CoCl2对胰腺癌PC-3细胞系VEGF表达的影响

资料表明,多种肿瘤中存在着VEGF的过度表达,并且其与多种肿瘤的恶性程度及预后不良密切相关[1].肿瘤细胞的迅速增殖所造成的局部氧分压和pH值的改变,可能对促进VEGF等血管生成因子的分泌,启动新生血管生成发挥着重要作用.本实验的目的就在于通过CoCl2诱导肿瘤细胞低氧环境,观察缺氧对细胞VEGF表达的影响.

人乳头状瘤病毒16型E6/E7基因对人喉鳞癌细胞系表皮生长因子受体和基质金属蛋白酶9表达的影响

表皮生长因子受体(EGFR)和基质金属蛋白酶(MMP)9在肿瘤的侵袭和转移发生过程中发挥着重要作用,其表达上调能导致肿瘤的侵袭和转移潜能增强.人乳头状瘤病毒16(HPV16)为喉鳞癌的主要致病因素,其主要转化活性部位在E6和E7开放读码框架.我们采用脂质体转染技术将携带有HPV16-E6/E7 DNA的真核表达质粒导入HPV阴性的Lscc-02喉鳞癌细胞系,使其在细胞中表达,研究其对Lscc-02喉鳞癌细胞系EGFR和MMP-9 mRNA及蛋白表达的影响,探讨HPV16-E6/E7基因与喉鳞癌演进及预后的关系.

先天性巨结肠神经胶质衍化亲神经营养因子的免疫组织化学观察

先天性巨结肠是儿科较常见的疾病,新生儿发病率为1/20 000～1/30 000.其病理表现主要为结肠远端神经节细胞的完全缺乏.现已证实,原癌基因RET是引起先天性巨结肠的主要基因,神经胶质细胞衍化亲神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)是RET基因的配基之一[1].研究结果表明GDNF是有力的神经元的营养因子,可能与神经节细胞移行、分化过程有关.我们采用免疫组织化学方法,观察GDNF在先天性巨结肠各肠段的表达情况,探讨GDNF与先天性巨结肠发生的关系.

PD98059对人卵巢癌细胞株HO-8910增殖的作用

卵巢癌是妇科肿瘤致死率高的恶性肿瘤之一,预后很差,5年生存率不超过35%1-2.近年来,卵巢癌的发病率有逐年上升趋势,却无有效的治疗方法.

HFRS患者BLCL的建立及HTNV S基因片段在其内获得长期稳定的表达

虽然对汉坦病毒核蛋白(HV NP)氨基端蛋白的原核表达产物的抗原性及免疫原性已进行了许多研究,并已用于出血热的诊断,但该抗原表位的精确一级结构及其基因定位迄今尚未完全明确.而研究T细胞表位的前提是首先要构造含病原体抗原基因片段的表达载体质粒.要实现CTL效应细胞对靶细胞的有效杀伤,前提条件之一是效靶细胞必须具有相同的HLA型别.通常选用与效应细胞同源即同一供者的PBMC建立靶细胞,本研究采用与HV特异性CTL同源的患者自身的EB病毒转化的B淋巴母细胞系(EBV-transformed B lymphoblastoid cell line,BLCL)建立靶细胞系,将含有不同汉滩病毒(HTNV)S基因片段的重组真核表达载体转染入BLCL,获得长期稳定表达,为下一步进行CTL杀伤试验提供靶细胞系.

MITOCHONDRIAL BIOGENESIS AND SLOW MUSCLE GENE EXPRESSIONRecent findings in proxisome proliferators-activated recep tor γ (PPARγ) coactivator-1α (PGC-1α) gene regulation and function have led to the consideration of PGC-1α as a key regulator in regulating important features of skeletal muscle adaptation.PGC-1α is a transcriptional coactivator cloned originally by a yeast-two-hybrid screen from a differentiated brown fat cell line using PPARγ as bait[80]. PGC-1α mRNA and protein are highly expressed in slow,oxidative fibers compared to the fast, glycolytic fibers[81-82],consistent with the function of a gene involved in fiber type specialization. The functional importance of PGC-1α in striated muscles has been suggested by several different models [83-84].

