带PTD的小鼠Foxp3 PRD缺失突变体对小鼠脾混合淋巴细胞反应的影响

目的:构建和表达带蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)的Foxp3(forkhead box P3)PRD缺失突变体(PTD-ΔPRD)融合蛋白,并探讨其对脾混合淋巴细胞反应的影响.方法:应用PCR技术扩增获得小鼠ΔPRD片段核酸序列,将其分列插入到带PTD的pET28a-PTD和pET28a-PTD-eGFP原核表达载体中,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,利用镍柱获得并复性融合蛋白;Western印迹鉴定目的蛋白表达的正确性、流式细胞术和Western印迹检测融合蛋白穿膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力、双向混合淋巴细胞反应分析融合蛋白对T淋巴细胞增殖的影响.结果:融合蛋白可在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达,并获得了大量纯化的融合蛋白.流式细胞术和Western印迹显示融合蛋白穿越细胞膜进入EL-4细胞核中,混合淋巴反应初步证明融合蛋白具有抑制T淋巴细胞增殖的功能.结论:成功表达小鼠PTD-ΔPRD Foxp3融合蛋白,该融合蛋白能有效进入细胞核内,抑制T淋巴细胞增殖.

激光捕获显微切割技术纯化的肺鳞癌原发灶与淋巴结转移灶肿瘤细胞的比较蛋白质组学

目的:筛选肺鳞癌淋巴结转移相关的蛋白质. 方法:采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection,LCM)分别从肺鳞癌原发灶组织和匹配的淋巴结转移灶癌组织中切割纯化鳞癌细胞;应用二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)分离LCM纯化细胞的蛋白质;图像分析识别差异表达的蛋白质点;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异蛋白质点,Western印迹验证差异蛋白Rho-GDIα在LCM纯化的肺鳞癌原发灶肿瘤细胞(lung primary tumor cells, LPTC)和匹配的淋巴结转移灶肿瘤细胞(lymph node metastatic tumor cells, LNMTC)中的表达.结果:建立了LCM纯化的LPTC和匹配的LNMTC的2-DE图谱,质谱鉴定了22个差异蛋白质,与LPTC相比,8个蛋白质在LNMTC中表达明显增高.结论:22个差异蛋白可能与肺鳞癌淋巴结转移有关,为筛选肺鳞癌转移标志物奠定了基础.

调宁蛋白基因siRNA重组腺病毒载体构建及其对体外子宫平滑肌细胞的作用

目的:构建siRNA重组腺病毒载体,为研究Calponin-1基因在分娩发动中的作用机制提供实验基础.方法:采用消化酶法对足月妊娠人子宫平滑肌细胞原代培养,并用免疫细胞化学方法进行鉴定.构建腺病毒siRNA-Calponin-1质粒转染原代培养的子宫平滑肌细胞,采用RT-PCR和Western印迹检测Calponin-1的表达.结果:构建的Calponin-1 siRNA腺病毒载体可以显著抑制子宫平滑肌细胞中Calponin-1mRNA和蛋白的表达.实验组、空白对照组、空载体组的Calponin-1 mRNA表达的灰度值分别为316.3±39.2,1048.5±126.4,1027.2±127.5,Calponin-1蛋白表达的灰度值分别为323.3±43.2,1021.5±143.4,1019.2±144.5,实验组与空白对照组、空载体组比较,差异有统计学意义(P<0.05),空白对照组与空载体组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论:构建的pAdEasy-pShuttle-U6-Calponin-1 siRNA质粒能抑制体外子宫平滑肌细胞Calponin-1的表达,为研究Calponin-1在分娩发动中的作用提供了实验基础.

KGDS血栓靶向超声造影剂的制备及其初步评价

目的:探讨制备靶向结合活化血小板的脂质超声造影剂的新方法,评价制备的靶向超声造影剂体外与血栓靶向结合的能力.方法:首先合成荧光标记的,能与血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体特异性结合的赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸多肽-棕榈酸化合物(KGDS-Palm).采用"超声-高速剪切"法,以带荧光FITC的KGDS-Palm为主要原料之一,制备靶向脂质超声造影剂.马尔文公司粒径测定仪检测微泡大小及分布;Coulter计数仪分析浓度;荧光显微镜下观察KGDS多肽与微泡的结合情况;流式细胞仪评价多肽与微泡的结合效率;观察靶向微泡在体外的稳定性;采用体外血栓模型,检测靶向微泡与血栓靶向结合的特异性.结果:KGDS靶向超声造影剂呈淡黄色混悬液,微泡浓度约为1.5×10~9/mL,平均粒径为1.5 μm,98%的微泡小于5 μm.荧光显微镜显示靶向超声造影剂表面呈明亮的绿色荧光;流式细胞仪检测KGDS结合效率为90.04%;体外4 ℃保存48 h后微泡浓度及粒径无显著改变;体外靶向及其拮抗实验证实,靶向超声造影剂与血栓特异性结合.结论:采用"超声-高速剪切法"制备靶向超声造影剂,方法简单易行,有利于靶向造影剂的制备及纯化;KGDS靶向超声造影剂稳定性好、靶向结合特异性强.

