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肌球蛋白监管轻链基因在非小细胞肺癌研究新进展
20 KD 人类肌球蛋白监管轻链基因（MYL9），位于人类染色体20q11．23上，由其表达的肌球蛋白监管轻链是肌球蛋白的重要组成部分。肌球蛋白轻链激酶（MLCK）等多种调节因子通过调节 MYL9的磷酸化和去磷酸化使得肌球蛋白参与了几乎所有细胞生理病理过程，如细胞迁移、黏附、胞质分裂、囊泡转移、细胞吞饮和基因转录等。新研究表明MYL9基因在非小细胞肺癌癌细胞的增殖、侵袭和迁移中发挥重要作用。
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14-3-3γ过表达通过抑制LRRK2的去磷酸化防护鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞损伤
目的 探讨14-3-3γ蛋白对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制.方法 用腺病毒载体携带人14-3-3γ基因(Ad/14-3-3γ)感染PC12细胞,基因转移成功后,用鱼藤酮处理细胞.流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫荧光双标法检测14-3-3γ蛋白与LRRK2(leucine-rieh repeat protein kinase 2)的相互作用,免疫印迹技术检测14-3-3γ蛋白及LRRK2的Ser910及Ser935磷酸化水平.结果 Ad/14-3-3γ基因转入PC12细胞后14-3-3γ mRNA及蛋白均能过表达.14-3-3γ过表达能增加LRRK2的Ser910及Ser935磷酸化水平及与LRRK2的相互作用,降低PC12细胞的凋亡率(正常对照组4.26％±1.39％,鱼藤酮组36.20％±2.18％,Ad/14-3-3γ组12.78％±2.96％).结论 14-3-3γ蛋白过表达可能通过抑制LRRK2的去磷酸化,保护鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞损伤.
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连接蛋白43磷酸化状态与心脏缝隙连接通道功能的关系
缝隙连接是介导相邻细胞间直接通讯的特殊膜结构.心室肌细胞间的缝隙连接通道主要由连接蛋白43(Cx43)构成.Cx43的磷酸化状态除了快速调节通道的开放/闭合状态(单通道传导性和通道开放概率),还可通过影响Cx43的合成、转运、聚集/解聚和降解等不同环节,改变活化通道数量,终实现对缝隙连接功能的调控.迄今,已发现多种激酶和蛋白磷酸酶可直接和(或)间接调控Cx43羧基末端的丝氨酸残基和酪氨酸残基的磷酸化状态,从而影响缝隙连接通道的功能.磷酸化/去磷酸化影响Cx43和缝隙连接通道功能的确切作用和具体机制未明.本文就Cx43磷酸化状态与心脏缝隙连接通道功能的关系作一综述.
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骨胳肌蛋白磷酸酶1调节亚基基因3′非翻译区多态性与2型糖尿病相关性研究
蛋白质磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1)在胰岛素作用下可通过脱磷酸作用激活糖原合成酶[1],促进葡萄糖摄取和糖原合成[2].PP1由一个催化亚基(PP1 catalytic subunit,PP1C)和糖原目标亚基(又称调节亚基)(glycogen-associated regulatory subunit of type 1,PP1G)组成,调节亚基正性调节催化亚基的去磷酸化,其编码基因被称作PPP1R3基因[3].在胰岛素抵抗状态下,胰岛素对PP1的激活作用减弱,从而降低糖原合成酶的活性[4].
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加强胃癌的基础研究,提高防治水平
恶性肿瘤根本的特征是细胞失控性生长,后者源于细胞的去分化状态,容易进入或不易脱出细胞增殖周期、"病理"性复制、不易衰老或死亡.肿瘤细胞的基本生命活动受控于多种高度保守的基因及其产物(如癌基因、抑癌基因、细胞死亡基因、DNA修复基因、转移基因等),它们构成细胞之间、跨细胞膜、细胞内的信号传导,调控着基因转录、翻译、蛋白质修饰(如蛋白质折叠、磷酸化/去磷酸化、蛋白质裂解、泛肽化等)和细胞周期.
