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微阵列技术诊断神经系统细菌感染
微阵列技术以高通量、大规模、微型化和平行化的显著特点,已越来越多地应用于人类疾病诊断.我们在细菌的16S rRNA基因内设计了一套保守的通用引物,并对脑脊液常见病原菌各设计了2条特异性探针,建立了膜微阵列技术平行检测脑脊液病原菌DNA的方法,在对标准菌株进行检测鉴定的基础上,又对34株脑脊液临床分离株进行了鉴定,其结果可靠,而且仅用5?h即可鉴定出菌种,具有一定的现实意义.
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应用基因芯片技术检测20种病原菌的探讨
本研究根据细菌16S rRNA基因的特点[1],设计了一套保守的通用引物,并针对每种细菌各设计了两条特异性探针,建立了膜芯片技术平行检测病原菌DNA的方法.
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抑制NF-κB信号通路抗心脏异种移植延迟性排斥反应作用研究
目的：观察抑制NF-κB信号通路对心脏移植异种移植延迟性排斥反应（DXR）的影响，探讨在DXR过程中心肌细胞凋亡的作用机制。
方法：选取ICR小鼠为供体动物，SD大鼠为受体动物。ICR小鼠及SD大鼠随机分为三组，每组12只：对照组， siRNA阴性对照组（siRNA-NC组）及siRNA组。每组6只移植后48 h处死，做各项指标检测，剩余6只用于观察供心生存曲线。HE染色观察心肌组织病理学改变；透射电镜观察各组心肌组织的超微结构变化；TUNEL法检测心肌组织凋亡指数；特异性探针染色法检测线粒体膜电位；ELISA法检测caspase-3活性；比色法检测NO含量、iNOS活性；Western Blot检测NF-κB p65及凋亡相关蛋白Fas及Fas-L的表达。 -
高分辨率熔解曲线分析:一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术
目前,DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorplaism,SNP)的检测方法有2种:一是针对特定的位点合成序列特异性探针,如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等,用于检测已知突变;二是以核酸的物理性质为基础的检测方法,如变性一高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等,此类方法可用作突变筛查,但无法明确突变性质.
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高分辨率熔解曲线分析技术在快速产前诊断β地中海贫血中的应用
β地中海贫血(β地贫)是世界范围内常见的单基因疾病之一[1],是由β珠蛋白(hemoglobin beta,HBB)基因突变导致HBB合成障碍而引起的一种溶血性贫血,呈常染色体隐性遗传.我国长江以南地区为β地贫高发区,其中广西、广东和海南的发病率高,至今已发现有200多种β地贫基因突变[2],其中CDs41-42 -TCTT、IVS2-654C＞T、-28A＞G、CD17A＞T及CDs71-72+A位点突变占所有突变类型的90％以上[3-4].重型β地贫患儿出生后需要定期输血治疗,除非实施造血干细胞移植成功,大部分患儿将于青少年期夭折.由于目前对该病尚无理想的根治方法,因此,通过产前诊断阻止重型β地贫患儿出生是首选的预防措施.目前,国内外检测β地贫基因突变的方法主要有等位基因特异性PCR( ARMS)、反向点杂交(RDB)、变性高效液相色谱( DHPLC)等[5-8].高分辨率熔解(high resolution melting,HRM)曲线分析技术是一种高效稳定的PCR技术,不受突变碱基位点与类型的局限,无需序列特异性探针,存PCR反应结束后直接进行HRM即可完成对样品的突变筛查和基因型分析.本研究探讨HRM分析技术在快速产前诊断β地贫中的应用价值.
