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子宫颈癌端粒酶活性与bcl-2和bax蛋白表达相关性研究
目的:探讨端粒酶检测在宫颈癌诊断中的作用及其在宫颈癌发生中与bcl-2和bax蛋白表达的相关性. 方法:用原位杂交方法检测端粒酶的表达及其活性,采用免疫组织化学技术SABC法检测bcl-2和bax. 结果:端粒酶在宫颈癌中的表达率明显高于癌前病变(P<0.01)和宫颈良性肿瘤.端粒酶活性与bcl-2表达负相关,与bax表达显著负相关,与bcl-2/bax比值明显正相关. 结论:bcl-2/bax表达失衡(比值增大)可能是端粒酶激活的重要途径之一.
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原癌基因c-erbB-2在胆管癌细胞中的表达
目的:研究c-erbB-2基因在胆管癌细胞中的表达.方法:应用免疫细胞化学SABC法检测两株人胆管癌细胞(QBC-939和SK-ChA-1)、21例原代培养人胆管癌细胞和6例原代培养人正常胆管细胞中c-erbB-2蛋白的表达情况.结果:免疫细胞化学检测结果,c-erbB-2在QBC-939细胞和SK-ChA-1细胞中表达均为阳性;21例原代培养人胆管癌细胞中有18例(86%)表达阳性,3例表达阴性,6例原代培养人正常胆管细胞中c-erbB-2蛋白的表达均为阴性.结论:c-erbB-2蛋白在胆管癌组织中为诱导性表达,其表达上调与胆管癌的形成关系密切.
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原癌基因c-erbB-2蛋白在肝外胆管癌组织中的表达及临床意义
目的:研究原癌基因c-erbB-2产物在肝外胆管癌组织、癌旁胆管组织及正常胆管组织中的表达,探讨c-erbB-2原癌基因与肝外胆管癌发生与发展的关系.方法:应用免疫组织化学SABC的方法,检测了75例肝外胆管癌组织,48例癌旁胆管组织和9例正常胆管组织中原癌基因c-erbB2的表达水平.结果:c-erbB-2基因在肝外胆管癌组织高达80%(60/75),而癌旁胆管组织中的阳性表达率为56%(27/48),正常胆管组织中为阴性表达(0/9),其差异有极显著性意义(P＜0.01);在肝外胆管癌组织中,c-erbB-2的表达与肿瘤的恶性程度及淋巴结和远程转移正性相关,差异有显著性意义(P＜0.05);c-erbB-2在有周围神经浸润的肿瘤中的表达率明显高于无周围神经浸润的肿瘤,差异有显著性意义(P＜0.05);c-erbB-2在高组织学分级肿瘤(Ⅲ、Ⅳ)中的表达率显著性高于低分级肿瘤(Ⅰ),差异有显著性意义(P＜0.05);c-erbB-2表达与肿瘤大小、肿瘤部位、性别、年龄及有无血管浸润等临床病理指标间的差异无显著意义(P＞0.05).结论:c-erbB-2基因的活化与肝外胆管癌的发生和发展密切相关;因c-erbB-2表达水平与肝外胆管癌恶性程度,神经浸润,淋巴结及远程转移密切相关,为一种肿瘤生物标志,c-erbB-2的表达分析在该类肿瘤的诊断,治疗和预后分析中具有潜在的重要临床应用价值.
