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IGF-IR反义基因对肝癌细胞株病理形态学的影响及其机制
目的:研究胰岛素样生长因子I型受体(insulin-lik growth factor-I receptor,IGF-IR)反义基因对SMMC-7721肝癌细胞株形态学的影响,为肝癌的发病机制提供理论基础.方法:构建IGF-I R正、反义基因真核表达载体,脂质体介导将其转入SMMC-7721肝癌细胞株,HE染色、电镜检查肝癌细胞株形态学的变化,流式细胞仪检测细胞周期、凋亡.结果:HE染色IGF-I R反义细胞与正义细胞、7721细胞无明显变化.扫描电镜:IGF-I R正义细胞异形性明显,微绒毛较反义细胞、7721细胞显著.透射电镜:7721细胞大小不等,细胞器增多,核浆比例增大.IGF-工R反义细胞胞质内可见微腺腔、灶性坏死、髓鞘样结构.流式细胞仪检测IGF-I R反义细胞G1期细胞明显增加(0.64),S期细胞减少(O.19),而且凋亡增加(0.06).IGF-IR正义细胞S期细胞增加(0.35),凋亡减少(0.01).反义细胞与正义细胞、7721细胞比较有非常显著性差异(P＜0.01).结论:反义细胞中出现的异常形态学改变可能与IGF-I R反义基因抑制细胞增生、促进细胞凋亡有密切关系.
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2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖诱导肝癌细胞凋亡的形态学变化
目的:探讨2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖诱导肝癌细胞株HepG2凋亡的可能性.方法:选用不同浓度的2-(3-羧基-l-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖与肝癌细胞株共同孵育不同时间后,应用倒置相差显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜对细胞生长状况及药物作用后细胞的形态进行观察.结果:经2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖作用24-72 h后,HepG2肝癌细胞株出现体积缩小,荧光染色增强,胞核或胞质中可见致密浓染的块状或颗粒状黄绿色荧光染色.染色质固缩,并凝结成块,聚集在核膜周边呈新月状或肾状,胞质浓缩,内质网疏松并与胞膜融合形成-个个空泡.且凋亡细胞含量呈一定的浓度、时间相关性.结论:2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖具有诱导HepG2细胞凋亡的作用.
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肝细胞癌DNA修复酶hMTH1基因mRNA及其蛋白的表达
目的:通过检测DNA修复酶hMTH1 mRNA及其蛋白在肝细胞癌组织及细胞株中的表达,探讨hMTH1在肝细胞癌发生、发展及防御机制中的作用.方法:采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)研究肝癌(HT,n=33)、癌旁组织(HST,n=33)和正常肝细胞株(L-02)、肝癌细胞株(SMMC7721,HepG2)中hMTH1mRNA的表达,同时采用免疫组织化学方法原位检测了上述的肝癌组织(n=17)及癌旁组织(n=17)中hMTH1蛋白的表达.结果:绝大部分检测对象中均有不同程度hMTH1 mRNA及其蛋白的表达.肝癌组织中hMTH1 mRNA的表达较癌旁组织显著升高(t=2.424,P=0.021＜0.05);SMMC7721,HepG2细胞中hMTH1 mRNA的表达显著高于L-02细胞(F=6.810,P=0.009＜0.01).SMMC7721与HepG2细胞中hMTH1 mRNA的表达没有显著差异(P=0.395＞0.05).hMTH1蛋白主要在肝细胞胞质中表达,肝癌组织中hMTH1蛋白水平明显高于癌旁组织(t=2.618,P=0.019＜0.05).结论:hMTH1mRNA及其蛋白在肝癌组织及肝癌细胞株中表达升高.
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短发夹RNA抑制外源荧光素酶在肝癌细胞中的表达
目的:构建含荧光素酶(1uciferase,luc)基因的短发夹状RNA(shorr hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其在肝癌细胞Bel-7402中抑制外源荧光素酶的表达.方法:设计的两条反向重复的多聚核苷酸序列,退火形成双链DNA,再与双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-luc重组质粒,与荧光素酶基因表达质粒pCMV-luc共转染肝癌细胞株BEL-7402,检测其对荧光素酶表达的影响.结果:PCR和DNA序列分析证实了重组质粒构建成功.pshRNA-luc对共转染的pCMV-luc中的荧光素酶具有明显的抑制作用,抑制率可达86%(P＜0.01).结论:构建的pshRNA-luc表达质粒能有效地抑制荧光素酶在肝癌细胞中的表达,为RNA干扰用于肿瘤的基因治疗打下基础.
