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肠出血性大肠埃希杆菌O157:H7溶血毒素的检测方法
我们曾和美国马利兰大学发展了鉴定肠出血性大肠埃希杆菌的探针,其特异性和灵敏性极高。经序列分析发现该探针是溶血素基因的部分片段。我们又从溶血表型进一步完善了这一鉴定方法。由于其溶血条件特殊,人们一直认为该菌不溶血。我们将经验总结报告如下。 一、材料和方法 1.菌种来源:肠出血性大肠埃希杆菌882364,1986年江苏省徐州市卫生防疫站分离,经本实验室鉴定,并保存。851006为本实验室筛选到的溶血素基因的天然缺失株(对照菌株)。 2.菌株鉴定:生化鉴定为大肠埃希菌。O157单抗和H7血清为本实验室制备。用O157:H7 PCR诊断试剂盒检测882364、851006的溶血素基因,882364的扩增结果为阳性,851006为阴性。 3. 血平板的制备[1]:脱纤维羊血用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,加入至终浓度为3%。培养条件:于混合气(8%CO2,40%H2,52%N2)环境中37℃培养16 h,然后置21℃空气中6 h。 4.液体溶血活性检测[2]:(1)标准1%羊红细胞的制备;(2)活化菌体;(3)活性检测。 二、结果血平板检测的结果需对光观察,如发生溶血,可见菌落周围透明溶血环。液体溶血检测的结果如只需定性,则A值大于完全不溶血管即可;如需相对定量,可用溶血单位(HU)表示,一个溶血单位(HU)为裂解50%羊红细胞的检测样品的量。
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髓过氧化物酶染色改良3-氨基-9-乙基咔唑法
髓过氧化物酶(MPO)染色对急性白血病分型与白细胞MPO缺陷症的诊断有重要意义,是国际血液学标准化委员会推荐的血细胞化学染色方法之一[1,2].在诸多的MPO染色方法中,由于3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)法具有染色效果良好与试剂安全等优点,被认为是一种取代Washburn法比较理想的方法[3].我们试用含AEC的Wright-Giemsa(W-G)染液和磷酸盐缓冲液进行MPO染色,染色效果同样理想,从而建立了一种简易的MPO染色AEC法.
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应用抑制性消减杂交技术筛选rhALR调节基因
目的:筛选与克隆重组人肝再生增强因子激活基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:应用大肠杆菌系统,表达、纯化重组人肝再生增强因子蛋白.刺激HepG2细胞,以溶剂PH7.8的磷酸盐缓冲液为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建重组人肝再生增强因子激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到30个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得19种编码基因,包括15种已知基因和4种未知基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因,推测了重组人肝再生增强因子在体内可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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肺癌细胞端粒酶活性表达与肺癌分期关系的研究
近年来人们对肺癌发生的分子生物学机制有了深入了解,并力图从分子水平寻找新的治疗靶点。与细胞生存密切相关的端粒酶作为肿瘤细胞的标志物之一,有可能成为诊断或治疗的靶位点。本文通过测定手术后肺癌组织和癌旁肺组织的端粒酶mRNA表达,研究其与肺癌TNM分期的关系[1,2]。 对象与方法 1.研究对象:29例肺癌及癌旁肺组织取自山西医科大学第二医院胸外科和山西省肿瘤医院胸科手术切除标本,均于离体后0.5 h前采集,用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗血污后,-80℃冰箱储存备用。所有病例均经病理证实为肺癌,男21例,女8例,年龄23~77岁,中位年龄56岁。其中鳞癌10例,腺癌12例,大细胞肺癌2例,小细胞肺癌5例;T19例,T214例,T36例;N010例,N112例,N27例;Ⅰ期15例,Ⅱ期8例,Ⅲ期6例[3]。术前均未行放疗及化疗。
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口服接种乙型肝炎病毒核酸疫苗诱生小鼠体液免疫应答的初步研究
接种乙型肝炎疫苗(乙肝疫苗)是控制乙型肝炎病毒感染的根本措施.近年来正在大力研制核酸疫苗,以补充现行乙肝疫苗的不足并开发用于治疗性疫苗[1].但一般疫苗多为注射方式接种,给被接种者带来疼痛与不便;因此,疫苗剂型口服化一直是新型疫苗的研制方向之一[2].一、材料和方法1. 口服剂型乙肝核酸疫苗(NVO-HB/s)的制备:将HBsAg的编码基因S插入真核细胞表达质粒pRc/CMV,获得重组质粒pRc/CMV-S,可高效表达HBsAg主蛋白[3];用以转化各载体菌株:伤寒杆菌基因工程减毒株CVD908、嗜酸乳杆菌La1株(均系中国预防医学科学院流行病学研究所徐建国教授惠赠)及酵母菌Z97株.各转化菌分别抽提、纯化获得质粒DNA,经鉴定确认转化成功;将上述各转化菌用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)定容至所需浓度与剂量;即为口服剂型乙型肝炎病毒核酸疫苗(NVO-HB/s).