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补肾方对成骨细胞生长因子TGF-β1mRNA 表达的影响
目的:探讨补肾方对成骨细胞转化生长因子-β1 (TGF-β1)mRNA 表达的影响.方法:将体外分离培养的新生SD 大鼠的颅骨成骨细胞加入不同浓度的补肾中药密骨片药液(100～ 10 000 μg·m l- 1) 及阳性对照药物重组碱性成纤维细胞生长因子( rbFGF).24 min后, 利用自行制备的地高辛标记的鼠TGF-β1cDNA 探针进行成骨细胞的核酸分子原位杂交分析, 以其细胞内杂交阳性颗粒的平均光密度值代表TGF-β1 mRNA 的表达水平.结果:结果显示随着密骨片药液浓度的增加, 成骨细胞内TGF-β1 mRNA 表达明显高于阴性对照组; 但5 000 和1 000 μg·m l- 1的密骨片药液组的TGF-β1光密度值与5 ng·m l- 1的bFGF 组比较无明显差异(P＞ 0. 05).结论:表明补肾中药密骨片可刺激成骨细胞TGF-β1 的分泌和合成, 从而促进骨形成和抑制骨吸收.这可能是该方能有效地防治骨质疏松的疗效机制之一.
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骨质疏松性骨折骨痂软骨细胞CD44、FN表达的实验研究
目的:探讨骨质疏松性骨折愈合过程中胞内信号因子CD44及其配体FN在骨痂软骨细胞的表达情况.方法:建立28只SD大鼠骨质疏松性股骨骨折愈合模型作为实验组以及28只二期股骨骨折愈合模型作为对照组,分别于骨折后的d 10、d 20、d 30、d 40取材,对骨痂进行HE染色及CD44、FN免疫组化染色.结果:在骨痂组织中CD44和FN的表达及分布在时空上有一致性.在实验组中,随着骨折愈合进程的发展,软骨细胞CD44与FN的表达逐渐减少,而对照组中,CD44与FN共同表达于骨折愈合各阶段的各区软骨细胞中.结论:大鼠骨质疏松性骨折愈合过程中骨痂软骨细胞CD44、FN的表达明显弱于正常二期骨折愈合过程中的表达,提示:CD44、FN在软骨细胞中表达的明显减少可能是造成骨质疏松性骨折骨痂软骨组织向骨组织演变缓慢的原因之一.
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大鼠缺血心肌KCNE基因表达变化及瑞舒伐他汀对其影响
本实验通过检测急性心肌梗死(AMI)后梗死区周围左室心肌KCNE1、KCNE2的基因表达的变化及瑞舒伐他汀对其表达的作用,探讨心梗后心律失常发生和抗心律失常可能机制.
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2,5-己二酮抑制大鼠卵巢颗粒细胞干细胞因子的表达
目的 研究2,5-己二酮对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及干细胞因子(SCF)表达的影响.方法 21日龄清洁级雌性SD大鼠10只,提取卵巢颗粒细胞混合后,均匀接种到六孔板培养,设立1个对照组和3个实验组,培养24 h后分别加入浓度为0、20、40、60 mmol/L的2,5-己二酮染毒24 h,Hoechst 33258荧光染色计算细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测SCF、Bax、Bcl-2基因mRNA相对表达量.结果 各染毒剂量组卵巢颗粒细胞凋亡率增高,差异有统计学意义(F=221.23,P＜0.05).SCF基因mRNA的相对表达量在40、60 mmol/L剂量组呈下降趋势,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).Bcl-2基因mRNA的相对表达量随染毒剂量增加呈下降趋势,各剂量组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).Bax基因mRNA的表达量和Bax/Bcl-2比值随着染毒剂量增加呈上升趋势,各剂量组与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 2,5-己二酮染毒可致卵巢颗粒细胞凋亡率增高,抑制SCF基因表达,SCF/c-Kit信号通路可能参与此过程.
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尼古丁对牙周膜成纤维细胞线粒体信号通路的影响
目的 探讨尼古丁诱导的牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts,PDLFs)凋亡的信号转导机制.方法 本研究用0.001,0.01和0.1 g/L不同浓度的尼古丁干预PDLFs细胞24 h后,采用激光扫描共聚焦显微镜检测尼古丁实验组干预PDLFs细胞后Ca2+水平的变化,运用RT-PCR方法检测Bcl-2,BAX和Caspase3转录水平的表达变化,用Western blot检测Caspase3翻译水平的表达变化.结果 尼古丁作用于PDLFs细胞24 h后,细胞内Ca2+水平随着尼古丁剂量而逐渐增加;Bcl-2表达下调,而BAX表达上调;Caspase3转录和翻译增加.结论 尼古丁与PDLFs细胞结合后,启动了促凋亡程序,发生细胞凋亡事件,这可能是吸烟人群牙周病高发的分子机制之一.