缺氧/复氧损伤对大鼠海马神经元过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达的影响

目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在神经元缺氧/复氧损伤不同时间的表达,以探讨PPARγ在神经元缺血再灌注损伤过程中的作用.方法:以新生1 d的SD大鼠为研究对象,采用海马神经元原代培养技术,给原代培养的神经元缺氧、缺糖15 min后再恢复氧和葡萄糖供应,建立体外神经元类缺血再灌注模型,JEM-200EX透射电子显微镜观察缺氧/复氧后不同时间神经元结构变化,采用RT-PCR检测PPARγ mRNA表达,Western 印迹方法检测PPARγ蛋白表达.结果:神经元缺氧/复氧处理后不同时间,神经元正常结构出现损害.复氧 0 h,PPARγ表达与对照组相比无明显变化(P>0.05);复氧 6 h,PPARγ表达在mRNA和蛋白水平出现降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),而且随着时间的延长表达逐渐降低,到48 h达到低,不同时间点之间及与对照组之间差异有统计学意义(P<0.01).结论:PPARγ参与神经元缺血再灌注损伤的病理过程,有望成为缺血性脑血管病治疗的干预靶点.

ITP患者抗幽门螺杆菌治疗的疗效观察

目的:观察抗幽门螺杆菌(H.pylori)治疗对特发性血小板减少性紫瘢(ITP)患者的疗效以及其对血小板的影响.方法:收集2006年4月至2008年4月,H.pylori阳性的ITP患者31例进行抗H.pylori治疗(奥美拉唑20 mg/次+克拉霉素0.5 g/次+阿莫西林1.0 g/次,均2次/d共1周),分别于治疗前、治疗后7,14,28 d检测血小板计数.结果:31例ITP患者抗H.pylori治疗后,有21例治愈,10例无效,根治率为67.74%.H.pylori治愈患者血小板计数较治疗前显著升高(P＜0.05),治疗无效患者的血小板数量改变无统计学差异(P>0.05).结论:抗H.pylori治疗可使H.pylori阳性ITP患者的血小板升高,H.pylori感染可能与部分ITP患者的血小板减少有关.

呼吸道合胞病毒感染大鼠脊髓背根节信号转录因子的研究

目的:研究反复呼吸道合胞病毒(RSV)感染大鼠脊髓背根节感觉神经细胞转录因子的活化状态变化. 方法:1～2周龄 SD大鼠幼鼠共80只,区组随机分为对照组和RSV感染组,每组40只. RSV感染组采用每周1次RSV(浓度5 ×10~5 U/mL)滴鼻法制作RSV慢性感染模型,对照组采用无病毒培养上清液滴鼻.8周后每组取5只大鼠进行气道反应性测定.原位杂交检测肺组织RSV RNA以证明呼吸道合胞病毒感染模型的可靠性.用TranSignal蛋白质/DNA活性芯片筛选C_7～T_5脊髓背根节组织中活性改变的转录因子.Western印迹对筛选结果中改变明显的因子进行验证.结果:RSV感染组气道阻力增幅显著大于对照组(P＜0.05).原位杂交显示RSV感染组肺组织有大量呼吸道合胞病毒存在,HE染色示肺部存在明显炎症细胞浸润,说明呼吸道合胞病毒感染模型建立成功.TranSignal蛋白/DNA组合芯片检测筛选:RSV反复感染大鼠背根节55个转录因子活性上调(RSV感染组/对照组>2),43个活性下调(RSV感染组/对照组<0.5).Western印迹验证结果与芯片结果一致,并进一步明确蛋白/DNA组合芯片筛选的IRF转录因子是IRF-1,而不是IRF-2.结论:反复RSV感染可引起气道反应性增高和脊髓背根节感觉神经细胞内多种转录因子活性发生改变,可能与气道反应性增高的神经调控异常有关.