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蛋白磷酸酶2Ac介导Smad3中间连接区去磷酸化促肾小管上皮细胞间充质转分化的研究
目的:通过蛋白磷酸酶2Ac(PP2Ac)过表达和小干扰RNA质粒转染人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)后予以转化生长因子β1(TGF-β1)刺激,观察PP2Ac对细胞外基质合成、肾小管上皮细胞间充质转分化(EMT)和Smad3中间连接区磷酸化的影响,探讨PP2Ac促肾间质纤维化的机制. 方法:常规培养HK-2细胞,分为对照组、TGF-β1组和质粒转染+TGF-β1组.采用RT-PCR和Western Blot法检测PP2Ac、纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E选择素(E-cadherin)表达水平.采用Western blot法检测Smad3、Smad3中间连接区pSmad3-L(pSer204)和pSmad3-L(pSer208)表达情况. 结果:RT-PCR和Western Blot结果均显示:PP2Ac过表达质粒转染HK-2细胞再予TGF-β1刺激24h后,PP2Ac表达较TGF-β1组升高,同时FN、CoM和a-SMA表达明显上调,E-cadherin表达下调;而PP2Ac小干扰RNA转染HK-2细胞后再予TGF-β1刺激24h,较TGF-β1组,PP2Ac表达降低,FN、Col-Ⅰ和α-SMA表达减少,E-cadherin表达增高(P＜0.05).Western Blot结果显示:TGF-β1刺激HK-2细胞1h时PP2Ac和Smad3中间区磷酸化的蛋白表达均达到峰值;HK-2细胞转染PP2Ac过表达质粒再予TGF-β1刺激1h后,与单纯TGF-β1刺激组比较,核蛋白中pSmad3-L(pSer204)和pSmad3-L(pSer208)表达均下降;而PP2Ac小干扰RNA转染HK-2细胞再予TGF-β1刺激1h后,核蛋白中pSmad3-L(pSer204)和pSmad3-L(pSer208)蛋白表达均增加(P＜0.05). 结论:PP2Ac促进肾小管上皮细胞外基质的生成及EMT;PP2Ac介导肾小管上皮细胞Smad3中间连接区去磷酸化.
关键词： 蛋白磷酸酶2Ac 去磷酸化 细胞外基质合成 EMT Smad3中间连接区 -
酸性核糖体蛋白P2在紫外线诱导的肿瘤细胞快速凋亡中的功能
目的 研究酸性核糖体蛋白P2在紫外线(UV)诱导的细胞快速凋亡中的分子信号功能.方法 选取小鼠淋巴瘤细胞3SB、人白血病细胞Jurkat、人宫颈癌细胞HeLa S3和人乳腺癌细胞MCF-7来研究其对UV诱导细胞凋亡的差异性.UV照射后,荧光显微镜活细胞染色计数分别观察细胞的凋亡形态学变化和凋亡率;Western blot分析凋亡相关的标志性蛋白的表达.并分别提取细胞质蛋白和细胞总蛋白,利用小型二维电泳、Western blot技术分析细胞质中游离的酸性核糖体蛋白P2的变化和总的P2的表达.结果 3SB和Jurkat细胞在UV照射后,24 h的凋亡率达100%,并观察到PARP和P21的激活;而HeLa S3和MCF-7细胞出现延迟性细胞凋亡.在快速凋亡的Jurkat细胞中,发现酸性核糖体蛋白P2去磷酸化.总的P2表达降低,存在剂量效应,并伴随着凋亡蛋白PARP的激活.结论 酸性核糖体蛋白P2的去磷酸化及其在细胞内总量降低与UV诱导的细胞快速凋亡相关.