关键词： 尼古丁 基因表达 细胞凋亡 牙周膜成纤维细胞/PDLFs 牙周病 -
综合治疗一例急性脑辐射损伤临床分析
一例医源性急性脑辐射伤受害者,经抗辐射、恢复造血功能等综合治疗,患者获得新生.在这次抢救治疗中,首次使用天然抗辐射复方制剂(chitosan)及rhG-CSF,通过bcl-2基因表达等指标检测取得了令人满意的临床疗效,为辐射防护药剂的研制提供了新的数据.
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染矽尘大鼠肺组织匀浆一氧化氮含量、一氧化氮合酶活力的研究
研究表明[1],当暴露于矽尘等炎性刺激物作用时,肺泡巨噬细胞和肺中性粒细胞一氧化氮(nitricoxide,NO)生成增加,并上调诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide,iNOS)基因表达.但是,有研究[2]认为矽尘并不能够直接增加培养的肺泡巨噬细胞产生NO;还有研究认为NO可能是肺纤维性结节形成的调节因子[3].这些研究提示NO及NOS的变化与矽尘对肺的作用有关.本研究测定了染尘后不同处理时点肺匀浆NO含量和NOS活力,并进行相关分析,以期能有助于解释矽尘对肺的作用.
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微观数字解剖学创新成像工具-光学投影托模成像(OPT)显微镜虚拟人体进入基因研究领域
作为无创诊断工具的临床影像技术发展很快,MRI以及PET均有很大发展.但是这些工具的目标是针对人体的全部、器官、组织块或者脑部具有代谢活性的组织,即系统解剖学.随着基因编序的完成以及基因表达研究的深入,超越系统解剖学的微观世界医学影像的革命正在进行.科学家要研究分子级的人体奥秘,对于小动物影像研究呈指数增长态势.
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慢性阻塞性肺疾病易感性与中国汉族人白细胞介素-13基因多态性的关联研究
目的探讨中国人白细胞介素(IL)-13基因单核苷酸多态性(SNP)与慢性阻塞性肺疾病(COPD)易感性的关系.方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析及PCR-单链构像多态性分析(SSCP)方法,检测94名健康吸烟者和88例吸烟COPD患者IL-13基因启动子1103C/T、4257G/A、4738G/A SNP位点基因型分布情况;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆IL-13水平.结果 COPD组与对照组4257G/A、4738G/A位点基因型分布频率和等位基因频率差异无显著性( P＞ 0.1);对照组1103C/T位点CC基因型频率及C等位基因频率高于COPD组( P＜ 0.05),C等位基因相对于T等位基因患COPD的机会比为 0.56(95%CI∶ 0.34～ 0.91).血浆 IL-13浓度与4257G/A及4738G/A 位点基因型无关( P＞ 0.1),1103CC基因型携带者血浆IL-13水平显著低于另外两种基因型携带者( P＜ 0.05).结论中国人 IL-13基因1103C/T位点基因型与COPD易感性有关,1103CC基因型携带者血浆 IL-13水平相对较低,COPD易感性低.
