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基因治疗的新型载体研究进展
建立和发展一个安全及有效的载体系统对基因治疗是极其重要的.尽管病毒载体已经在临床上用于基因治疗,但其安全性仍然不确切.近年来,许多非病毒性基因载体系统已被广泛开展及应用.本综述将讨论一些新的基因载体系统,特别是本实验室开展研究的载体系统,包括细胞转导肽、电脉冲导入系统、壳聚糖载体等.
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重组腺病毒载体靶向性策略的研究进展
近年来，研究者致力于突破基因治疗的瓶颈，极大推动了基因治疗的发展。载体系统是基因治疗的基础，截止2013年7月，在“Gene Therapy Clinical Trial Worldwide”网站登记注册的基因治疗方案中，重组腺病毒载体占476项（23.5%）。在6个亚群（A-F）、50多种血清型的腺病毒载体中，5型腺病毒（adenovirus type 5，Ad5）可特异性识别并结合多种正常组织高表达的柯萨奇病毒-腺病毒受体（coxsackie-adenovirus receptor，CAR）从而进入细胞发挥作用，基因转导效率高，因此，Ad5是目前应用广泛的腺病毒载体。
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新一代腺病毒载体研究进展
由于腺病毒载体具有高核转移效率,对人致病性低等优点,所以在众多的载体系统中脱颖而出,成为基础研究、基因治疗和重组疫苗开发等领域中的重要工具.至今腺病毒载体已经发展了3代:第1代腺病毒载体(通常来源于Ad5和Ad2)主要是去除了E1和(或)E3区;第2代腺病毒在E1、E3缺失的基础上进一步去除了E2和(或)E4区;然后人们对腺病毒进行彻底的缺失,发展了第3代腺病毒载体,即high-capacity Ad vectors(HC-Ad),它仅含有ITRS和包装信号.
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中枢神经系统对腺病毒载体的免疫应答
腺病毒载体(adenoviral vector,AdV)在介导体内基因转染方面所表现出的多方面的优势,使得这一载体系统正在成为神经再生、神经示踪研究以及神经肌肉疾病基因治疗的实验研究中具魅力的载体之一[1-3].虽然神经系统被认为是免疫豁免(immunological privilege)器官,然而AdV转染神经系统后所激发的对该载体的免疫应答常导致其携带的目的基因不能在体内长时间高水平表达,甚至引起转染细胞的破坏,致使这一载体系统的应用在很大程度上受到限制[4,5].为探索AdV在神经系统高效和安全给予方法以及使转染基因获得治疗水平的长期表达,很有必要详细分析研究神经系统对AdV的免疫应答机制以及探索新的免疫调控策略.
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人GL50转基因细胞的建立
ICOS/GL50是CD28/B7家族的一对新成员,GL50组成性表达在B细胞、巨噬细胞上.GL50-Ig能显著上调IL-4、IL-10、IFN-γ等细胞因子的表达,但对IL-2的产生没有影响,ICOS/GL50主要在T细胞的效应阶段发挥重要的调节作用.为了进一步研究其功能,我们利用逆转录病毒载体系统有效介导了基因转移.
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慢性乙型肝炎病毒清除自杀基因平衡制约载体系统的构建
目的:建立清除乙型肝炎病毒(HBV)自杀基因平衡制约载体系统,靶向清除HBV感染的肝细胞,抑制慢性乙型肝炎和肝硬化患者免疫再活动.方法:逆转录PCR(RT-PCR)扩增丙型肝炎病毒(HCV)基因组中核糖体插入位点(IRES),以pcDNA3载体为基础,构建双顺反子表达载体.同时在IRES位点的上游克隆HBV表面基因的部分反义序列和HCV全长核心基因,在IRES位点下游克隆胸腺苷激酶基因,PCR、酶切和测序鉴定.构建的清除乙型肝炎病毒(HBV)自杀基因平衡制约载体系统分别转染培养基含有更昔洛韦的HepG2细胞和2.2.15细胞.结果:构建的清除乙型肝炎病毒(HBV)自杀基因平衡制约载体系统可以选择性促使2.215细胞凋亡(实验组细胞凋亡率为15%,而对照组仅为6%);抑制2.2.15细胞在培养基中分泌乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg),统计学分析表明,HBsAg在培养基中检测滴度,在两组之间有显著性差异(P＜0.05).结论:构建以HBV表面基因为靶基因,自杀基因为效应基因的自杀基因制约平衡系统,可能为下一步慢性乙型肝炎的基因治疗提供理想的基因治疗载体.