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豚鼠耳蜗内淋巴囊免疫反应后可诱导一氧化氮合酶的表达
在豚鼠耳蜗内淋巴囊注入钥孔(虫戚)血蓝素(KLH)之后,对豚鼠耳蜗内可诱导性一氧化氮合酶(iNOS或NOSⅡ)进行了免疫组织化学研究。所选实验动物为体重约350~400克的豚鼠12只,均被证实耳廓反射阳性,并用显微镜观察排除了中耳炎疾患。将动物分成两组,实验组注射KLH,对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS)。实验组内淋巴囊内注射KLH后,每只动物耳……
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抗癫痫药物加巴喷丁
1性状描述加巴喷丁的结构与γ-氨基丁酸(GABA)相似,白色或类白色结晶,PKa1=3.7,PKa2=10.7,易溶于水、碱性溶液和酸性溶液,在正辛醇0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中分配系数的对数为-1.25.
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对格列吡嗪片含量测定方法的建议
格列吡嗪片为磺酰脲类非依赖性降糖药,收载于<中国药典>2000年版二部[1].其含量测定方法为紫外分光光度法,操作方法为"精取适量(约相当于格列吡嗪2.5mg),置100ml量瓶中,加磷酸盐缓冲液(pH7.4)适量,置水浴中加热10min,充分振摇使格列吡嗪溶解……弃去初滤液35ml,取续滤液做为供试品溶液."溶解后的溶液呈乳白色,经分别用慢速滤纸、0.8μm滤膜、0.45μm滤膜滤过,所得溶液均不澄清.如将上述方法中的"置水浴中加热10min"改为"置热水浴中加热10min"用0.45μm与0.8μm滤膜均可滤得澄清溶液.表1为两种溶解方法和三种滤过方法测得的吸收度所计算的含量测定结果.
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关于诺氟沙星滴眼液含量测定方法的商榷
<中国药典>1995年版二部诺氟沙星滴眼液的含量测定方法为"精密量取本品适量,加磷酸盐缓冲液(pH7.4)制成每ml中约含5μg的溶液,照分光光度法(附录WA),在273nm的波长测定吸收度;另取诺氟沙星对照品,按上法同样操作,根据二者吸收度比值计算,即得".而笔者在实际检验工作中发现,本法难以达到含量测定的要求,有以下二点提出来商榷:
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西立伐他汀钠片溶出方法的改进
西立伐他汀钠片是冠心病合并高胆固醇血症的首选药物.厂方提供的质量标准,其溶出度采用中国药典2000年版法,以磷酸盐缓冲液(pH6.8)900 mL为溶剂进行测定时,由于溶出液中主成分的量很低(0.4 μg*mL-1),而实验所用的玻璃仪器、滤膜等对西立伐他汀钠又有极强的吸附作用,导致测定结果明显偏低.考虑到上述影响因素,根据中国药典2000年版二部附录XC第三法的方法,以磷酸盐缓冲液(pH6.8)100 mL为溶剂依法操作.由于溶剂体积的减少,供试品溶出液的浓度相应增大10倍(4 μg*mL-1),吸附作用对测定结果影响较小,重现性好.
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盐酸小檗碱片含量测定方法的改进
盐酸小檗碱片是用于治疗肠道感染的抗菌药,其含量测定方法,2000年版《中国药典》采用的是反滴定法[1],2005年版《中国药典》采用的是高效液相色谱法[2],液相法与滴定法相比较,方法快速、简便、重复性好.2005年版《中国药典》测定方法中流动相的组成是:磷酸盐缓冲液-乙腈(60∶40),其磷酸盐比例高,对色谱柱的损害较大,乙腈对人体的危害较大.鉴于此,笔者改变流动相,用甲醇和水作为流动相,并与标准方法相比较,结果较为满意.