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实验性氟中毒骨组织中Ⅱ型胶原基因表达及结构的改变
目的观察过量氟对大鼠骨组织中Ⅱ型胶原基因表达的影响和对大鼠骨骼中胶原类型及胶原结构的作用.方法制备Ⅱ型胶原cDNA探针,采用cDNA-mRNA原位杂交技术,检测饮用过量氟水(氟化钠221 mg/L)的大鼠骨组织中Ⅱ型胶原的改变.采用苦味酸天狼星红染色-偏振光法对骨组织中胶原类型及胶原纤维结构进行观察.结果染氟后,股骨等骨组织出现成软骨细胞.cDNA-mRNA原位杂交显示,软骨化的骨组织软骨陷窝的软骨胞质中可见Ⅱ型胶原基因表达.染氟0.5个月组肋软骨软骨细胞胶原mRNA水平高,其灰度值和标准误分别为0.086和0.013,染氟1个月及2个月后逐渐减弱,其灰度值和标准误分别为0.047、0.008和0.039、0.007.苦味酸天狼星红染色-偏振光法观察骨组织中出现多色性Ⅱ型胶原纤维,胶原纤维断裂、排列紊乱、含量下降.结论过量氟可致骨组织中胶原类型和胶原结构的改变,导致Ⅱ型胶原在软骨化骨组织中的表达及在肋软骨组织中的表达增强.
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三种丙型肝炎病毒核蛋白在人肝癌细胞的表达
目的用基因芯片分析丙型肝炎病毒(HCV)三种基因型HCV-1b、HCV-2a和HCV-4d核蛋白在人肝癌细胞系(Huh-7)的基因表达,重新认识HCV 核蛋白功能及其致病机制.方法建立表达HCV三种基因型核蛋白的Huh-7细胞系,提取总RNA制备探针,与Affymetrix人基因芯片HG-U133 杂交.对基因表达改变≥3或1.5倍的基因,通过Affymetrix网站用NetAffx进一步分析,并按生物学功能分类.结果 HCV-1b 核蛋白引起16个基因表达改变,其中免疫反应基因PF4V1和 SPP1分别上调3.4和4.4倍;HCV-2a 核蛋白对免疫反应基因CXCL5和凋亡基因BTF分别下调3.4和3.1倍,但对凋亡基因HRK、LZTS1则能上调3.2和3.4倍;与HCV-1b 和HCV-2a 核蛋白相比,HCV-4d 核蛋白可引起111个基因表达改变,对基因表达谱有更明显的影响.若设定基因表达改变≥1.5倍有意义,HCV-1b 和HCV-2a核蛋白可引起若干相同基因的改变.结论 HCV三种基因型核蛋白引起的基因表达谱各有特点,主要涉及免疫反应、凋亡、信号传导等基因,这对重新认识HCV 核蛋白功能及致病机制均有重要意义.
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结核分枝杆菌培养滤液蛋白32的克隆表达及血清学检测
目的 构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白32(culture filtrate protein 32,CFP32)的重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化重组蛋白CFP32,探讨其对结核病的诊断价值.方法 通过聚合酶链反应技术从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增出Rv0577基因,将其克隆到pMD18一T载体后,再亚克隆到表达载体pET21a,在大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经纯化及复性后,通过Western blot分析,并以酶联免疫吸附试验检测160例血清抗体,其中肺结核患者97例、非结核肺部疾病患者25例,正常对照38名.结果 构建了CFP32重组质粒,并在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白经SDSPAGE分析,在约相对分子质量30 000处有表达条带,镍柱纯化后的重组蛋白占总蛋白的90%以上.Western blot证实重组蛋白可以与结核患者血清特异结合.并以此蛋白进行160份血清结核抗体检测,结果敏感度为63.9%(62/97),特异度为96.8%(2/63).结论 成功构建pET21a-CFP32表达载体,并在大肠杆菌中高效表达CFP32蛋白,对其血清抗体检测证明重组的CFP32蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一.