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红细胞胞质蛋白酪氨酸磷酸酶活性的测定及初步应用
近研究表明胰岛素刺激组织摄取利用葡萄糖是通过胰岛素受体、胰岛素受体底物1、磷脂酰肌醇3激酶和葡萄糖转运蛋白等一系列信号转导过程完成的,蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)通过对磷酸酪氨酸的去磷酸化,调节胰岛素受体活性,从而影响胰岛素信号转导[1,2].我们利用宝灵曼公司的检测盒,设计了红细胞胞质PTP活性的测定方法,并初步应用于临床,现将结果报道如下.
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Cofilin与分化的研究进展
Cofilin是肌动蛋白结合蛋白,在维持actin的动态化过程中起着重要的作用.近年发现Cofilin与细胞的分化有关.许多机体内外因素可通过细胞内相关信号途径对Cofilin进行调控,从而调节actin骨架诱导细胞分化.该文对Cofilin的活性调节与分化的关系做一综述.
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蛋白磷酸酶1与Ca2+ /钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ在心肌病中研究进展
蛋白质的磷酸化与去磷酸化是细胞信号转导过程中重要的调控方式,其循环过程就像调控分子的开关一样,参与众多生理活动.负责这一修饰调节的是蛋白激酶与蛋白磷酸酶.报道显示人类染色体编码多达500个蛋白激酶,这些蛋白激酶满足人类高度多样性与差异性调控蛋白磷酸化作用,而有趣的是人类编码的蛋白磷酸酶却仅仅约为150个,其中约有40个是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶.越来越多的证据表明蛋白磷酸酶/蛋白激酶调控异常在心肌病中起关键作用.蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1)是一多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,研究显示PP1在心肌肥厚和心衰的发生发展过程中起重要作用.而Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ) 是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它作为Ca2+信号转导的关键因子,调节细胞的多种生物学功能,其功能异常可引起肥厚心肌胞内钙稳态失衡进而引起心律失常等心肌病.该文就PP1与CaMKⅡ的功能和心肌病的关系作一综述.
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健脾益肾中药保护线粒体作用的研究进展
线粒体通过氧化磷酸化产生的ATP,推动了机体的各项生命运动,此外还为细胞代谢过程中经常发生的磷酸化和去磷酸化提供了高能磷酸键的转移.线粒体的三羧酸循环是糖、脂、氨基酸三大营养物质代谢的终通路和相互转化的渠道.三羧酸循环的中间产物为细胞合成生命活动所需的各种活性物质提供了前体[1].所以,线粒体是整个细胞乃至生命体进行各项生命功能活动的枢纽和核心,是"细胞的动力工厂".现代研究表明,线粒体是细胞凋亡的重要环节,有人甚至认为它是细胞凋亡的充分和必要条件[2,3].许多人研究了线粒体与中医的脾虚证的关系,而劳氏[4]甚至提出线粒体是中医之"脾"的实质.由于线粒体的重要作用,所以本文综述关于健脾益肾中药在保护线粒体方面的进展.
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弓形虫感染过程中蛋白磷酸化/去磷酸化对宿主细胞信号的影响
蛋白磷酸化/去磷酸化是指蛋白激酶(Protein kinase,PK)催化蛋白质的含羟基氨基酸(丝/苏和酪)的侧链羟基形成磷酸酯,和蛋白质磷酸酯酶(Protein phosphatase,PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯键水解而去磷酸化的过程.蛋白磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一,这一可逆过程受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制,细胞内任何一种蛋白质的磷酸化状态是由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的两种酶活性之间的平衡决定的.
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辣椒素受体的磷酸化调节
辣椒素受体(TRPV1)是一种非选择性的阳离子通道蛋白质,由6个跨膜结构域组成,其N-端和C-端皆位于细胞内,离子通道位于第5、6跨膜结构域之间.
