螺杆菌空泡毒素活性
空泡变性细胞毒素(VacA)是幽门螺杆菌(H. pylori)分泌的一种重要毒素,其相对分子质量(Mr)约为(87～95)×103,初发现该毒素与哺乳动物细胞共同孵育后可导致细胞内产生大量的空泡.既往多采用光学显微镜下直接计数空泡形成细胞的比例来评价VacA活性,我们采用中性红摄入法(Neutral red uptake assay, NRU)对Hp菌株VacA进行定量检测,评价该方法检测VacA活性的应用价值.
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流式细胞术用于细菌抗生素敏感性试验的初步探索
大肠埃希菌ATCC25922、临床分离头孢噻肟(CTX)敏感大肠埃希菌7771、7880、CTX耐药大肠埃希菌7992与浓度范围为(0.015～128)μl/ml的CTX于35℃孵育2?h后,用碘化丙啶(PI)标记上流式细胞仪检测.在一系列药物浓度作用下,各菌株的碘化丙啶荧光强度(MFI)随着药物浓度的升高呈现递增的变化趋势,但是,当抗生素浓度过高,如大于其小抑菌浓度(MIC) 8倍时,菌细胞门所占比例将明显减少,MFI值也会显著下降,表明在高浓度抗生素持续作用下,较多细菌死亡后,菌细胞被裂解.
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温度对快速碱性磷酸酶染色灵敏度的影响
中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色对鉴别诊断血液病具有重要价值.萘酚AS-BI磷酸底物法NAP染色孵育仅15min[1,2],为孵育时间短的快速NAP染色方法,其染色温度为室温[1,2],与其他NAP染色方法[3-5]的37℃不同.本文对比分析37℃、30℃、20℃孵育时该染色的积分差异,以确定其适宜温度.
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温度对精子动态分析结果的影响与排除
中国误诊学杂志社编辑部:精子的动态分析对环境温度的要求很高,在实验检查过程中,由于精子的分析计数板的温度低,很难达到37℃,在进行精子动态分析过程中,极易造成对分析结果的影响,致使结果误差[1-2].为解决这一问题,我们采用孵育精液的同时,进行计数板的孵育,这既减少了误差,又提高了准确性,介绍如下.
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从胆汁中分离出一株酪黄肠球菌
2001年3月,我们从一胆石症患者的胆汁中分离出1株酪黄肠球菌(E.casseliflavus),报告如下.患者,男,65岁,汉族,因急腹症入院.查体,WBC 1.8×109/L,N 0.8,L 0.2,B超提示为胆石症.行手术治疗,术中无菌收取胆汁3 ml,注入肉汤中(OXID)增菌,同时接种血平板和麦康凯平板.置35℃孵育24 h后,肉汤增菌瓶明显混浊,遂移种于血平板和麦康凯平板,35℃ 24 h孵育,有湿润、圆形、凸起,直径为0.7 mm左右的菌落生长,α溶血、产生黄色素.涂片染色为革兰阳性链球菌.
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多粘菌素B及其模拟肽体外抗内毒素的实验研究
目的:观察PMB及其模拟肽处理前后FITC-LPS与PMBC的结合能力及培养上清中IL-6、TNF α的含量变化.方法:LPS(或FITC-LPS)100μg/L分别与PMB100 mg/L、peptide 0 100 mg/L、peptide 1 100 mg/L、PBS,37℃孵育30 min后(分别加入50 mL/L NHS)刺激PBMC,用流式细胞仪检测FITC-LPS与PBMC的结合能力及CD14表达;ELISA法检测培养上清中细胞因子TNF α、IL-6含量.结果:FITC-LPS分别与PMB、peptidel孵育后,细胞膜平均通道荧光显著减少,LPS与PBMC的结合能力显著降低(分别为8.1±1.8 vs 15.8±4.5 P＜0.01;8.5±2.0vs15.8±4.5 P＜0.01).100μg/L LPS刺激PBMC3h后CD14阳性率明显增加;LPS分别与PMB和peptidel预孵育后可显著降低LPS刺激PBMC细胞膜CD14表达(分别为45.5±6.2%vs68±5.5%P＜0.01;43.2±4.1%vs68±5.5%P＜0.01).LPS刺激PBMC分泌TNF-α和IL-6显著增加,LPS分别与PMB和peptidel预孵育后能显著减少细胞因子TNF-α(分别为15.30±1.0vs45.9±5.7 P＜0.01;18.2±0.9vs45.9±5.7P＜0.01)和IL-6分泌(分别为50.5±4.2 vs176.4±12.1 P＜0.01;58.1±4.1 vs176.4±12.1 P＜0.01).结论:多粘菌素B及其模拟肽(Peptidel)可能通过下调PBMC CD14表达,降低细胞因子水平来减少LPS诱导的炎症反应.