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产志贺样毒素且具侵袭力的大肠杆菌性小儿腹泻
大肠杆菌是引起儿童腹泻的重要病原体之一,致泻性大肠杆菌包括肠致病性大肠杆菌(EPEC)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)和肠集聚性黏附大肠杆菌(EAEC).我国学者徐建国等于1994年在国际上首次发现并命名的一类新的致泻性大肠杆菌,因其能产生志贺样毒素,并且对肠上皮有侵袭力,被命名为肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠杆菌(entero-SLTS-producing and invasive escherichia coli,ESIEC)[1-3],ESIEC在临床上与EHEC和EIEC类似,但对侵袭性大肠杆菌和志贺菌特异性探针(InV)和志贺样毒素探针(SLT1、SLT2)同时发生阳性反应.
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分子特异性探针的构建策略
分子影像学(molecular imaging)研究是一门崭新且具有巨大临床应用前景的课题,是21世纪持续发展新影像学的特征,被美国国立卫生研究院(national institutes of health, NIH)确认为是应用非侵袭方法在分子或(和)基因水平定量研究活体内疾病过程的极其重要领域[1-5].
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应用微板核酸杂交一ELISA技术对苏南地区病毒性肝炎患者及献血员TTV感染情况及基因分型的研究
应用微板核酸杂交一ELISA技术，按照Okamoto等发表的基因序列，选取TTV ORF1的保守序列作为内引物；包被探针选择一段I型、Ⅲ型同源的序列nt2350－nt2495，而显色探针I和显色探针Ⅱ则选择异源性大于50％的序列，并在显色探针的5＇端标上生物素。首先对患者及献血员标本进行套式PCR法扩增，然后将扩增产物与两条特异性探针夹心杂交，后加底物酶联显色，用该法对苏南地区328例病毒性肝炎患者和229名献血员进行TTV检测及分型分析。 结果发现328例病毒性肝炎患者，TTV感染率为10.4％(34/328)，其中急性甲型肝炎阳性率为5.7％(2/35)，急性乙型肝炎阳性率为8.7％(8/92)，慢性乙型肝炎阳性率为11.1％(15/135)，慢性丙型肝炎阳性率为3.2％(1/31，慢性非甲－戊型肝炎阳性率为22.9％(8/35)。研究发现，TTV阳性的上述患者输过血或血液制品者占67.6％(23/34)，表明TTV感染与输血和使用血液制品有一定关系。229名献血员TTV感染率为5.7％(13／229)。 对47例TTV阳性标本进行基因分型研究，把TTV分为两个型：I型和Ⅱ型，还有部分混合感染型，其比例为34:3:10；慢性肝炎与急性肝炎TTV感染者比例为32:15。表明苏南地区TTV感染者中，慢性肝炎感染TTV的机会多于急性肝炎，I型明显多于Ⅱ型。在献血员中，ALT升高与ALT正常人群TTV感染率分别为9.3％及4.8％，提示TTV存在无症状携带状态，有必要将TTV的检测列为献血员的筛查项目。
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红色毛癣菌的研究进展
红色毛癣菌是常见的也是世界范围内传播广的一种皮肤癣菌，属毛癣菌属。本文简述了近几年在该菌的基因鉴定、基因分类、基因结构的分子生物学研究和免疫学研究方面的主要进展。在基因鉴定中发展了红色毛癣菌特异性探针TR20S和毛癣菌属特异性引物TR1、TR2和NS5、NS6；利用测序方法对毛癣菌属进行了重新分类，并且用探针、限制性片段多态性分析等方法对红色毛癣菌进行了种内分型研究。
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昆明地区丙型肝炎基因型分析
HCV是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一.现研究已知HCV基因组高度的变异性是HCV持续感染及严重预后的重要因素,且HCV基因型与感染途径、临床病情及抗病毒治疗、疫苗制备等有明显的相互关系.根据HCV基因的遗传差异性可将HCV分为不同的基因型和亚型.根据HCV基因型可以明确病毒的种系发育和传播来源,了解不同基因型和亚型的地理分布,可能与HCV治疗的疗程及效果相关[1].因此,针对当地流行的HCV基因型进行检测鉴定,具有重要的临床意义.本研究即以型特异性探针杂交法对176例HCV感染者进行HCV基因型研究,以探讨昆明地区HCV感染基因型流行特征.