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滑膜肉瘤X断点基因在原发性肝癌中的表达及意义
目的 检测原发性肝癌(HCC)中滑膜肉瘤X断点基因(SSX基因)的表达及其与临床指标的相关性.方法 实时PCR检测SSX1-SSX5 mRNA的表达;蛋白印迹和免疫组化检测SSX1蛋白表达;分析SSX mRNA表达和SSX1蛋白表达与临床指标的相关性.结果 在肝癌细胞株BEL-7404、Hep G2、SMMC-7721,检测到SSX1、SSX2、SSX3 mRNA表达.在26例HCC组织SSX1、SSX2、SSX3、SSX4、SSX5 mRNA水平均有表达,表达率分别为53.8％、42.3％、50.0％、46.2％、26.9％.SSX1 mRNA的表达与AFP水平无关(P＞0.05),在正常值组及高值组均有较高的表达率,高龄组的表达率(85.7％)高于低龄组(16.7％,P＜0.05).在肝癌组织SSX1蛋白的表达率为50％,癌旁及肝硬化组织中均无表达.49例HCC石蜡组织切片检测:SSX1蛋白的表达率(46.9％)高于配对癌旁组织的表达率(18.4％,P＜0.05).SSX1蛋白在大肝癌组的表达率(68.3％)高于小肝癌组(29.6％,P＜0.05).结论 SSX1 mRNA基因在HCC中呈高比例、高特异表达,为HCC免疫治疗提供了新的理想靶位.SSX1表达检测对HCC的辅助诊断具有潜在价值.
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白细胞介素12融合基因联合白细胞介素2对肝癌的基因治疗
我们在肝癌基因治疗目的基因筛选的实验中发现,在大鼠肝癌模型中,IL-12的基因治疗作用为显著[1,2],若同时联合IL-2,有望进一步提高对肝癌的治疗效果.1.材料与方法:大鼠肝癌细胞株CBRH3由中科院细胞所谢弘教授惠赠.以质粒GCp35Ep40PN为模板,PCR分别扩增p35和p40亚基基因.以PCR产物为模板,用p40上游引物和p35下游引物再次进行PCR反应,构建mIL-12融合基因.mIL-12和hIL-2基因分别插入逆转录病毒载体GCXEXPN,命名为GCIL12EXPN和GCXEIL2PN、GCIL12E-IL2PN.按常规方法筛选逆转录病毒载体GCIL12EXPN、GCXEIL2PN、GCIL12E-IL2PN的PA317包装细胞株,测病毒滴度.用CBRH3建立大鼠接种肝癌模型,分为生理盐水、LacZ载体对照组和IL-2、IL-12、IL-12+IL-2治疗组,每组10只大鼠,将包装细胞株脾内注射进行治疗.方差分析结果.
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高表达GCS基因对肝癌细胞株HepG2耐药性的影响
多药耐药(multidrug resistance,MDR)是导致肝癌化疗失败的主要原因.近年来,葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase,GCS)在肿瘤多药耐药中的作用逐渐受到重视.我们通过基因转染使肝癌细胞HepG2内GCS高表达,观察肝癌细胞对5-Fu敏感性的变化,进一步探讨肝癌细胞多药耐药的发生机制.
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应用HBV-Alu-PCR研究肝癌细胞株中乙型肝炎病毒整合
目的 探讨常见肝癌细胞株中整合的乙型肝炎病毒(HBV)序列和整合位点.方法 分别将来源于HBV感染者的肝癌细胞株(MHCC97H、MHCC97L、MHCCLM3和PLC/PRF/5),稳定转染HBV的肝癌细胞株(HepG2.2.15、HepAD38和DE19),和无HBV感染者来源的肝癌细胞株(HepG2、HuH-7)培养72 h,检测培养上清中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)及HBV DNA滴度.采用HBV-Alu-PCR方法,扩增肝癌细胞株中整合的HBV基因X/C/S片段及其侧翼的人基因组DNA片段,对扩增片段进行测序确定HBV整合在人类染色体的精确位置,并用生物信息学分析确定其上下游基因.结果 MHCC97H、MHCC97L和MHCCLM3未检出HBsAg和HBeAg,但HBV DNA滴度为2.00 × 105~4.00 × 105IU/ml;HepG2.2.15、HepAD38、DE19和PLC/PRF/5 HBsAg阳性,且HBV DNA滴度> 5.00 ×105IU/ml,其中HepG2.2.15、HepAD38HBeAg阳性;HepG2、HuH-7 HBsAg、HBeAg和HBV DNA均低于检测下限.除HepG2和HuH-7未检测到整合外,其余细胞株中可检测到1个或多个整合的不同HBV亚基因组片段:HepG2.2.15检测到5个HBx和HBc整合片段,HepAD38和PLC/PRF/5各检测到2个HBx整合片段,DE19检测到一个HBc整合片段.3个MHCC97的衍生细胞株:MHCC97L(低转移潜能肝癌细胞)、MHCC97H(高转移潜能肝癌细胞)和MHCCLM3(MHCC97H肺转移肝癌细胞)检测到完全相同的HBc片段整合在16q13上IRX3和IRX5基因之间的非编码区.此外,各细胞株HBV整合位点上下游的基因主要包括肿瘤相关基因,核糖体蛋白编码基因和钙信号相关基因.结论 HBV感染者来源和稳定转染HBV的肝癌细胞株存在HBV整合;HBV基因X/C片段比S片段有更高的整合频率;同一个克隆来源的肝癌细胞株的HBV整合位点稳定,提示HBV整合分析可能对肝细胞癌原发灶和转移灶癌细胞克隆来源的鉴定提供参考.
