腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用

目的:研究腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用.方法:应用PCR克隆出人KDR基因启动子序列-225 bp～+127 bp,以AdEasy system为载体,构建携带受KDR启动子或CMV启动子调控tk基因表达的2种重组腺病毒质粒pAdKDR-tk和pAdCMV-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外感染表达KDR的脐静脉血管内皮细胞系HUVEC和不表达KDR的肝癌细胞系HepG2,并给予不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理,5 d后收集存活细胞并计数.结果:产生的病毒滴度均为5×109pfu/ml.在MOI为100、GCV为50μg/ml条件下,AdKDR-tk转染HUVEC后细胞生存率下降(31.49%±6.42%),AdKDR-tk转染HepG2后细胞生存率为76.57%±3.49%,而转染AdCMV-tk的2细胞系生存率均显著下降,细胞生存率分别为22.24%±3.77%(HUVEC)和26.53%±6.84%(HepG2).结论:KDR基因启动子可调控HSV-tk在血管内皮细胞中特异性表达,为进一步开展靶向肿瘤血管内皮的自杀基因治疗研究奠定了基础.

肿瘤抗原致敏的树突状细胞联合IL-2活化的淋巴细胞胸腹腔输注治疗晚期癌性胸腹水

目的:观察肿瘤抗原致敏的树突状细胞联合白细胞介素2活化的淋巴细胞胸腹腔内输注治疗晚期癌性胸腹水的效果,为肿瘤的生物治疗提供新的思路.方法:分离晚期癌症患者外周血中单个核细胞,制备单核细胞来源的DC(MoDC)和IL-2活化的淋巴细胞.用患者胸腹腔积液中分离的肿瘤细胞制备冻融抗原致敏MoDC后,联合IL-2活化的淋巴细胞给患者胸腹腔输注.X线或B超监测免疫治疗后胸腹腔积液的变化,FACS分析治疗前后胸腹水中淋巴细胞表面细胞因子受体的表达情况.结果:经肿瘤抗原MoDC联合IL-2活化的淋巴细胞胸腹腔输注后,胸腹水中表达IL-2R的淋巴细胞数目明显增多,表达IL-10R的淋巴细胞数目明显减少,光镜下可见较多的DC对淋巴细胞黏附及淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤.免疫治疗组完全缓解率稻.9%,部分缓解率53.1%,有效率100.0%,明显高于DDP对照组,(P＜0.05).结论:肿瘤抗原致敏的MoDC联合IL-2活化的淋巴细胞胸腹腔内输注能显著地促进胸腹水中肿瘤浸润性淋巴细胞的增殖和活化,提高了癌症患者的免疫功能,有效地治疗癌性胸腹水.其机制与肿瘤抗原致敏的MoDC对肿瘤抗原的有效提呈和IL-2活化的淋巴细胞对肿瘤细胞的直接杀伤作用有关.

腺病毒介导的cox-2反义RNA对食管癌细胞株生长的影响

目的:构建表达人环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,cox-2)反义RNA的腺病毒载体,研究其对人食管癌细胞生长的影响.方法:把人cox-2基因的cDNA片段反向克隆于穿梭质粒pHCMVSP1A的CMV启动子之下,获得pAd-AShcox-2,通过脂质体与pJM17共转染293细胞,经同源重组产生编码cox-2反义RNA的重组腺病毒--Ad-AShcox-2.PCR鉴定为阳性克隆并大量扩增,转染食管癌细胞EC9706,用生长细胞计数,3H-TdR掺入及免疫细胞化学的方法,研究对食管癌细胞生长、cox-2表达、DNA合成的影响.结果:成功构建编码cox-2反义RNA的重组腺病毒Ad-AShcox-2,病毒感染EC9706后,cox-2表达降低,3H-TdR掺入量减少,与对照组比较P＜0.001;同时发现食管癌细胞的生长受抑制.结论:减少cox-2的表达可能是治疗食管癌的一种新途经.