丁酸钠联合穿琥宁对人大肠癌细胞HCT-8增生的影响

目的:探讨丁酸钠、穿琥宁体外联合应用对结肠癌细胞的影响.方法:应用生长曲线、MTT、流式细胞仪、电镜研究丁酸钠、穿琥宁对HCT-8的增生抑制及诱导凋亡作用.结果:丁酸钠对HCT-8细胞有明显抑制作用,48 h后各组抑制率分别为15.7%,20.3%,33.3%(P＜0.01),呈现浓度、时间依赖性.电镜下观察可见成熟分化改变及凋亡细胞,流式细胞仪可检测到亚G1峰,细胞周期分析发现其主要阻滞在G1期.穿琥宁与其联合应用,混合组1在24 h,48h凋亡率为23.5%,48.6%,混合组2在2 4h,48 h凋亡率为30.8%,54.2%(P＜0.01).结论:丁酸钠抑制HCT-8细胞增生,并诱导其成熟分化、凋亡.穿琥宁与其合用使凋亡率增加.

永生大鼠肝星状细胞系的建立及鉴定

目的:建立永生性大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)系.方法:采用改良胶原酶原位灌注法消化肝脏,经Nycodenz密度梯度离心分离、鉴定成年Sprague-Dawley大鼠的HSC.然后通过细胞克隆建立HSC系(HSC-PQ)并传代培养.结合细胞动力学、光镜、透射电镜及免疫细胞化学技术检测HSC-PQ系的倍增时间、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及结蛋白表达、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成等表型特征.结果:分离获得的HSC约为2X107细胞/只大鼠,细胞成活率＞95%,纯度＞90%,培养2 wk后几乎所有HSC均已活化.在此基础上经细胞克隆所得的HSC-PQ系表型类似成纤维细胞,倍增时间约75 h,可表达结蛋白、α-SMA以及除Ⅳ型胶原外的多种ECM成分(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等),且传代过程中增生、ECM表达等特性均保持稳定.该细胞系已在体外培养32代(1 a以上),提示其具有永生性.结论:已成功建立永生性大鼠HSC系,该细胞系的基本特征与活化的原代HSC相似.

幽门螺杆菌对肝细胞系HepG2 cyclinD1,PCNA mRNA表达的影响

目的:研究幽门螺杆菌(H pylori)处理对肝细胞系HepG2cyclinD1,PCNA mRNA表达的影响.方法:将H pylori与HepG2共同培养1 h、3 h、6 h、12 h和24 h,采用半定量RT-PCR方法分析共培养不同时间后HepG2 cyclinD1,PCNA mRNA的表达水平.结果:CagA++H pylori与HepG2细胞共同孵育1 h后,即可见cyclinD1 mRNA表达升高,3h达高峰,约为对照的4.0倍(P＜0.01);共同孵育3 h后即可见PCNA mRNA表达升高,6h达高峰,约为对照的2.0倍(P＜0.05).而CagA-Hpylori和HepG2细胞共同孵育后,未见两基因的表达升高.结论:CagA+H pylori能诱导HepG2 cyclinD1,PCNAmRNA表达升高,提示其在肝癌的发生中起一定作用.

汉防己甲素抑制肝癌细胞增生的作用

目的:研究汉防己甲素(tetrandrine,TTD)对肝癌细胞的作用及其机制.方法:采用MTT比色法观察了TTD对肝癌细胞增生的影响;采用流式细胞仪法观察了TTD对肝癌细胞内活性氧的影响;采用琼脂凝胶电泳法观察了DNA片断化的梯形条带.结果:10 and 20 μmol/L TTD作用于肝癌细胞系24,48,72 h后其增生率分别为90.1±1.0%and 77.5±2.0%,70.2±2.9%and 56.6±1.6%,61.6±2.0%and 47.2±1.9%(F=40.025,P＜0.001);0、10和20μmol/L TTD作用于肝癌细胞系2 h后O2-为35%、36.6%、63.2%;H2O2.为24.5%、40.5%、84.6%.48 h后20 umol/LTTD组肝癌细胞出现典型的凋亡表现.结论:TTD能够通过诱导肝癌细胞内活性氧的产生,而引起细胞凋亡,呈明显的剂量依赖性.