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IL-12基因修饰树突状细胞体外诱导免疫杀伤肝癌细胞
树突状细胞(dendritic cell,DC)是体内功能强的抗原呈递细胞,通过IL-12基因修饰DC可望使其在呈递肿瘤抗原的同时又持续分泌高滴度的IL-12,从而更有效地诱导T淋巴细胞增殖、分化,进一步增强特异性抗肿瘤免疫.我们采用HepG2肝癌细胞株的肿瘤相关抗原(TAA)致敏IL-12基因修饰的DC,观察了其体外诱导自体T淋巴细胞产生特异性抗肝癌免疫的效能.
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60Coγ射线对肝癌细胞株p27kip1表达及其分布的影响
近研究表明电离辐射可以改变细胞周期的进程,而且不同的辐射敏感性细胞辐射后存在不同细胞周期变化规律[1].已有的研究发现60Co γ射线对于卵巢癌细胞(A2780)和血管平滑肌细胞(VSMCs)主要发生G1期阻滞[2,3],而对白血病细胞(HL-60)主要是G2+M期阻滞[4].p27kip1是一类细胞周期素依赖的蛋白激酶抑制剂,作为细胞周期负性调因子,参与细胞周期调控[5].近有研究者发现细胞G2+M期阻滞p21蛋白高表达和p27kip1蛋白的低表达共同调控[6],但是p27kip1蛋白在γ射线引起的细胞周期改变过程中表达和分布的改变并不清楚.因此,笔者着重探讨60Co照射改变肝癌细胞(HepG2)周期改变过程中p27kip1蛋白在细胞核和细胞浆内分布和表达的变化.
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肝癌干细胞的靶向示踪及治疗
自干细胞概念引入肿瘤研究后，肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）学说开始逐渐形成。Ma等[1]报道，肝细胞型肝癌细胞株中存在功能性的肝癌干细胞（liver cancer stem cells，LCSCs）；Sell[2]用实验证实，肝干细胞在致癌基因和化学致癌剂的诱导下可以转化成癌前细胞并终形成肝癌。CSCs学说为人类认识肿瘤提供了一个崭新的视野，特异性靶向杀伤CSCs将为肿瘤治疗带来新的希望。笔者对肝癌干细胞的靶向示踪及治疗进行综述。
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转染HBx诱导肝癌细胞株Bel-7404多药耐药的初步研究
目的 研究HBx转染对肝癌细胞株Bel-7404增殖、细胞周期以及多药耐药的影响,并探讨HBx转染诱导肝癌多药耐药发生的可能机制.方法 选用人肝癌Bel-7404细胞株进行转染,根据HBx转染情况将细胞分为三组,分别为转染HBx细胞组(Bel-7404-HBx组)、转染空载体细胞组(Bel-7404-con组)和空白细胞组(Bel-7404组);实时定量PCR检测各组细胞中HBx RNA的表达.Western blot法检测各组细胞中HBx、Notch-1和多药耐药蛋白(MRP)的表达,CCK-8法检测各组细胞增殖活性和多药耐性,流式分析仪检测各组细胞生长周期.结果 PCR扩增凝胶电泳显示Bel-7404-HBx组有HBx片段出现,而其他两组未见HBx mRNA的表达;Western bolt结果显示在Bel-7404-HBx组处有蛋白条带(即HBx蛋白),而Bel-7404组和Bel-7404-con组未见表达.与Bel-7404组和Bel-7404-con组比较,Bel-7404-HBx组细胞增殖显著加快(P＜0.05);与Bel-7404组和Bel-7404-con组比较,Notch-1和MRP在Bel-7404-HBx组的蛋白表达增加;细胞周期结果显示,与Bel-7404组和Bel-7404-con组比较,Bel-7404-HBx组Go/G1期细胞显著减少(P＜0.05),S期显著增加(P＜0.01),G2/M期变化不大(P＞0.05);多药耐药实验显示,与Bel-7404组和Bel-7404-con组比较,丝裂霉素、阿霉素、5-氟尿嘧啶、顺铂和奥沙利铂在Bel-7404-HBx组中耐药指数明显增加(P＜ 0.05或P＜ 0.01).结论 转染HBx的Bel-7404细胞可能通过诱导Notch-1与MRP的过表达,终导致肝癌细胞株Bel-7404增殖能力增强和多药耐药的发生.