维医沙疗中的传热分析及数值模拟

目的:研究维医沙疗治病中的热量传递规律.方法:建立维医沙疗过程中人体及沙体中热量传递过程的局部和整体热物理模型,数值模拟沙疗中人体及沙体的温度变化.结果:得到了沙疗过程中人体组织和沙层局部温度随时间的变化规律;在沙疗初始阶段,沙体表面和人体表面处沙子的温度变化较大,而深度5 cm以下的沙子温度变化很小;皮肤层温度在沙疗初始阶段明显升高,之后略有下降;当埋沙厚度大于10 cm后,增加埋沙厚度对沙疗过程中人体内温度变化的影响不大;沙疗温度过高会对人体产生热损伤,当沙体温度高于64.6 ℃,沙疗进行30 min时,人体皮肤将会产生I度烧伤.结论:在沙疗时应合理地选择沙体温度、埋沙厚度和治疗时间.

FⅦ活化蛋白酶基因的Marburg I 型多态性与脑梗死发病的相关性

目的:探讨FⅦ活化蛋白酶(Factor Ⅶ-activating protease,FSAP) 基因的Marburg I 型多态性与脑梗死发病之间的相关性,并分析FSAP的Marburg I 型多态性是否为脑梗死的危险因子之一.方法:应用单链构象多态性PCR技术(SSCP-PCR),对159例临床确诊的脑梗死患者及179例年龄、性别相匹配的无血栓性疾病病史志愿者的FSAP基因进行多态性分析.结果:FSAP基因表型在病例组及对照组中均为野生型纯合子,未检测到Marburg I 型突变型.发现1例FSAP基因点突变(C1815T).结论:FSAP基因的Marburg I 型多态性与脑梗死发病可能无相关性.

中国汉族TGF-β1基因-800G＞A多态性与脑梗死的相关性

目的:探讨转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)基因多态性与脑梗死的关系.方法:利用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析法检测247例脑梗死(cerebral infarction, CI)患者及167例性别、年龄匹配的健康体检者-800G>A多态位点的基因型,并计算出各等位基因频率在组中的频率分布.结果:中国湖南汉族人群中存在-800G>A位点多态性.-800G>A基因型在两个人群中的分布符合Hardy-Weinberg平衡,脑梗死组与对照组相比,基因型及等位基因频率分布无统计学差异(P>0.05),Logistic回归分析未发现某种基因型增加或者降低脑梗死发生的风险.结论:TGF-β1-800G>A基因多态性与中国湖南地区汉族人群脑梗死无明显相关性.

4种全能性基因转入人胚胎成纤维细胞诱导多能性干细胞系的建立及其鉴定

目的:利用人类胚胎成纤维细胞(human embryonic fibroblast cells, hEFs)获得诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)系并对其全能性进行鉴定.方法:本研究采用慢病毒感染的方法将含有Oct4,Sox2,Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导hEFs,获得iPSCs,并对其进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色,以及检测表面标记,端粒酶活性,EB分化和畸胎瘤形成等,同时进行核型分析以及短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析.结果:所获得的iPSCs表达多能性细胞的表面标记,具有高的端粒酶活性,可在体内体外向内中外三胚层分化,与hESCs相似.经STR分析证实,iPSCs确实来源于hEFs而非胚胎干细胞的污染.结论:4种全能性基因转入hEFs可诱导获得与胚胎干细胞相似的iPSCs,有助于进一步的表观遗传学重编程以及干细胞多能性维持的研究.

不同病理类型HSPN患儿血和尿中VEGF浓度改变

目的:探讨过敏性紫癜性肾炎(Henoch Schonlein purpura nephritis,HSPN)患儿尿中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)浓度与肾脏血管损害的关系.方法:对肾穿刺活检确诊的78例HSPN患儿按肾血管损害、肾小球病理损害、肾小管间质病理损害进行半定量积分,肾小球、肾小管间质、血管病理积分及肾小球与肾小管间质总病理积分各分为轻、中、重3组;酶联免疫吸附法检测其血、尿中VEGF浓度;免疫组织化学法检测肾局部VEGF表达及肾脏微血管密度.结果:肾小球、肾小管间质、血管病理积分及肾小球与肾小管间质总病理积分轻、中、重组之间差异有统计学意义(均P＜0.01);肾脏血管损害愈轻,微血管密度、血与肾局部中VEGF浓度则愈高,而尿中VEGF排泄也愈低,轻、中、重组3组之间差异有统计学意义(均P＜0.01).肾小球积分与肾小管间质积分、血管积分、肾脏总积分相互呈高度正相关(r=0.596,0.612,0.728,分别P<0.05,0.05,0.01),微血管密度与血VEGF和肾VEGF相互呈高度正相关,与尿中VEGF呈高度负相关(r=0.601,0.696,-0.639,均P＜0.01).结论:尿中VEGF排泄增加使肾局部VEGF浓度下降进而导致的肾血管损伤,可能是HSPN患儿肾血管损害与病理慢性进展的重要原因.