α干扰素对人高转移肝癌细胞系HCCLM3血管形成因子表达的影响

目的:研究IFN-a对高转移潜能的人肝癌细胞系HCCLM3细胞血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和白介素-8(IL-8)表达的影响,探索IFN-a抗中瘤血管形成的机制.方法:将HCCLM3细胞在高糖DMEM培养液(Dulbecco'smodified Eagle medium)和加入了不同剂量(30,300或3 000 kU/L)IFN-α的DMEM培养液中孵育72 h.ELISA法检测IFN-α干预组与对照组(未加入IFN-α)中VEGF,bFGF,MMP-2,MMP-9和IL-8的表达情况.结果:HCCLM3细胞空白对照组中VEGF,MMP-2,bFGF和IL-8的表达农度分别为2666±122.6,4400±1 000,28.0±5.1和1 160±69.4 ng/L.同时IFN-α为300 kU/L时,VEGF,MMP-2,bFGF和IL-8的浓度分别为2476.5±125.7(P＜0.05),2 400±600(P＜0.01),25.8±1.6和1 079±5 ng/L;IFN-α为3 000 kU/L时,VEGF,MMP-2,bFGF和IL-8的浓度分别为2 289.5±119.5(P＜0.01),2 000±500(P＜0.01),25.1±2.9和1 087.9±83.9 ng/L.各组中均未检测到MMP-9的表达.结论:IFN-α对HCCLM3细胞VEGF和MMP-2蛋白的表达均具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性.bFGF,IL-8和MMP-9的表达浓度在IFN-α各剂量组与对照组间无显著性差别.IFN-α对肝癌细胞中VEGF和MMP-2表达水平的下调在其抗肝癌血管形成机制中发挥重要作用.

中药复方胃肠安血清诱导肝癌SMMC-7721细胞分化

目的:观察中药复方胃肠安诱导肝癌细胞分化的作用.方法:以SMMC-7721人肝癌细胞为研究对象,维甲酸为对照,采用药物血清添加法,通过MTT法和AlamarBlue法观察胃肠安对肝癌细胞增生的抑制作用;放射免疫法观察对肝癌细胞分泌甲胎蛋白和白蛋白的影响;Western blot观察对肝癌细胞P53、P16以及P21蛋白表达的影响.结果:MTT法显示胃肠安与维甲酸对SMMC-7721人肝癌细胞增生均有抑制作用,胃肠安在48 h达到大,而维甲酸对细胞增生的抑制作用在48h后逐渐下降,较胃肠安组明显降低.Alamar Blue法结果显示,16 h后,胃肠安组细胞还原的AlamarBlue值较对照组明显减少,并在32 h后较维甲酸组显著下降,提示与维甲酸相比,胃肠安作用起效慢但持续时间长;胃肠安组分泌的甲胎蛋白较对照组显著减少(11.4±1.4μg/Lvs17.2±1.1 μg/L,P=0.036),而白蛋白显著增多(0.40±0.02mg/L vs0.29±0.01 mg/L,P=0.043);胃肠安组突变型P53蛋白的表达较对照组明显减少,而P16蛋白和P21蛋白的表达较对照组增多.结论:胃肠安方剂具有抑制SMMC-7721人肝癌细胞增生、诱导细胞分化的作用,其机制可能在于减少突变型P53蛋白表达和增加P16,P21蛋白表达.

热休克蛋白70联合白介素-2对小鼠肝癌细胞株移植瘤的影响

目的:研究肿瘤热休克蛋白70联合应用IL-2对小鼠肝癌的治疗作用,为两种免疫制剂联合应用治疗人类恶性肿瘤提供参考依据.方法:应用细胞培养、蛋白提纯、电泳、Western-blot、毛细管电泳、动物实验等方法.小鼠分别用HSP70 10μg、5 μg和IL-2 50kU、100kU、2kU(维持量)按设计的方案进行治疗试验.结果:单纯应用或联合应用HSP70和IL-2均能明显地延缓小鼠移植肝癌的生长并能不同程度地延长生存期,与对照组相比(除IL-250kU组外)差异显著(P＜0.025-0.05).但获长期存活(＞90d)者仅见于接受HSP70 10 μ g治疗组,40%(2/5)的HSP70 10 μ g组及HSP70 10 μ g联合应用IL-2 50kU组小鼠,和60%(3/5)的HSP70 10 μg联合应用IL-2 100kU组小鼠,获长期生存的小鼠其肿瘤终全部消退.与无长期生存小鼠的其他组相比差异十分显著(P＜0.025-0.05).IL-2 100kU与HSP70 5 μ g的作用相当.结论:肿瘤来源的HSP70较IL-2具有更强的治疗作用,在联合应用实验的治疗组中HSP70对延缓和消除肿瘤起主要作用.更重要的是,合适剂量的HSP70与IL-2联合应用(本研究中HSP70 10 μg与IL-2 100kU)能明显地提高对荷瘤小鼠的治疗作用.