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癌-睾丸抗原SSX基因在肝细胞癌中mRNA水平的表达及意义
目的 观察癌-睾丸抗原SSX基因在肝癌组织和肝癌细胞株中mRNA水平的表达情况,探究该基因家族的表达与肝癌的诊断、治疗的关系,进而评价该基因家族作为肝癌免疫治疗靶点和多价肿瘤疫苗研制的可行性.方法 对28例肝细胞癌和癌旁组织、3例肝硬化组织以及肝癌细胞株7404、HePG2、7721采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测癌-睾丸抗原SSX基因在mRNA水平的表达情况.结果 SSX-1、SSX-2、SSX-3在肝癌癌旁组织和肝硬化组织中均不表达.在收集的肝细胞癌组织中SSX-1、SSX-3基因表达阳性率较高(53.6%、57.1%),SSX-2表达阳性率相对较低(35.7%),其中SSX-1、SSX-2、SSX-3三种基因共同表达的有6例(21.4%),至少有两种SSX基因表达的有23例(82.1%).结论 癌-睾丸抗原某些SSX基因在肝细胞癌中高频率表达与肝癌的发生、发展有关,同时基因的共同表达结果又为多价瘤苗的研究提供了实验方向.
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三氧化二砷对肝癌细胞凋亡的诱导及机理的探讨
三氧化二砷(arsenic trioxide)可诱导急性早幼粒细胞性白血病细胞凋亡,并取得了满意的临床效果.那么三氧化二砷对实体肿瘤的治疗效果又如何呢?本实验旨在探讨三氧化二砷对肝癌细胞株的作用,及其发挥作用的机制. 一、材料与方法
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细胞外信号调节激酶激酶5在肝癌细胞株中的异常表达及其临床意义
目的:分析细胞外信号调节激酶激酶5(MEK5)在肝癌细胞株中的表达水平及其临床意义.方法:使用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法等方法,分别检测肝癌细胞株(HepG2、Huh7)和正常肝细胞株(LO2)中的MEK5表达水平;shRNA转染肝癌细胞致MEK5基因沉默后,检测其对MEK5蛋白表达和细胞增值率的影响.通过t检验对各组进行评估.结果:与MEK5在正常肝细胞株中的蛋白表达(0.8765±0.0031)相比,MEK5在肝癌细胞株中过度表达(HepG2:1.7206±0.0031;HuH7:1.1676±0.0053,P<0.01);与MEK5在非特异性shRNA转染的细胞株中的蛋白表达(HepG2:1.5508±0.0029;HuH7:1.2167±0.0033)相比,MEK5特异性shRNA转染后细胞株中的蛋白表达(HepG2:0.5339±0.0031;HuH7:0.4639±0.0013)受到显著抑制(P<0.01).结论:MEK5在肝癌细胞中过度表达;抑制MEK5的表达后,肝癌细胞生长也受到抑制.