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肝靶向基因给药系统AsOR-PL+PEG-PEl的研究
目的:研制含有靶向配基、DNA聚合亚基、溶酶体活性成分及聚乙二醇等多种组分的肝靶向的DNA给药系统.方法:分别制备As0R-PL偶合物及PEG-PEI偶合物.然后按照不同的比例先后与报告基因DNA形成复合物,再进行Huh-7细胞的体外转染试验和静脉给药后小鼠体内的表达试验.结果:AsOR-Pt/PFG,-PEt/DNA复合物对受体阳性的Huh-7细胞具有较高的转染效率;小鼠尾静脉给药后能够在肝脏特异性表达.结论:含有靶向配基、DNA聚合亚基、溶酶体活性成分及聚乙二醇等多种组分的载体系统能将DNA选择性的投放于小鼠肝脏,显示了较好的应用前景.
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肿瘤基因治疗中腺病毒载体的转导靶向
重组DNA技术的发展使得肿瘤基因治疗的应用范围越来越广泛,已有部分代替那些传统疗法(外科手术、化疗和放疗)的趋势.但目前存在两个重要的问题需要解决:(1)现有的载体系统缺少组织特异性;(2)现行的基因疗法的基因转染的效率比较低.这在很大程度上制约了肿瘤基因治疗的应用.为了克服这两个难题,我们需要人工构建新型的,具有特异靶向及高效率转染等特性的载体系统.腺病毒作为目前基因治疗中常用的载体系统中的一员,对其的改造和修饰已引起了很多人的关注,而且也构建出了一些高效率的具有特异靶向性的腺病毒载体.在这里将详细的介绍这些新颖的腺病毒载体.
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肝癌基因治疗研究进展
肝癌是世界上恶性程度极高，且预后极差的恶性肿瘤之一，每年全球约有125万人患病。在我国肝癌目前已处于恶性肿瘤死亡率的第二位，每年至少有10万名新发现病人，和11万名肝癌病人死亡〔1〕。尽管目前肝癌的治疗方法有许多种，但治疗效果都十分有限，并未显著延长病人的生存期。大部分肝癌病人对化疗及放疗等治疗均不敏感，能手术根治的病人仅占15%。随着分子生物学和免疫学理论及技术的不断发展和对肿瘤发病机制的不断认识，人们可以利用基因工程的手段进行肝癌的基因治疗，且在该领域已显示出一定的临床治疗效果。如Habib等〔2〕使用野生型p53基因治疗原发性肝细胞癌的临床治疗试验，取得了很大的成功，引起人们的普遍关注。本文就目前肝癌基因治疗的研究现状和发展趋势作一综述。 一、肝癌基因治疗中所使用的载体系统和治疗途径的选择 目前在肝癌基因治疗实验当中使用多的是病毒载体系统，包括腺病毒载体〔3〕、逆转录病毒载体〔4〕、腺相关病毒载体〔5〕等，非病毒载体系统主要是使用脂质体〔2，6〕介导，且已进入临床试验阶段。在肿瘤基因治疗中，腺病毒载体系统具有许多优点，如制备容易，能获得高纯度、高滴度的腺病毒体；无遗传毒性，以游离型状态存在，不整合进入宿主DNA中；表达时间相对短暂，一般15～20 d左右，不会造成对免疫系统的长期慢性刺激〔7〕；感染宿主范围相对较广，尤其是能感染复制、分裂期的细胞。近几年临床上使用腺病毒载体治疗恶性肿瘤的例子越来越多〔8〕。体外实验证实，数个人的肝癌细胞系HepG2、Hep3B、Hnh7、HLE、HLF、SK-HEP-1和大鼠肝癌细胞系McA-RH7777等，均对腺病毒十分易感，50MOI可使近100%的细胞被感染〔9〕。