胸腺肽σ1对大鼠肝癌前病变及癌变的预防作用

机体的免疫状态与肿瘤的发生、发展密切相关,免疫监视功能低下和细胞因子网络及其受体间调节失控在肿瘤发病学中的作用日益受到重视.日达仙即胸腺肽α1(Tα1)是一种生物反应调节剂(BRM),已被用于联合肝动脉化学栓塞(TACE)治疗晚期肝癌.

重组人新型白介素-2治疗晚期肿瘤Ⅱ期临床研究

目的:通过多中心前瞻性Ⅱ期临床试验观察重组人新型白细胞介素-2(125Ser-rhIL-2)的疗效和不良反应.方法:分别采用皮下和胸、腹腔内注射治疗实体瘤和癌性胸/腹腔积液.结果:176例患者中可评价近期疗效者172例.其中癌性胸/腹腔积液和实体瘤患者分别为141和31例,有效率分别为80.14%和25.81%.治疗后大部分病人生活质量、免疫功能有一定程度提高.不良反应主要为发热、寒战、局部皮肤红肿及消化道反应.未发现低血压和毛细血管渗漏综合征发生.结论:125Ser-rhIL-2对晚期肾癌、恶性黑色素瘤、癌性胸/腹腔积液具有客观抗肿瘤作用,不良反应较轻.

抗HPV16E6核酶增加宫颈癌CaSKi细胞-对顺铂敏感性的研究

目的:研究抗HPV16E6核酶(Ribozyme)导入宫颈癌CaSKi细胞对顺铂(DDP)敏感性的影响.方法:以脂质体法将抗HPV16E6-Ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R,CaSKi-P细胞.点杂交检测核酶在细胞中的表达,Northern杂交检测3种细胞中E6基因的表达.检测3种细胞的细胞生长曲线和克隆形成实验,MTT法检测3种细胞对DDP的敏感性,Annexine/PI双标法检测细胞凋亡率,流式细胞术检测Bcl-2,P53,Bax蛋白表达.结果:点杂交证实核酶能在CaS-Ki-R细胞中稳定表达,Northern杂交证实CaSKi-R中表达E6较CaSKi-P,CaSKi明显降低.与CaSKi-P和CaSKi细胞比较,CaSKi-R细胞的生长速率明显减慢和克隆形成率下降,对DDP的敏感性明显增加(P＜0.01),凋亡率明显增加(P＜0.01),P53,Bax蛋白表达明显增加,Bcl-2蛋白表达明显减少(P＜0.01),CaSKi-P和CaSKi细胞比较无差异(P＞0.05).结论:抗HPV16E6-Ribozyme抑制了CaSKi-R细胞的生长和克隆形成率,CaSKi-R细胞对顺铂的敏感性增加.

核素标记不同性质单抗瘤内注射治疗大肠癌的研究

目的:探讨核素标记抗细胞膜抗原单克隆抗体联合核素标记抗细胞核单克隆抗体瘤内注射治疗荷人大肠癌裸鼠移植瘤的可行性和优越性,为临床应用核素标记多种不同性质的单克隆抗体进行放射免疫治疗提供实验依据.方法:在裸鼠荷人大肠癌Lovo移植瘤生长至1 cm左右时,瘤内分别或同时注射1311I标记的抗大肠癌细胞膜抗原CL3单克隆抗体([3]I-CL3)和131I标记人/鼠嵌合抗细胞核的单克隆抗体chTNT(131I-chTNT),治疗后行SPECT显像观察标记抗体在肿瘤内的浓聚,并进行疗效观察.结果:研究发现2种标记抗体联合应用组的肿瘤抑制率为82.3%,明显高于131I-CL3-IT组的57.9%或131I-chTNT组的53.1%,联合应用组标记抗体在肿瘤组织/非肿瘤组织内的放射活度比值(T/NT值)大于单独应用组.结论:131I-CL3联合131I-chTNT瘤内注射放射免疫治疗可增加标记抗体在肿瘤组织内的浓聚,并能提高放射免疫治疗效果.