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头孢克洛药动学及相对生物利用度的研究
对头孢克洛(Cefaclor)分散片和胶囊进行了药动学及相对生物利用度的研究,以评价两种制剂的生物等效性,并为临床合理用药提供药动学依据.1 材料与方法1 1 药品、试剂与仪器头孢克洛胶囊(山东淄博新达制药有限公司,0 25 g,批号980303),头孢克洛分散片(河南华鑫制药厂,0 25g,批号980303),头孢克洛标准品(中国药品生物制品检定所),甲醇、乙腈(色谱纯,山东禹王实业总公司化学试剂厂),磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(A.R.,北京化工厂),蒸馏水均经重蒸馏.LC-10A高效液相色谱仪: LC-10AD高压输液泵,SPD-10A紫外检测器,CR-7A数据处理机(日本岛津).色谱条件[1]:Shim-packCLC-ODS分析柱(250mm×4 6mm,5μm),流动相:磷酸盐缓冲液(pH=5 8)-乙腈(87 5∶12 5,V/V),流速:1 2ml@min -1,柱温:室温,UV检测条件:λ=210nm,灵敏度:0 003 AUFS.
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Tregs对同种异体牙移植免疫排斥反应的抑制作用
目的 探讨Tregs对同种异体牙移植术后免疫排斥反应的抑制作用,提供一种免疫移植方法.方法 免疫抑制剂Tregs给予白鼠尾巴静脉注射1周,建立白鼠同种异体牙移植模型,术后观察移植牙存活、排异发生率及程度.结果同种异体牙均诱发免疫排斥反应,但Tregs注射后免疫排斥反应的时间缓慢,组织切片存活时间显著延长(P<0.01).结论 使用免疫抑制剂是预防同种异体牙移植免疫排斥反应的有效方案,可以使同种异体牙移植免疫排斥反应延迟,存活时间延长.
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美容美发工具乙型肝炎表面抗原污染调查
为了解美容美发工具乙型肝炎表面抗原(HBsAg)污染状况,随机抽查了39户美容美发厅(店)的美容美发工具进行了HBsAg检测.检验方法为:用棉拭子蘸取1%血清磷酸盐缓冲液(pH7.2~7.4),对美容美发工具用采样拭子涂抹,再将其浸入1.5 ml血清磷酸盐缓冲盐水经2%Tween 80中和带回实验室.将样品置4冰箱内过夜,取浸出液用酶联免疫吸附法(ELISA)检测. 涂抹方式为:推子前部、剃刀、剪刀的两侧面,挡刀布的磨刀面,胡刷内外面,梳子齿两侧面,暗疮针、纹眉针表面,海绵面扑两侧,电热帽、焗油机触发面,毛巾对折平面中央5 cm×5 cm处,电吹风出风口端表面各均匀涂抹5次.纹眉针、暗疮针、剪刀、梳子两件合为一个样品,其他一件一个样品.
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LC/MS法同时测定食品中9种甜味剂
用0.08 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)-乙醇(1:1)直接提取食品中乙酰磺胺酸钾(AK)、三氯蔗糖(SUC)、糖精(SA)、环己基氨基磺酸盐(CYC)、阿斯巴甜(APM)、甘素(DU)、甘草酸(GA)、甜菊甙(STV)和甜菊苷A(REB)9种甜味剂,用C18柱净化.用5 mmol/L乙酸二丁基铵(DBAA)和乙腈-水(8:2)为流动相,用LC/MS测定.在辣酱油等5种食品中添加0.01、0.05和0.20 g/kg 9种甜味剂,其回收率为75.7%~109.2%.定量限AK、SA、CYC、APM和STV为0.001 g/kg,SUC、DU、GA和REB为0.005 g/kg.