bFGF对人肝癌细胞系Bel-7402的生长调控

目的:探讨bFGF是否通过PI3K/PKB途径调节p21WAP1的表达.方法:32P掺入法检测PKB酶活性,RT-PCR、Western blot检测不同处理组Bel-7402细胞的p21WAF1表达,流式细胞术分析细胞周期.结果:25 μg/LbFGF刺激细胞10 min,就可使胞液和膜性PKB酶活性达高峰.p21WAF1mRNA表达水平在1 h达高峰,比对照升高了5.5倍.p21WAF1蛋白表达在2 h达高峰,比对照升高了2.2倍.wortmannin预处理后,PKB活性在各时间点均明显降低(P<0.05),p21WAF1mRNA表达及p21WAF1蛋白表达无明显变化.流式细胞术分析显示,bFGF处理组与对照组相比G1期细胞减少(0.65±0.01→0.49±0.02,P<0.01),S期细胞增多(0.14±0.01→0.28±0.01,P＜0.01),worrtmannin能抑制此促增生作用(G1:0.58±0.01;S:0.22±0.01,P＜0.01).结论:PI3K/PKB途径可介导bFGF对Bel-7402细胞的促增生作用,但是bFGF对p21WAF1表达的调节作用不依赖PI3K/PKB途径.

survivin反义寡核苷酸对肝癌细胞生长抑制作用的研究

目的:采用反义寡核苷酸封闭肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其对肝癌细胞生长的抑制作用.方法:针对survivin mRNA翻译起始位点设计并合成反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN);采用脂质体介导survivin ASODN转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,western-blot及原位杂交方法检测survivin蛋白及mRNA表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,检测转染前后细胞贴壁率及细胞生长抑制率变化,绘制细胞生长曲线.结果:脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染肝癌细胞后survivin蛋白及mRNA表达分别从69.59及75.61降低至10.71及22.94,细胞贴壁率从90.68%降低至33.16%,细胞凋亡率从0.7%增加至31.35%,均有显著差异.转染后对细胞生长的抑制作用可以维持大约1 wk,在转染后第3 d抑制率高可达71.8%.结论:脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以有效降低细胞内survivin基因的表达,诱导细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞生长.

2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖诱导肝癌细胞凋亡的形态学变化

目的:探讨2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖诱导肝癌细胞株HepG2凋亡的可能性.方法:选用不同浓度的2-(3-羧基-l-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖与肝癌细胞株共同孵育不同时间后,应用倒置相差显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜对细胞生长状况及药物作用后细胞的形态进行观察.结果:经2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖作用24-72 h后,HepG2肝癌细胞株出现体积缩小,荧光染色增强,胞核或胞质中可见致密浓染的块状或颗粒状黄绿色荧光染色.染色质固缩,并凝结成块,聚集在核膜周边呈新月状或肾状,胞质浓缩,内质网疏松并与胞膜融合形成-个个空泡.且凋亡细胞含量呈一定的浓度、时间相关性.结论:2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖具有诱导HepG2细胞凋亡的作用.