HBV 3′末端缺失preS/S基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的:克隆HBV 3′末端缺失preS/S基因,构建真核表达载体,转染真核细胞,为进一步进行功能研究奠定基础.方法:采用PCR方法从乙型肝炎病毒全基因组中克隆preS/S基因,构建真核表达载体pcDNA3-preS/S,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定,通过脂质体转染Hela细胞系进行表达研究.结果:1)克隆了3′末端缺失的preS/S基因;2)构建preS/S真核表达载体;3)转染细胞及G418筛选后得到preS/S基因稳定表达的细胞株.结论:3′末端缺失的preS/S基因能够在胞内表达,此研究为基因的功能研究奠定了一定的基础.

脐血CD34+细胞扩增中系特异性分化抗原的变化

目的:探讨CB CD34+细胞扩增的佳HGF组合及移植时机.方法:CB CD34+细胞培养于无血清培养液中,分别加入下列HGF,A组:对照组(无HGF);B组:SCF,IL-3,IL-6;C组:SCF,IL-3,IL-6,G-CSF,Epo;D组:SCF,IL-3,IL-6,TPO,Flt3-L;E组:SCF,IL-3,IL-6,TPO,Flt3-L,G-CSF,Epo.培养22 d.对不同培养时间的细胞进行NC数量及系特异性CD动态观察.结果:同对照组相比,扩增组NC和CD34+细胞均有不同程度的扩增.NC和CD34+细胞扩增高峰分别在第10天和第6天.E组的扩增效果佳.CD检测显示,各组CD34+及CD34+CD38.细胞的比例逐渐减少,但B,D 2组的CD34+CD38-细胞的比例在第6天有一过性回升,CD14+,CD13+,CD61+及Gly-A+细胞的比例则逐渐升高,D组CD34+及CD34+CD38.细胞的比例明显地高于E组(P＜0.01),CD3+和CD19+细胞的比例在扩增中呈下降趋势.结论:HSPC分化程度与HGF组合及培养时间有关.就细胞总数而言,E组HGF组合佳,但就HSPC含量来说,以D组为优.第1周扩增产物中HSPC含量较高,移植时间以扩增的第6～10天为宜.

重组人干细胞因子生物学活性测定的质量控制研究

目的:建立干细胞因子(stem cell factor,SCF)体外生物学活性测定方法,用于该制品生物学效价测定.方法:应用类原巨核细胞白血病细胞系的UT-7细胞株,比较不同细胞浓度、培养时间等条件下应用MTT染色的效果,确定佳实验条件,并用国家参考品校正SCF效价.结果:UT-7细胞对SCF的反应存在量-效关系,并确定了佳测定条件和剂量范围,效价测定重复性好,结果准确、客观,并用于重组SCF新生物制品的效价测定.结论:已建立的UT-7细胞依赖株测定SCF生物学活性的方法可用于SCF的生物学活性的常规评价.

u-PAR反义核酸载体对高侵袭人前列腺癌细胞PC-3M亚系侵袭能力的抑制效应

目的:观察u-PAR反义核酸载体对高侵袭力PC-3M亚系侵袭能力的抑制效应.方法:利用单层细胞侵袭和软琼脂克隆形成实验,对比观察u-PAR反义核酸对高侵袭亚系体外侵袭能力的影响;应用RT-PCR和明胶酶谱法,分析u-PAR反义核酸对高侵袭亚系MMP-9活性的影响,并且观察u-PAR反义核酸载体转染前后的细胞亚系在裸鼠体内成瘤率及转移情况.结果:转染u-PAR反义核酸的高侵袭亚系体外侵袭能力和非贴壁依赖性生长能力均明显降低,抑制率分别为79%和60%;u-PAR反义核酸虽不影响高侵袭亚系MMP-9 mRNA的转录,但对MMP-9酶原的激活有抑制作用;且转染u-PAR反义核酸载体亚系的体内成瘤率和移植瘤的生长明显受到抑制,与对照组之间差异具有极显著性(P＜0.01).结论:u-PAR反义核酸对高侵袭亚系体外侵袭能力有较强抑制作用,并可显著抑制高侵袭亚系的体内生长能力.