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溶血磷脂酸对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力影响的机制探讨
目的 探讨溶血磷脂酸(LPA)对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力影响的机制.方法 ①将体外培养的MDA-MB-231细胞分为转染组、对照序列组和空白组.转染组转染(YAP)siRNA 3 h后加入浓度50 μmol/L的LPA继续培养16 h.对照序列组转染对照序列 3 h后加入浓度50 μmol/L的LPA继续培养16 h.空白组不转染、不加LPA,常规培养16 h.用Transwell小室行细胞迁移实验和细胞侵袭实验观察各组细胞迁移、侵袭能力.②用50 μmol/L的LPA培养MDA-MB-231细胞0、10、30、60、120、240、480 min,收集细胞,用Western blotting法检测磷酸化YAP(p-YAP)相对表达量.用0、1、10、20、50 μmol/L的LPA培养MDA-MB-231细胞120 min,收集细胞,用Western blotting法检测磷酸化YAP相对表达量.③将体外培养的MDA-MB-231细胞分为1、2、3、4、5、6、7组,分别加入培养基、MAPK通路阻断剂SB203580、PI3K通路阻断剂LY294002、Akt通路阻断剂MK2206、 MEK通路阻断剂PD98059、Rho抑制剂(C3转移酶)和ROCK抑制剂(Y27632),然后加入50 μmol/L的LPA继续培养120 min.采Western blotting法检测pYAP表达.结果 ①转染组、对照序列组、空白组细胞迁移实验穿膜细胞数分别为(10.01±2.05)、(12.13±2.44)、(7.06±2.54)个,细胞侵袭实验穿膜细胞数分别为(9.24±2.18)、(11.54±2.09)、(6.75±1.48)个.对照序列组细胞迁移实验、细胞侵袭实验穿膜细胞数均高于空白组(P均<0.05).转染组细胞迁移实验、细胞侵袭实验穿膜细胞数均低于对照序列组细(P均<0.05).②用10 μmol/L的LPA培养MDA-MB-231细胞0、10、30、60、120、240、480 min,MDA-MB-231细胞YAP相对表达量分别为0.11±0.023、0.08±0.002、0.05±0.027、0.04±0.012、0.01±0.002、0.03±0.004及0.05±0.007.培养时间为120 min时MDA-MB-231细胞pYAP相对表达量低(P均<0.05).用0、1、10、20、50 μmol/L的LPA培养MDA-MB-231细胞120 min后pYAP相对表达量分别为0.23±0.024、0.18±0.020、0.09±0.022、0.06±0.017、0.02±0.012.随着LPA浓度的升高,MDA-MB-231细胞pYAP相对表达量逐渐降低(P均<0.05).③1、2、3、4、5、6、7组MDA-MB-231细胞pYAP相对表达量分别为0.34±0.027、0.32±0.022、0.35±0.019、0.33±0.021、0.34±0.025、0.74±0.029及0.65±0.022.1、2、3、4、5组MDA-MB-231细胞pYAP相对表达量相比,P均>0.05.6组MDA-MB-231细胞pYAP相对表达量高于1~5组(P均<0.05).7组MDA-MB-231细胞YAP相对表达量高于1~5组(P均<0.05),但低于6组(P<0.05).结论 LPA通过Rho和ROCK通路导致乳腺癌MDA-MB-231细胞YAP去磷酸化,进而促进乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和侵袭.