内毒素联合精氨酸对人肝癌细胞Bel-7402增生及凋亡的影响

目的:通过内毒素联合精氨酸诱导自分泌的一氧化氮(No)及其限速酶的表达,观察人肝癌细胞Bel-7402自分泌的一氧化氮的改变对其增生及凋亡的影响.方法:Bel-7402细胞中NO产生的限速酶为诱生型合酶(iNOS),其底物为精氨酸(L-Arg).采用MTT法观察不同浓度的L-Arg及内毒素(LPS)对细胞增生的影响.采用细胞免疫组化的方法对iNOS在细胞中的表达进行观察.Tunel法观察NO对细胞凋亡的影响.结果:在iNOS的表达不受影响的情况下,0.625 mmol/L的L-Arg产生低浓度的NO,对细胞的增生有促进作用(对照组0.86±0.01,处理组0.87±0.02 P＞0.05),2.5 mmol/L-Arg产生高浓度的NO,对细胞的增生有抑制作用(对照组0.86±0.01,0.83±0.01 P＜0.05).100 ng/L LPS使iNOS的表达增强,使单位时间内NO的生成增多,细胞增生受抑.与L-Arg有协同作用.高浓度的NO能够促进细胞的凋亡.结论:LPS可能通过促进iNOS的产生,在精氨酸的协同作用下,促进细胞凋亡,抑制细胞增生.

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃腺癌SGC7901细胞Fas和FasL表达的影响

目的:探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC7901凋亡的相关基因Fas和FasL影响.方法:胃癌细胞株SGC7901细胞由山东医科院提供.采用脂质体介导乙酰肝素酶反义寡核苷酸转染人胃癌细胞株SGC7901细胞,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后乙酰肝素酶mRNA、Fas mRNA和FasL mRNA表达的变化,采用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.结果:脂质体介导转染乙酰肝素酶反义寡核苷酸后,SGC7901胃癌细胞内乙酰肝素酶mRNA和FasL mRNA表达下降(分别为1.13±0.05vs0.36±0.22,t=8.37,P=0.0 001＜0 01;1.11±0.24vs0.35±0.23,t=5.48,P=0.0 003＜0.01),Fas mRNA表达上升(0.45±0.23vs1.02±0.02,t=6.05,P=0.0001＜0 01),转染前后各组细胞凋亡率分别为4.04%,3.85%,3.38%,9.13%,16.00%,15.63%及13.32%.结论转染乙酰肝素酶反义寡核苷酸可以有效诱导胃癌细胞发生凋亡

Stat3反义寡核苷酸对人胃腺癌MKN45细胞相关信号传导影响的研究

目的:通过研究Stat3反义寡核苷酸对人胃腺癌MKN45细胞增生活性的影响,寻求胃癌治疗中相关信号传导途径的新靶点.方法:Stat3反义寡核苷酸是一种混合骨架寡核苷酸(MBO),采用脂质体介导的方式将其转染人胃腺癌细胞株MKN45;通过MTT法观察转染前后对细胞增生状态的影响;凝胶阻滞电泳(EMSA)和Western blot方法观察转染前后Stat3DNA的结合活性和磷酸化Stat3蛋白表达的变化.结果:Stat3反义寡核苷酸对MKN45细胞的增生有明显抑制作用;转染反义寡核苷酸后MKN45细胞中Stat3信号的组成性激活水平和磷酸化Stat3蛋白的表达分别下降了50.65%及78.86%.结论:Stat3反义寡核苷酸能显著抑制MKN45细胞中Stat3信号的传导,胃癌细胞株中活化的Stat3信号可作为胃癌治疗新的分子靶点.

三氧化二砷诱导人类大肠癌细胞凋亡的分子机制

目的:明确三氧化二砷(As2O3)注射液对人类大肠癌细胞株的诱导凋亡作用,并探讨其分子机制.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、AO/EB荧光染色法、透射电镜观察、DNA电泳、流式细胞术法及免疫组化等方法,系统地观察了As2O3注射液对体外培养的人类大肠癌细胞株LoVo和CoLo-320的生长活力、细胞凋亡、细胞周期及其相关基因表达的影响.结果:用不同浓度(0.5,1.0,2.0,4.0 mg/L)As2O3作用LoVo和CoLo-320细胞不同时间(24,48,72 h),均能显著抑制其生长(P＜0.05),用药后诱导其出现了典型的细胞凋亡的形态学和生化学改变,癌细胞Bcl-2基因表达明显下降,Bax和Fas基因表达显著增强(P＜0.01).结论:As2O3注射液对人类大肠癌细胞具有显著的诱导凋亡作用,这一作用受到多种基因的调控,即Bcl-2基因表达下调,Bax和Fas基因表达上调.