含绿色荧光蛋白及小鼠IFN-γ基因的高效真核表达载体的构建与鉴定

干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)作为一种强有力的免疫调节剂已被广泛地应用于一些疾病的治疗,如肿瘤、慢性肉芽肿性疾病、肝纤维化等.

nm23和p16基因协同表达与胃癌临床生物学特性及预后的关系

目的:检测与分析nm23,p16基因在胃癌组织中的表达,并随访5年以上,探讨其与胃癌术后复发转移及生存期的关系.方法:应用免疫组织化学法检测nm23,P16蛋白在胃癌组织中的表达,并随访5年以上.结果:84例胃癌标本中nm23阳性率46.43%,p16阳性率44.05%,胃癌组织及转移淋巴结中阳性率明显低于正常组织和胃良性息肉,而且这2类基因的表达与肿瘤侵袭深度及临床分期有关.随访中发现,阴性表达者死亡率高,转移复发率高,中位生存期短(P＜0.01).结论:nm23,p16基因蛋白异常表达在胃癌的发生发展过程中起重要作用,有可能成为临床评价肿瘤生物学行为及判断预后的标志之一.

白血病瘤苗对荷瘤小鼠细胞免疫功能影响的研究

目的:探讨白血病细胞疫苗主动免疫治疗在血液恶性肿瘤中的作用.方法:建立红白血病荷瘤小鼠,用自制的3种不同的白血病细胞瘤苗进行主动免疫治疗,用MTT比色法测其治疗2周和4周的小鼠Mq和CTL的杀伤活性,并与对照组相比较.结果:①随着肿瘤细胞在小鼠体内的增长,小鼠的细胞免疫功能受到严重抑制,特异性细胞免疫功能的抑制滞后于非特异性细胞免疫功能.②灭活肿瘤细胞+IFA+细胞因子(rGM-CSF+rIL-2+rIL-6)的肿瘤疫苗在提高荷瘤小鼠的细胞免疫功能方面,尤其是特异性细胞免疫功能方面优于灭活肿瘤细胞+IFA肿瘤疫苗,而仅含灭活肿瘤细胞的疫苗作用不明显.结论:灭活肿瘤细胞+IFA+细胞因子(rGM-CSF+rIL-2+rIL-6)的肿瘤疫苗在血液恶性肿瘤的特异性主动免疫治疗中很有潜力.

颗粒外排与Fas/Fas配体途径在人yδT细胞的肿瘤细胞毒活性中的作用

目的:探讨结核杆菌抗原(Mtb-Ag)特异性活化的γδT细胞杀伤肿瘤细胞的细胞毒活性机制.方法:用Mtb-Ag刺激正常人PBMC以诱导γδT细胞扩增并用磁珠阳性分选法获得高纯度γδT细胞;用RT-PCR法检测γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和FasL mRNA的表达;用流式细胞仪检测γδT细胞表面Fas配体(FasL)分子以及几种肿瘤细胞表面Fas分子的表达;用MTT法测定γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性,观察穿孔素/颗粒酶途径的阻断剂concanamycin A(CMA)和Fas/FasL途径的抑制剂brefeldin A(BFA)对γδT细胞细胞毒活性的影响.结果:经Mtb-Ag激活和扩增的γδT细胞高表达穿孔素、颗粒酶B和FasL mRNA;Mtb-Ag活化的γδT细胞中22.4%表达FasL分子;CMA能明显抑制YδT细胞对肿瘤细胞(尤其对Fas低表达的K562和PG)的杀伤,BFA能强烈抑制γδT细胞杀伤Fas高表达的Raji和A375.结论:Mtb-Ag活化的γδT细胞杀伤Fas低表达的靶细胞时主要通过颗粒外排途径,杀伤Fas高表达的靶细胞时,颗粒外排和FasL均起作用.

肝细胞癌中乙型肝炎病毒变异

基因变异是生物适应生存环境和进化的重要手段.乙型肝炎病毒基因变异改变了其致病性及对组织的亲嗜性,导致持续感染、逃避疫苗诱导或自然产生免疫、产生抗药性等,给乙肝防治带来了新的问题.乙型肝炎病毒是引起肝细胞癌的主要原因之一.肝细胞癌中的乙型肝炎病毒变异可能在该病的发病机理中起重要作用.