作者曾在军事医学科学院百环生物医学研究中心吴祖泽院士指导下，以腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因作为标记基因，也证实3个人的肝癌细胞系HepG2、SMMC7721、BEL-7402，一个胆管癌细胞系QBC939，一个正常肝细胞系L02，均对腺病毒易感，50MOI可使90%左右的靶细胞受感染。Castell等〔10〕利用携带LacZ基因的腺病毒体，感染体外原代培养的正常肝细胞，结果证实：肝细胞对腺病毒十分易感，15MOI感染1 h，可使80%的肝细胞受感染，20MOI感染1 h可使100%的肝细胞受感染；导入的目的基因可以在肝细胞内高效表达；感染腺病毒后，并不影响肝细胞的正常生化功能，如肝细胞的尿素合成、胞膜蛋白合成、生物转化活性等，认为使用腺病毒载体进行肝脏疾病的基因治疗，是十分有效的工具载体。但有实验表明大剂量腺病毒载体对肝功能还是有影响的〔11〕，随感染病毒量的加大，肝脏的毒性作用也加大，且感染腺病毒的靶细胞刺激机体产生免疫反应，从而使腺病毒的转化效率降低，限制了重复使用。使用逆转录病毒载体进行肝脏疾病的基因治疗，也有其有利之处：因逆转录病毒只感染处于复制、分裂期的细胞，而处于非复制期的细胞则不受感染。因肿瘤细胞多处于分裂期，而肿瘤周围的正常肝细胞多处于静止期，故逆转录病毒载体具有一定的靶细胞特异性〔4〕。Kitten等〔12〕使用逆转录病毒载体，通过门静脉注入大鼠肝内，有46%±17%的肝细胞受到感染，随病毒滴度的升高，细胞的转导效率也 增加。虽然逆转录病毒载体能将目的基因有效地导入肝癌细胞内，对肝脏这样的低分裂组织局部应用较为合适，但系统体内(in vivo)法应用，就会对骨髓、生殖细胞、肠上皮细胞等分裂增殖旺盛的组织，产生致死性杀伤作用，有产生与放、化疗相似副作用的危险。对于原发性肝细胞癌，癌细胞的增殖生长一般比较缓慢〔12〕，因此使用逆转录病毒载体可能转化效率较低，但对于肝转移癌，因为细胞增殖较为旺盛，故使用逆转录病毒载体较为合适。对于使用腺相关病毒载体进行肝癌的基因治疗，目前还研究较少，但腺相关病毒无致病性，有广泛的宿主范围，能感染不分裂的S期细胞，并能整合到宿主DNA的特异部位中，故减少了发生插入突变的危险性。Su等〔5〕使用AAV介导AFP/HSV-TK基因，证实目的基因能在肝癌细胞中高效表达，并具有杀伤肝癌细胞的作用。
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腺病毒及腺相关病毒在神经细胞损伤及修复中的作用
近年来,由于神经科学的不断发展,中枢神经系统疾病发生机制的不断阐述,转基因疗法的深入研究,使转基因疗法在治疗中枢神经系统疾病的应用前景备受关注.腺病毒载体和腺相关病毒载体是目前在基因治疗中研究和应用为广泛的两种载体系统,本文主要就它们的特性和在治疗神经细胞损伤和功能修复中的应用进行阐述.
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携带sbr基因的农杆菌二元载体系统的构建及稳定性分析
利用转基因植物生产防龋疫苗,其中一个主要的步骤是如何将目的基因转入植物组织中.对于双子叶植物番茄来说,农杆菌为载体的基因转移法是合适的,因此本实验构建含sbr基因的农杆菌二元载体系统,并分析质粒在农杆菌中的稳定性,为下一步植物遗传转化奠定基础.
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壳聚糖-防龋DNA疫苗微粒的制备和体外表达研究
壳聚糖(chitosan,CS)是新开发的黏膜载体系统,具有良好的生物相容性和体内可降解性,并且安全无毒.我们将壳聚糖和防龋DNA疫苗制备成微粒,对微粒的大小、形态特征和体外转染进行了研究,探讨其作为防龋DNA疫苗黏膜递呈系统的可能.