关键词： 细胞外信号调节激酶激酶5 肝癌细胞株 蛋白表达 基因沉默 -
他克莫司在体外对肝癌细胞HepG2和HepG2.2.15增殖的影响
目的：研究他克莫司（tacrolimus ，FK506）在体外对肝癌肿瘤株HepG2和乙肝相关肝癌株HepG2.2.15增殖的影响。方法：体外培养肝癌细胞HepG2和HepG2.2.15，采用MTT法、流式细胞技术，分别检测细胞增殖、细胞周期、CyclinA。结果：FK506可以显著抑制HepG2和HepG2.2.15细胞增殖，其抑制增殖作用随剂量增加而增强；FK506诱导细胞产生G0/G1期阻滞，这种抑制作用有浓度依赖性；FK506对周期蛋白CyclinA表达的影响呈浓度负相关性，FK506浓度越高，周期蛋白CyclinA表达越少。结论：FK506可以抑制肝癌细胞HepG2和乙肝相关肝癌细胞HepG2.2.15的增殖，这种作用可能与诱导细胞周期阻滞有关。
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黄芩素对人肝癌细胞株SMMC-7721体外迁移及侵袭的影响
目的:通过观察黄芩素对人肝癌细胞株SMMC-7721体外迁移侵袭能力及Ezrin、MMP-9、VEGF表达的影响,探讨黄芩素对人肝癌细胞株SMMC- 7721体外迁移侵袭的作用及其可能机制.方法:体外培养SMMC-7721,经黄芩素干预后用划痕愈合实验和侵袭小室实验分别检测黄芩素对SMMC-7721细胞迁移运动能力和侵袭能力的影响;RT-PCR和免疫细胞化学法检测黄芩素作用于SMMC-7721细胞48h后对Ezrin、MMP-9、VEGF mRNA和蛋白表达的影响.结果:划痕愈合实验显示各浓度实验组划痕愈合宽度占原宽度的比例比对照组明显下降(P<0.05);体外侵袭实验显示实验组穿过人工基底膜胶的细胞数明显减少(P<0.05);实验组Ezrin、MMP-9、VEGF mRNA和蛋白表达均明显下调(P<0.05).结论:黄芩素可能通过直接或间接下调Ezrin、MMP-9、VEGF mRNA和蛋白的表达而抑制人肝癌细胞株SMMC- 7721体外迁移侵袭,传统中药黄芩可望为肝癌临床治疗提供新的安全、有效、价廉的治疗方法.
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大黄素在体外诱导人肝癌细胞smmc-7721凋亡的实验研究
目的:研究Emodin(大黄素)对人肝癌细胞smmc-7721的作用及探讨其诱导人肝癌细胞凋亡的分子机制.方法:肝癌细胞smmc-7721经emodin(大黄素)处理后,用MTT法观察emodin对肝癌细胞株smmc-7721细胞增殖的抑制作用,荧光显微镜、DNA凝胶电泳、流式细胞仪分析诱导凋亡作用,采用western blot 检测p53、p21蛋白水平变化,采用细胞免疫组化方法检测Fas的表达变化.结果:与对照组相比,emodin能明显抑制smmc-7721细胞的生长,其IC50为49.6umol/L.荧光显微镜观察示emodin处理的肝癌细胞胞核内可见浓染致密的颗粒荧光,典型细胞可见新月型改变,固缩或片段化的核.DNA凝胶电泳可见典型的梯状条带,细胞凋亡与emodin作用的浓度和时间相关.流式细胞DNA直方图上出现典型的亚二倍体"凋亡峰 ",emodin能浓度依赖地诱导smmc-7721细胞发生G2/M期阻滞.Emodin处理smmc-7721细胞后,western blot 检测结果显示p53、p21蛋白表达明显增加,免疫组化方法检测结果显示Fas的表达明显增强.结论: emodin对人肝癌细胞smmc-7721株有强烈的增殖抑制作用,其分子机制可能是诱导smmc-7721细胞发生凋亡.Emodin 诱导smmc-7721细胞发生凋亡是p53依赖性的,即与p53、p21有关,并且Fas表达水平的上调在此过程中也起了一定作用.
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可用于移植的肝细胞研究进展
肝细胞移植作为治疗暴发性肝功能衰竭及各种终末期肝病一种潜在方法,具有创伤小、安全简单、可一肝多用、重复移植、抗原性低等优点.可以用作移植的肝细胞种类很多,目前也有很多关于这方面的报道,本文就可用于移植的肝细胞的研究进展做一简单总结.
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RetroNectin诱导的细胞因子诱导的杀伤细胞联合树突状细胞对肝癌细胞株杀伤的体外研究
细胞过继免疫治疗是肿瘤综合治疗的重要组成部分,树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前发现的功能强的抗原递呈细胞,可有效激发T细胞应答,从而引发一系列的免疫应答.细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killercells,CIK)由斯坦福大学Schmidt Wolf首次发现,具有增殖快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、且几乎无毒副作用等优点,在临床得到广泛应用[1-4].将DC与CIK细胞混合培养后制成D-CIK细胞可有效提高CIK的杀伤活力,但传统CIK细胞培养方案采用血细胞分离机分离外周血,繁琐耗时.现多采用抽取外周血60～100 ml进行培养,但对于多数患者长期接受放化疗,传统的培养方案所获得CIK细胞在数量及质量上并不能让人满意.如何提高CIK细胞在体外增殖效率和细胞毒活性是基础研究的一个热点问题.