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过量摄入氟后激活的成骨细胞系中原癌基因的表达
目的研究在体内外过量氟作用下激活的成骨细胞系中原癌基因c-fos和其伴随基因c-jun的表达.方法在饮水中加入氟化钠(NaF)进行大鼠染毒实验,在体外成骨样细胞培养液中加入氟化钠进行染氟实验,采用原位杂交技术、Western印迹技术和免疫组织化学方法对氟中毒大鼠骨组织进行c-fos、c-jun的mRNA水平、蛋白质水平的定量分析和成骨样细胞染氟后不同时间c-fos、c-jun mRNA的定量分析.结果 NaF可刺激慢性氟中毒大鼠椎骨各包被成骨细胞增殖,并诱导c-fos、c-jun 的表达.高钙加氟组c-fos、c-jun mRNA表达的吸光度值分别为107.74和117.48,明显低于高钙对照组的139.63和126.37.免疫组化分析结果显示,高钙加氟组c-fos、c-jun蛋白水平(吸光度值分别为140.73和134.03)明显低于高钙对照组,低钙加氟组c-fos、c-jun mRNA和蛋白表达(吸光度值分别为117.24、111.46、132.46和129.79)明显低于低钙对照组(吸光度值分别为139.16、131.15、149.98和149.19),差异有显著性.Western印迹技术检测NaF各组骨外膜成骨细胞系细胞c-fos、c-jun的蛋白水平明显低于各自的对照组,吸光度值分别为123.32、116.60、115.97和108.30.成骨样细胞染氟12 h,c-fos、c-jun mRNA含量明显增高,48 h仍不见减少,其吸光度值分别为114.80、161.14、118.20和150.41,与对照组比较差异非常显著.结论过量氟可以刺激大鼠成骨细胞系和培养的成骨样细胞激活,增殖能力增强,c-fos、c-jun在mRNA和蛋白质水平的表达增强,c-fos过表达在氟骨症骨相损害的发生发展中可能起重要的作用.
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水痘-带状疱疹病毒糖蛋白I基因在昆虫细胞中的表达及纯化
目的将北京水痘-带状疱疹病毒(VZV)84-7株克隆糖蛋白I(gpI)基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中表达,并对其表达产物进行纯化.方法采用PCR方法从VZV DNA中扩增gpI全基因序列,并将其插入杆状病毒转移质粒pBacPAK9中,获得重组转移质粒pBacVZVgpI,对pBacVZVgpI中的插入基因进行测序.重组转移质粒与线性杆状病毒BacPAK6 DNA(Bsu36I digested)共转染Sf 9昆虫细胞,获得重组病毒BacPAK-gpI.通过亲和层析纯化重组蛋白,并检测其抗原性.结果 PCR扩增得到gpI基因,测序结果表明克隆的外源基因正确.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(western-blot)方法证明gpI基因在昆虫细胞中获得表达,表达产物在培养72 h达到高峰,重组蛋白的相对分子质量约为58 000和70 000,与理论值相符,蛋白质加工与天然蛋白类似.动物实验结果表明,重组蛋白具有较好的免疫原性,可刺激小鼠产生中和抗体.SDS-PAGE检测纯化的重组蛋白,纯度达80%.纯化蛋白经western-blot和ELISA检测后显示,具有特异的抗体结合活性.结论应用昆虫细胞表达水痘-带状疱疹病毒gpI基因,可为水痘-带状疱疹病毒抗原定量分析、糖蛋白ELISA的研制和制备亚单位疫苗提供基础.