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人巨细胞病毒先天性感染胎鼠大脑皮质钙调素基因mRNA表达的研究
目的研究先天性人巨细胞病毒(HCMV)感染致脑损害后钙调素(calmodulin,CaM)基因mRNA表达的改变,以探讨先天性HCMV感染所致脑损害的机制.方法选用10周龄Balb/c小鼠,雌雄小鼠腹腔内分别注射1.0ml、0.5ml、0.25ml HCMV后合笼交配以建立先天性HCMV中枢神经系统(CNS)感染小鼠模型,对照鼠腹腔注射1.0ml RPMI 1640液.剖腹取21天胎龄小鼠大脑皮质,以自行设计的CaM cDNA编码区的一对引物与一条CaM特异性探针,分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测CaM mRNA相对含量、用原位杂交检测大脑皮质细胞内相应mRNA的表达及定位.结果母鼠腹腔内接种HCMV量为1.0ml与0.5ml的临产胎鼠大脑皮质分离出相应病毒,病理学检查等确认发现了侵袭性脑膜脑炎性病理改变,证实HCMV可经小鼠宫内传播至胎鼠CNS.1.0ml组与0.5ml组胎鼠RT-PCR产物浓度明显高于0.25ml组及对照组,而1.0ml组与0.5ml组间亦有明显差异.电泳结果显示对照组与0.25ml组胎鼠未见阳性条带,而1.0ml组胎鼠特异性条带信号强于0.5ml胎鼠,仅略低于同组母鼠.原位杂交显示CaM mRNA不但出现在1.0ml组胎鼠大脑皮质大神经元胞核及胞浆内,在中小神经元及胶质细胞的胞核及胞浆亦有高密度表达,阳性细胞的突起中亦有弱信号存在.结论提示先天性感染HCMV胎鼠大脑皮质内CaM mRNA表达量明显增加,且神经元及胶质细胞均有表达,并与感染剂量有依赖关系.提示CaM mRNA表达增高可能直接参与了HCMV先天性感染脑损害的过程.
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荧光原位杂交技术产前诊断一例45,X
孕妇女,29岁,干部,身体状况一般.无急、慢性传染病史,非近亲婚配.因产前检查发现胎儿发育与孕月不符,羊水少,即行B超检查,提示:胎儿皮下组织增厚,四肢水肿.追问病史,既往曾在载波室工作,孕前已离开原工作单位约1年.夫妇均无放射及病毒接触史,其丈夫为机关干部,身体健康.对孕妇进行血生化检查,排除了Rh阴性及ABO血型不符.细胞遗传学检查:对孕妇及其丈夫外周血作常规培养,G显带计数中期细胞分裂相各30个,结果夫妇双方核型正常;羊水及脐血常规培养,G显带核型分析50个分裂相,核型为45,X.用X着丝粒探针对(地高辛间接标记DNA特异性探针)染色体非整倍体进行荧光原位杂交检测(fluorescence in situ hybridization, FISH),发现染色体X着丝粒上和间期细胞核中均显示1个黄绿色杂交信号(图1).
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荧光素和地高辛标记探针在聚合酶链反应-微孔板杂交检测TTV DNA中应用比较
目前聚合酶链反应(PCR)扩增产物常规检测采用琼脂糖凝胶电泳法,其敏感度、特异性均不能满足临床要求.对PCR产物进行限制性内切酶酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)分析、变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE或PCR-SS-CP)及PCR产物直接测序,虽可特异性检测PCR产物,但因操作繁杂,且需特殊试剂和仪器,无法在临床普遍开展.刊用特异性探针与扩增产物杂交,引用微孔板杂交酶呈色技术,由于其特异性和敏感度高而被应用于临床.我们采用荧光素和地高辛分别标记探针,建立荧光素-抗荧光素、地高辛-抗地高辛酶偶联系统微孔板杂交酶呈色技术检测TTV DNA的方法,并对其检测效果进行了比较.