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牛磺酸脱氧胆酸损伤线粒体诱导HepG2细胞凋亡
目的:探讨牛磺酸脱氧胆酸(TDCA)诱导HepG2细胞凋亡的分子机制.方法:应用HE染色、电镜和DNA电泳对细胞凋亡定性;应用流式细胞仪对细胞凋亡定量;检测TDCA诱导HepG2细胞凋亡过程中,线粒体细胞色素C释放及凋亡特异性蛋白酶Caspase-3、8、9活性的变化.结果:TDCA 400μmol/L孵育12 h可诱导显著HepG2细胞凋亡,凋亡率为50.4±2.20%;TDCA诱导HepG2细胞凋亡过程中,线粒体细胞色素C释放呈时间依赖性增加,同时伴有Caspase-9,3蛋白酶活性显著增高,Caspase-8活性仅轻度增高.结论:启动线粒体细胞色素C释放及随后激活Caspase-9途径,可能是TDCA诱导HepG2细胞凋亡的主要机制.
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幽门螺杆菌对肝细胞系HepG2 cyclinD1,PCNA mRNA表达的影响
目的:研究幽门螺杆菌(H pylori)处理对肝细胞系HepG2cyclinD1,PCNA mRNA表达的影响.方法:将H pylori与HepG2共同培养1 h、3 h、6 h、12 h和24 h,采用半定量RT-PCR方法分析共培养不同时间后HepG2 cyclinD1,PCNA mRNA的表达水平.结果:CagA++H pylori与HepG2细胞共同孵育1 h后,即可见cyclinD1 mRNA表达升高,3h达高峰,约为对照的4.0倍(P＜0.01);共同孵育3 h后即可见PCNA mRNA表达升高,6h达高峰,约为对照的2.0倍(P＜0.05).而CagA-Hpylori和HepG2细胞共同孵育后,未见两基因的表达升高.结论:CagA+H pylori能诱导HepG2 cyclinD1,PCNAmRNA表达升高,提示其在肝癌的发生中起一定作用.
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丁酸钠对结肠上皮细胞凋亡的影响
目的:探讨丁酸钠对正常及炎症结肠细胞凋亡的影响.方法:(1)杀死SD大鼠.分离其结肠黏膜,悬于Ussing槽中,维持温度为37.0±0.5℃,并通100%O2.黏膜面给予4%乙酸孵育,以Ringer液稀释,并给予大鼠自体血液,浆膜面用Ringer液孵育.(2)分离大鼠的正常及炎症结肠,给予或者不给予丁酸钠,使用TUNEL试剂盒来检测结肠表皮细胞的凋亡.结果:乙酸孵育无丁酸钠组,结肠上皮细胞的凋亡率为25.37±2.38;乙酸孵育给予丁酸钠组,结肠上皮细胞凋亡率为10.58±1.07,二者相比P＜0.05.正常结肠上皮细胞未给予丁酸钠组,凋亡率为10.35±1.07;乙酸孵育给予丁酸钠组,凋亡率为3.78±1.07,二者相比P＜0.05.结论:丁酸钠能抑制结肠上皮细胞的凋亡.