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环氧化酶-2基因启动子甲基化及表达与胃黏膜病变的关系
目的 探讨环氧化酶2(COX-2)基因启动子区甲基化水平和蛋白表达与胃黏膜病变的关系,并对其相关的影响因素进行研究.方法 以1201例患有不同胃黏膜病变的高危人群为研究对象,采用免疫组织化学方法榆测COX-2表达,用亚硫酸氢钠-变性高效液相色谱(DHPLC)对COX-2启动子甲基化率进行定量分析,采用13C尿素呼气实验(13C-UBT)对幽门螺旋杆菌(H priori)感染状况进行测定.结果 COX-2甲基化率中位数随胃黏膜病变的加重逐渐升高,在浅表性胃炎和慢性萎缩性胃炎(SG/CAG)、肠上皮化生(IM)及不确定性异型增生和异璎增生(Ind DYS/DYS)病变中分别为10.6%、11.8%、13.8%,各病变组之间差异有统计学意义(X2=8.312,P=0.016).分层分析显示,在H pylori感染阴性病例中,COX-2甲基化率仍随病变加重明显升高,在SG/CAG、IM、Ind DYS/DYS病变中其中位数分别为8.8%、10.6%、14.1%(X2=6.629,P=0.036).进一步分析发现,COX-2甲基化率随着COX-2表达强度的增强而降低,由COX-2弱阳性表达的13.3%降至强阳性表达的7.6%(X2=10.400,P=0.015).结论 COX-2启动子甲基化水平与胃黏膜病变程度及H pylori感染状况密切相关,并与COX-2表达强度呈负相关,说明COX-2启动子区异常甲基化可能在胃黏膜病变的演变过程中起重要作用.
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利用基因芯片技术探讨孕期苯并[a]芘暴露对仔鼠肝细胞基因表达的影响
目的 利用基因芯片技术检测大鼠孕期苯并[a]芘暴露后仔鼠肝细胞基因表达谱的变化,探讨对仔鼠肝细胞毒作用机制中具有核心调控作用的基因和信号通路.方法 选取体重220～250 g SPF级雌、雄性SD大鼠各32只,以随机数字法1∶1比例合笼,将受孕雌鼠分为低、中、高3个染毒组和1个溶剂对照组,每组8只.在孕期第3 ～17天连续灌胃,苯并[a]芘染毒浓度分别为0.75、1.50、3.00 mg/kg,构建大鼠孕期苯并[a]芘的暴露模型.孕鼠正常分娩后取新生仔鼠肝脏,使用RatRef-12芯片检测各组肝细胞全基因组表达情况,并进行重复实验以评价芯片检测的稳定性.结果 每组采用单纯随机法选取来自3只孕鼠的仔鼠肝组织,经过基因芯片检测发现新生仔鼠肝脏有1232个基因发生变化；并发现相关的基因出现了3种较典型的表达趋势(P＜0.05),分别为随着苯并[a]芘染毒剂量的增加,基因出现表达上调、下调和波动性变化.所涉及的差异具有统计学意义的信号通路26条(P＜0.05),主要集中于生长发育信号通路、毒物代谢信号通路和炎症信号通路.在差异基因构建的整体网络中,以CYP2C13、GSTO1基因为核心的代谢通路,以Rela基因为核心的凋亡通路及以MAPK8和Plcg1基因为核心的生长发育通路是孕期苯并[a]芘染毒导致仔鼠肝细胞毒性的关键核心通路.结论 孕期苯并[a]芘暴露对子代肝细胞基因表达产生了一定的影响,发现了一些具有核心调控作用的基因及相关信号通路,为探讨苯并[a]芘暴露对子代肝细胞的影响及其毒作用机制提供了一定的依据.
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佛波酯对BALB/c 3T3细胞转化早期基因表达的影响
目的探讨佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)促进细胞转化早期基因表达谱的变化.方法以N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)为启动剂,TPA为促癌剂,建立BALB/c 3T3细胞转化模型.采用锥虫蓝染色法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期变化.采用cDNA微阵列检测TPA处理早期的基因表达谱变化.结果 TPA处理早期可抑制细胞增殖,阻滞细胞于G1期与S期.TPA处理4 h和24 h后,在检测的1 152个基因中筛选出19个差异表达基因,其中9个基因表达上调,10个基因表达下调.许多差异表达基因的功能与细胞增殖、凋亡和周期调控相关,主要涉及ras和p53基因信号传导通路.结论 TPA在促进BALB/c 3T3细胞转化的早期阶段,可影响某些调节细胞周期进展基因的转录表达,从而导致细胞生长阻滞.