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肌球蛋白轻链去磷酸化调节的钙依赖及非依赖途径对高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉压及右心室重构的影响
目的：观察抑制肌球蛋白轻链（MLC）去磷酸化的钙依赖及非依赖2条途径对大鼠高肺血流性肺动脉高压及右心室重构的影响，了解同时干预2条途径是否有叠加效应。方法经腹主动脉-下腔静脉穿刺建立高肺血流动物模型，将雄性 SD 大鼠50只按数字表法随机分为5组：假手术组、模型组、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）抑制剂干预组[ M 组，ML-73 mg/（ kg· d）]、Rho/ Rho 激酶抑制组[ F 组，法舒地尔（ Fasudil）20 mg/（kg·d）]、双重抑制组[M ＋ F 组，ML-73 mg/（kg·d）＋ Fasudil 20 mg/（kg·d）]，给药8周；8周后测定大鼠平均右心室压（MRVP）、平均肺动脉压（MPAP）及右心室肥大指数和下腔静脉宽度的改变。结果与假手术组比较，模型组大鼠术后8周 MRVP、MPAP 明显增加[（4.19±0.67）kPa 比（2.65±0.57）kPa；（4.04±0.61） kPa 比（2.42±0.48）kPa；F ＝295.368、263.912，P 均﹤0.01]，右心室肥大指数，即右心室（RV）与左心室加室间隔（LV ＋ S）的比值增加[（0.41±0.03）g/ g 比（0.21±0.01）g/ g；F ＝247.024，P ﹤0.05]；予 MLCK 及 Rho 激酶抑制剂干预后，MRVP 及 MPAP 明显降低[MRVP：M 组（3.51±0.47）kPa 比模型组（4.19±0.67）kPa；MPAP：F 组（3.68±0.55）kPa 比模型组（4.19±0.67）kPa；P 均﹤0.01]，RV/（LV ＋ S）降低[M 组：（0.29±0.02）g/ g，模型组：（0.41±0.03）g/ g，F 组：（0.30±0.03）g/ g；F ＝247.024，P 均﹤0.05]；两药合用后，逆转肺动脉压力及右心室肥大的作用更强（P ﹤0.05）。结论 MLC 去磷酸化的钙依赖及非依赖2条途径都能在一定程度上减轻高肺血流型大鼠肺动脉高压及右心室肥大的发展，同时干预2条途径能产生叠加效应。
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胆汁淤积的分子机制及相关疾病
各种淤胆性肝损害时,肝细胞膜窦面或胆管面转运体蛋白分子的表达或功能将会受到不同的影响.其潜在的机制可能在于基因对转录速率的调控或转录后的改变(包括mR-NA加工,稳定性、转录效率)以及翻译后的机制(如胞内蛋白质分类/靶向受损、蛋白质磷酸化/去磷酸化受损).应用分子探针技术检测实验动物或临床淤胆性疾病患者,以及大鼠相关基因敲除(knockout)或自然发生突变导致转运蛋白缺失,继而可引起胆汁淤积性疾病,均提示了转运功能的受损会引起胆汁流减少,淤胆性疾病的发生.一些遗传性肝细胞转运体的突变也证实了是胆汁淤积性疾病的潜在病因.
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双重特异性磷酸酶5介导地塞米松对血管内皮细胞炎症反应的抑制作用
目的：探讨双重特异性磷酸酶5（dual specificity phosphatase 5，DUSP5）在糖皮质激素抑制血管内皮细胞炎症反应中的作用。方法：体外培养人血管内皮细胞，观察糖皮质激素受体激动剂地塞米松对内皮细胞DUSP5表达的影响；运用siRNA技术降低内皮细胞中DUSP5的表达，观察肿瘤坏死因子α（ tumor necrosis factor alpha，TNF－α）刺激引起的炎性因子和黏附分子表达的变化以及地塞米松抗炎作用的改变。结果：（1）地塞米松明显上调内皮细胞中DUSP5的表达，呈时间和剂量依赖趋势。（2）降低DUAP5的表达使TNF－α引起的炎症因子和黏附分子（ IL－1α、IL－1β、LTβ、IL－6、IL－15、ICAM1、VCAM1和SELE）的表达减少。（3）地塞米松抑制TNF－α引起内皮细胞中包括IL－6在内的炎性因子合成，此抑制作用在DUSP5表达沉默后明显减弱。结论：糖皮质激素通过上调DUSP5表达，使炎性刺激活化的MAPK去磷酸化而失活，从而介导糖皮质激素对血管内皮细胞炎症反应的抑制作用。 DUSP5可能是治疗动脉粥样硬化等血管相关疾病的潜在靶点。