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干扰素-α对人肝癌细胞增殖及侵袭的抑制作用
目的:研究人干扰素-α对人肝癌细胞系BEL-7402细胞增殖及侵袭的抑制作用.方法:常规培养的BEL-7402细胞加入人干扰素-α(1×106U/L)共同孵育24 h后,以MTT法检测干扰素-α对肿瘤细胞增殖的影响;Boyden小室法检测肝癌细胞侵袭能力的变化;明胶酶谱法检测肝癌细胞基质金属蛋白酶的变化.免疫组化法检测肿瘤细胞增殖核抗原的表达;TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡.结果:人干扰素-α可以明显抑制体外BEL-7402细胞的增殖(抑制率为20.2%);干扰素-α作用后在Boyden小室穿膜的肿瘤细胞数明显减少(抑制率为23.9%);肝癌细胞基质金属蛋白酶的分泌没有明显变化.干扰素-α组肿瘤细胞增殖核抗原的表达明显下降,凋亡细胞数明显增加.结论:低剂量的干扰素-α可以直接抑制肝癌细胞株BEL-7402的增殖,对BEL-7402细胞的侵袭有明显的抑制作用;可以抑制肿瘤细胞增殖核抗原的表达并诱导细胞凋亡.
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幽门螺杆菌对胃上皮细胞Cox-2表达与凋亡的影响
目的:研究Cox-2在胃癌细胞中及胃黏膜组织中表达的意义,探讨其表达与胃上皮细胞凋亡的关系.方法:将粗制H pylori总蛋白与胃上皮细胞株MKN28,AGS共同孵育,用RT-PCR及免疫组化染色法测定孵育前后细胞Cox-2表达的情况,同时检测了40例患者胃镜活检胃黏膜病变标本的Cox-2蛋白的表达及Hpylori感染情况.用流式细胞术观察H pylori、选择性Cox-2抑制剂NS-398及二者共同诱导细胞凋亡的情况.结果:与Hpylori孵育后的MKN28细胞株中Cox-2表达增加;Cox-2蛋白在与Hpylori共同孵育前后的MKN28细胞株中表达强度分别为0.26和0.40(P＜0.05),AGS细胞中为0.29和0.31(P＞0.05);Cox-2在胃癌中的表达明显高于浅表性胃炎(CSG)、萎缩性胃炎(CAG)组(P＜0.05).流式显示,与Hpylori孵育24,48 h MKN28细胞凋亡率分别为1.0%和5.7%(P＜0.01);与10,100,200 μmol/L NS-398孵育24 h及48 h的MKN28细胞凋亡率分别为1.2%,14.0%,27.5%及1.5%,31.2%,51.8%,具有浓度、时间依赖性(P＜0.01).与Hpylori,NS-398共同孵育24,48h的MKN28细胞凋亡率分别为12.2%,25.0%,其凋亡率低于单用NS-398(P＜0.01).结论:H pylori感染上调MKN28细胞中Cox-2的表达;Cox-2基因可抑制细胞凋亡,在胃癌发生发展过程中起重要作用,可能为胃癌形成的机制之一.
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糖尿病中性粒细胞粘附分子表达与血小板微小颗粒的研究
当中性粒细胞受到活化时，表达粘附分子CD11/CD18、CD62L、CD44等，并与血管内皮细胞粘附，向血管外游走。高切应力作用下血小板释放具有促凝活性的微小颗粒［1］。血小板微小颗粒(PMP)与活化的凝血因子Va、Xa形成促凝血活酶复合物，促进血液凝固［2］。PMP与糖尿病动脉硬化有密切关系［3］。凝血调节素(TM)是内皮细胞损伤标志［4］。微血管损伤疾病中，TM水平明显增加［5］。然而，糖尿病中性粒细胞粘附分子、PMP、TM之间关系尚不清楚。本研究主要探讨糖尿病的中性粒细胞粘附分子、PMP、TM之间的关系。 一、对象与方法 1.对象：糖尿病患者20例(男11例，女9例，平均年龄35岁，均有微血管并发症)，正常人20例。 2.方法：(1)采静脉血10 ml，用淋巴细胞分离液分离中性粒细胞，用1%甲醛固定。用免疫球蛋白阻滞Fc受体。用CD11a、CD11b、CD62L单克隆抗体孵育。用FITC荧光素标记，用流式细胞仪检测。(2)同上方法分离血小板之后，加入FITC标记的Ib/Ⅸ单克隆抗体，用流式细胞仪检测。计算104个血小板的微小颗粒。(3)用TM-MoAb20室温下包被微孔板，用含0.05% Tween 20的PBS洗涤，用含0.02% BSA和0.05% Tween 20的PBS室温孵育。加入检测标本，加入邻苯二胺，室温孵育。用1mol/L H2SO4终止呈色反应。用492nm测吸光度。