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高铁血红蛋白测定波长的校正
高铁血红蛋白(MetHb)的检测有化学法及仪器法…,其测定原理是利用MetHb特殊吸收波长完成。因此波长的选择是测定结果准确与否的重要条件。但文献报道,测定MetHb波长为630~634 nm[2]、630 nm[3]、635 nm[4]、632 nm[1]等,为保证实验结果准确可靠,我们利用自身实验室条件校正比色计波长并确定MetHb佳比色波长。1.仪器:722光栅分光光度计。2.试剂:(1)溴甲酚绿溶液:取溴甲酚绿0.1 g,溶于体积分数为20%的乙醇溶液100ml中,微微加热至完全溶解,过滤后10倍稀释。(2)次甲基蓝溶液:取次甲基蓝0.1 g,溶于100ml重蒸馏水中,微微加热溶解,过滤后稀释1 000倍。(3)0.02 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液。(4)质量浓度为10%的高铁氰化钾。
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间接免疫荧光法检验抗ds-DNA抗体方法
ANA泛指抗各种核成分抗体,无器官和种属特异性,血清滴度≥1∶80可作为诊断SLE标准之一.而ANA中的抗ds-DNA抗体具有特征性,是诊断SLE、监测其活动和判断预后的重要指标.本文报告我室的检测方法如下.1 实验材料①0.01mol/L pH 7.2~7.4磷酸盐缓冲液(PBS);②0.1mol/L磷酸盐缓冲甘油;③小白鼠(昆明种KM);④0.1N盐酸;⑤GAH-IgG-FITC应用液用PBS 1∶500稀释;⑥荧光显微镜.
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高效液相色谱法测定手指血中苯巴比妥浓度
苯巴比妥(phenobarbital,PB)是临床上常用的治疗癫痫、热惊厥和新生儿黄疸等症的药物,患者体内苯巴比妥血浓度是临床调整剂量、评价疗效、实施苯巴比妥的个体化治疗和提高患者依从性的主要依据之一[1]。国内外多采用静脉血对其进行血药浓度监测。癫痫和热惊厥患者多为儿童[2],静脉采血有一定难度,手指采血具有简便、快捷,患儿易于接受等特点,便于长期反复监测。我们对26例口服苯巴比妥的患者同时采集其静脉血与手指血,采用RP-HPLC法测定苯巴比妥血浓度,以探讨用手指血监测苯巴比妥血浓度的可能性。1 材料1.1 病例26例患者均为癫痫门诊患者。年龄5个月~48岁,男16例,女10例。癫痫发病类型:全身强直-阵挛发作9例,部分性继发全身强直-阵挛发作4例,部分性发作11例,婴儿痉挛症并部分性发作1例。1.2 仪器与试剂美国贝克曼公司SYSTEM GOLD型高效液相色谱仪,配备125泵,168DAD紫外检测器,SYSTEMGOLD色谱工作站。贝克曼公司产CS-15R高速离心机。色谱柱:ODS(5μm,4.6mm×25cm)。苯巴比妥对照品与内标巴比妥由国家麻醉品实验室提供。巴比妥用甲醇溶解制成标准储备液,置-20℃保存。将巴比妥标准储备液用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.6)稀释成84ng/ml作为内标工作液,4℃存放。甲醇:色谱纯,购自FISHER公司。水系超纯水。其他试剂均为分析纯。
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复方环磷酰胺多相脂质体注射剂的制备与质量的提高(下)
缓冲溶液的配制:环磷酰胺水溶液pH值4.5~6.5,猪苓多糖水溶液pH值6.5~7.5,为保证各种成份的大溶解度和稳定性,确定将复方环磷酰胺脂质体缓冲液pH值定为6.5,采用磷酸盐缓冲液,其配方如下:磷酸二氢钠4.8 g,磷酸氢二钠3.77 g,注射用水加至1 000ml.
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西藏地区结核分枝杆菌耐药情况分析
我们对收集的50株分枝杆菌临床分离株进行了菌种鉴定和耐药分析,从一个方面揭示了西藏结核病的流行特征以及分枝杆菌的菌种分布和耐药情况.1 材料与方法1.1 痰标本的分离培养:受检对象留取清晨痰标本3~5 mL,采用4%NaOH经2~4倍体积消化20 min后, 5 000~10 000 r/min,离心10 min,沉淀经无菌100 μL pH6.8磷酸盐缓冲液洗涤2次,再加入1 mL上述缓冲液混悬沉淀,各取0.5 mL,接种于改良L-J 培养基中37 ℃培养.8周未见生长,报告分枝杆菌培养阴性.