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内皮功能障碍相关疾病与内质网整合应激反应
高血压、冠心病等严重疾病的血管损伤均始于内皮功能障碍。内皮细胞丰富的内质网是调控蛋白合成、折叠和钙稳态的重要亚细胞器。多种理化因素可致内质网应激（ ERS ）。在经典的ERS3大途径中，主要调控蛋白合成、折叠和细胞凋亡的PERK途径启动与整合细胞核、线粒体和高尔基体等亚细胞器的反应，故被称为整合应激反应（ ISR）。正常状态下，与GRP78结合的PERK以无活性复合物的形式存在。未折叠蛋白与GRP78结合后，游离PERK发生磷酸化，通过磷酸化eIF2α影响募集起始子蛋氨酰tRNA／40 S小亚基核蛋白体复合体的组装与启动，造成蛋白合成暂停，以减轻内质网负荷，恢复细胞稳态。过度ERS时蛋白合成持续抑制则影响应激细胞修复。 eIF2α下游GADD34的负反馈调节机制通过去磷酸化 eIF2α，重启被eIF2α磷酸化抑制的蛋白质合成。 ISR另一个重要分支由磷酸化的eIF2α上调活化ATF4的翻译所启动。 ATF4合成后转位至细胞核，上调促凋亡分子CHOP，启动ERS相关细胞凋亡。 ISR是细胞应激的初反应，决定应激细胞的转归：恢复自稳态和修复损伤，或损伤加重乃至死亡，是内皮功能障碍相关疾病防治的新靶点。
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Tau蛋白通过募集蛋白磷酸酯酶2 A加速细胞外信号调节激酶的去磷酸化
目的：探讨tau蛋白对蛋白磷酸酯酶2A（PP2A）的调节作用以及对细胞外信号调节激酶1／2（ERK1／2）的影响。方法：用Western blotting分别检测野生型和tau基因敲除型小鼠海马组织ERK1／2的蛋白表达及磷酸化水平；用纯化的磷酸化ERK分别与野生型和tau基因敲除型小鼠海马组织匀浆液共孵育，通过免疫共沉淀实验以及丝／苏氨酸磷酸酯酶活性实验检测与ERK结合的PP2A活性。结果：与野生型小鼠相比，tau基因敲除型小鼠海马组织内ERK1／2磷酸化水平明显增高。体外实验显示：纯化的磷酸化ERK与tau基因敲除型小鼠海马组织匀浆液共孵育后，其去磷酸化过程受到明显抑制，这一过程在加入重组的tau蛋白后得到逆转。免疫共沉淀实验以及丝／苏氨酸磷酸酯酶活性实验显示：与野生型小鼠相比，tau基因敲除型小鼠海马组织内与ERK结合的PP2A明显减少，活性显著下降。结论：Tau蛋白通过募集PP2A加速ERK1／2的去磷酸化。
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PTP抑制剂对VacA空泡活性的影响
近期在VacA的研究中发现,该毒素对多种生长因子(尤其是EGF)作用于胃粘膜上皮细胞的信号转导通路有显著影响,VacA对EGF诱导的受体蛋白酪氨酸激酶(receptor protin-tyrosine kinase,RPTK)自身磷酸化及随后一系列的信号转导过程有明显的抑制作用.国外学者已初步分离并克隆出胃癌细胞株膜表面的VacA受体,分子量大小约250kDa,氨基酸序列同源性分析显示该受体属于受体蛋白酪酸磷酸酶家族(receptor protin-tyrosine phosphatase,RPTP),RPTPT是细胞信号转导过程中与RPTK相拮抗的一类具有酶活性的受体,可导致多种信号肽的去磷酸化,从而减弱EGF等生长因子对胃粘膜上皮细胞增殖、修复的促进作用.