TRAF2在TNF诱导细胞凋亡过程中的作用及其信号转导途径

TNF诱导细胞凋亡的作用是通过许多信号分子共同参与完成的一个网络工程,其中TRAFs家族蛋白,尤其是TRAF2,是这一信号调节网络的中心环节.本文介绍了TRAF2在TNF诱导细胞凋亡过程中的作用及其信号转导途径.TNFR在与TNF结合后发生聚集,并募集TRAF2直接与TNFR2胞内段结合,或通过结合其他接头分子与TNFRl间接相连,TRAF2主要通过激活NIK和JNK/SAPK 2个独立的信号转导途径对细胞发挥凋亡调节作用,具有凋亡保护功能.深入研究TRAF2的结构与功能,有利于加深对凋亡调节机理的认识.

快速构建腺病毒载体的新方法

目前腺病毒载体已成为重要的基因治疗载体,随着分子生物学技术的迅速发展,构建重组腺病毒的方法有了很大改进,本文主要介绍3种快速构建腺病毒载体的新方法:一是细菌内同源重组法构建重组腺病毒;二是细胞外连接法构建重组腺病毒;三是在黏粒中构建重组腺病毒.3种构建腺病毒载体的新方法相比于传统方法,具有简便、快速,实验周期短的优点.

hTERT的结构功能特点与应用前景

端粒酶是维持染色体末端端粒长度和功能稳定的重要物质.在端粒酶的3个亚单位中,其催化亚单位hTERT与端粒酶的活性、肿瘤的发生、发展、诊断以及恶性程度的判断有着大的相关关系.对hTERT表达的抑制可能会成为治疗肿瘤的一个极有前途的手段.

API4基因为靶的反义寡核苷酸体内外抗肿瘤研究

反义技术是近十几年兴起的一种生物高技术,用反义技术封闭和抑制特定基因的表达是基因治疗的重要组成部分.本研究选取API4基因为靶标进行抗肿瘤反义寡核苷酸的筛选.

共转染野生型p16,p53抑癌基因对HL-60细胞的抑制作用

P53、p16基因均为肿瘤抑制基因,P53蛋白在DNA修复中起重要作用,对抑制肿瘤的发生有重要意义,并与细胞分化有关.P16蛋白与细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)特异性结合使CDK4失活,对细胞周期起反向调节作用,P16蛋白的合成障碍,将引起细胞增殖的失控.

日达仙诱导肿瘤细胞凋亡的研究

细胞凋亡是有机体各组织细胞衰老和死亡的主要形式,而肿瘤细胞的增殖与凋亡,决定了肿瘤发生、发展和转归.当肿瘤细胞凋亡基因被抑制,致癌基因活化,则导致肿瘤细胞无限制的增殖、浸润和转移.本研究通过对日达仙(Tsα1)体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究,探讨Tsα1治疗肿瘤的作用机制.

高滴度逆转录病毒载体4种转染方法对小鼠脾脏T细胞转染率的比较

逆转录病毒为研究和应用广泛的一种病毒载体,应用衣霉素(Tunicamycin)处理包装细胞后病毒滴度明显提高,在此基础上应用4种方法转染小鼠脾脏T细胞,比较4种方法的转染率.

大鼠γ-干扰素基因转染大鼠肺泡巨噬细胞的实验研究

细胞因子是调节机体细胞免疫的重要物质.已有实验证实局部补充γ-干扰素可通过调节宿主肺部细胞免疫功能,从而明显增强其抗肿瘤、抗感染的能力.肺泡巨噬细胞是肺部防御的首要细胞,是肺部免疫细胞的第一道防线,占正常动物支气管肺泡灌洗液中细胞的90%以上,在肺部抗肿瘤和抗感染免疫中起重要作用.

裸DNA接种新途径:淋巴结内接种

干细胞研究的进展与应用前景

干细胞(stem cell,SC)是一类具有自我更新和多向分化增殖潜能的原始细胞,能产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞,形成人体多种组织器官的祖细胞,既具有生理性的更新能力,又具有对损伤与疾病导致的反应与修复功能.