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腺病毒受体在不同白血病细胞中的表达及意义
高效转移目的基因进入细胞,尤其是处于非分裂静止期的细胞,是基因治疗至关重要的步骤.由于腺病毒载体(Ad-Vec)具有制备简便、宿主范围广、感染性强、包装容量大、病毒繁殖滴度高和安全性好的特点,因此,AdVec已成为继逆转录病毒载体后被广泛应用的载体系统.然而,我们以往的研究发现,传统的以5型腺病毒为基础构建的AdVec即AdSVec很难高效感染多种不同的白血病细胞如K562细胞,但是,它们均能被新型嵌合的AdVec即Ad5F35AdVec有效感染[1].为进一步探讨其机制,我们分析了腺病毒受体(CAR)在不同白血病细胞中的表达.
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HIV-1慢病毒载体的构建及结构改造
目前很多基因治疗实验中选择造血干细胞(HSC)等非分裂期细胞作为靶细胞.常用病毒性载体为逆转录病毒和腺病毒载体系统[1,2].逆转录病毒只能转导分裂期细胞,腺病毒载体在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应.来源于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒载体由于可以感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等特点越来越受到人们的重视[3,4].我们成功构建了慢病毒载体的三质粒包装系统并重点对其中的转移质粒进行了改造,筛选出转导效率较高的慢病毒载体.
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基因治疗的研究进展
目的：基因治疗人类单基因遗传病和癌症。方法：阅读国外文献，总结分析了基因治疗的临床研究。结果：数百例研究证明基因治疗都有疗效，副作用极少，存在的问题是在体內基因导入和表达效率不理想。结论：有待开发高效的基因表达载体系统和受体细胞体系；治疗性克隆技术是解决此难题的一种新思路。
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癌基因治疗中的腺病毒载体的开发和应用(综述Ⅲ)
3大容量腺病毒载体的开发3.1新型腺病毒辅助细胞系和相关载体的开发作为复制缺陷型和不依赖于辅助病毒的腺病毒载体系统的一部分,辅助细胞系显得非常重要.一般来说,这个工作是通过把更多的Ad基因或基因组区域放到细胞里来提高反义互补的容量.在这条原则下成功研制的新型Ad载体有如下几点益处,如增加基因携带容量,减少产生RCA的可能性以及减少载体的免疫原性.然而目前的问题是在新的辅助细胞系中按时序为Ad的自然增殖提供互补成分时如何避免病毒蛋白诱导的细胞毒性.
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痘苗病毒载体的特点及应用
痘苗病毒具有宿主范围广、安全、高效表达、插入外源基因的容量大等诸多优点,是继反转录病毒、腺病毒载体之后又一广泛应用的载体系统.本文对痘苗病毒载体的特点及其应用作了综述.
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狂犬病病毒基因重组载体的构建及其在重组疫苗研究中的应用
本文概述了狂犬病病毒(RV)基因重组载体构建的基本原理、该载体的优点、将该载体用于构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)重组疫苗的方法,以及所获得的疫苗在小鼠中的免疫效果,后讨论了对该载体系统作进一步研究的可能发展方向.
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慢病毒载体及其在基因治疗中的研究进展
基因治疗作为一种相对理想、高效、特异的治疗手段,已成为目前生命科学领域重要的研究之一.如何选择一个合适的基因转移载体,是基因治疗的一个重要方面.目前,病毒载体的应用非常广泛.包括反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等.本文拟就慢病毒载体系统及其在基因治疗中的应用和研究进展作一综述.
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分子靶向抗肿瘤药物的研究进展
恶性肿瘤是严重威胁人类生命的疾病之一，而传统的治疗方法和治疗药物已远远不能满足临床需要。随着分子生物学的发展，分子靶向药物载体系统和靶向抗肿瘤药物的研究取得了突破性进展，为恶性肿瘤患者带来了新的希望。许多靶向药物已在临床试验中显示出极大的优势并被批准用于恶性肿瘤的临床治疗，获得了较好的效果。还有一些恶性肿瘤的潜在治疗药物正处于研究之中。本文主要针对分子靶向药物的载体系统和其在肿瘤治疗方面的应用进行综述。