胆囊收缩素刺激小鼠胰腺腺泡肽链的延伸及其分子机制

目的:研究胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)、碳酸胆碱(carbachol,CCh)及血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)体外刺激小鼠胰腺腺泡细胞肽链的延伸及其作用的分子机制.方法:采用3H-亮氨酸掺入法分别测定基础状态及CCK, CCh及VIP处理后胰腺腺泡细胞肽链延伸率;Western 印迹分析基础状态和上述促分泌素处理后真核细胞延伸因子(eEF2)及其激酶磷酸化水平,进一步用MEK抑制剂 (PD98059)、SAPK/P38抑制剂(SB202190)、mTOR抑制剂(rapamycin)处理细胞,分别阻断MEK,SAPK/P38和mTOR 3种信号通路和磷酸酶抑制剂花萼海绵诱癌素A预处理再用CCK处理胰腺腺泡,分析eEF2及其激酶eEF2K磷酸化水平. 结果:体外除VIP外,其他2种促分泌素均能诱导胰腺腺泡细胞肽链的延伸.CCK和CCh处理后真核细胞延伸因子eEF2 Thr~(56)去磷酸化及其激酶Ser~(366)磷酸化水平增加,PD98059,SB202190和rapamycin特异性抑制MEK,SAPK/P38和mTOR信号通路以及磷酸酶抑制剂花萼海绵诱癌素A均能部分性逆转CCK诱导的eEF2去磷酸化. 结论:CCK可通过MEK,SAPK/P38和mTOR信号通路诱导真核细胞延伸因子eEF2 Thr~(56)去磷酸化,参与小鼠胰腺腺泡细胞肽链的延伸调节.

糖尿病大鼠视网膜病变中促血管生成因子的表达及意义

目的:检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)及其受体CXCR-4在糖尿病大鼠视网膜病变(DR)组织中的表达,探讨其在DR发病机制中的作用. 方法:以链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型.随机分为1月病程组(M1)、3月病程组(M3)和5月病程组(M5).分别进行透射电镜观察视网膜微血管.视网膜消化铺片后行VEGF和SDF-1α/CXCR-4免疫组织化学检测.半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹分别检测VEGF,SDF-1α和CXCR-4 mRNA和蛋白在大鼠视网膜中的表达.结果:血管透射电镜观察:正常对照未见异常改变,M1开始出现异常改变,M5明显.随着病程的延长,免疫组织化学示视网膜中VEGF,SDF-1α和CXCR-4表达水平逐渐增高,与正常对照组相比,造模后M1就有明显增高,M5差异有统计学意义(P<0.05).RT-PCR示VEGF,SDF-1α和CXCR-4 mRNA的表达造模后M1就有明显增高,M5差异有统计学意义(P<0.05).Western印迹示VEGF,SDF-1α和CXCR-4的蛋白表达造模后M1无明显改变,M3升高(P<0.05),M5时升高明显(P<0.05). 结论:DR时VEGF,SDF-1α和CXCR-4在视网膜中的表达水平随糖尿病病程延长逐步增高,是DR的重要因素.

祛风通络方对阿霉素肾病大鼠肾小球足细胞nephrin mRNA表达的影响

目的:观察阿霉素肾病(AN)大鼠肾小球足细胞nephrin mRNA表达及祛风通络方对其表达的影响.方法:清洁级SD大鼠140只,随机抽取32只作为空白组,余108只建立AN大鼠模型,90只大鼠模型成功后随机分为模型组、祛风组、祛风+激素组、激素组和苯那组,给予相应干预,电镜检测超微结构变化,第0,3,5,7周应用间接免疫荧光技术、RT-PCR分别检测nephrin蛋白荧光表达分布和nephrin mRNA表达并进行组间比较.结果:模型成功时,透射电镜示AN大鼠肾小球足突呈部分或弥漫性融合.7周时与模型组相比,祛风组和激素组nephrin蛋白的荧光分布呈连续性或斑片状分布,荧光强度明显增强(P＜0.01);祛风组和激素组nephrin mRNA的表达明显上调(P＜0.01).结论:Nephrin的表达异常是AN大鼠蛋白尿发生发展的重要分子机制,祛风通络方可上调AN大鼠足细胞nephrin的表达和分布而起保护肾小球滤过屏障的作用.

临床分离铜绿假单胞菌mucA基因突变与藻酸盐合成的关系

目的:探讨临床分离铜绿假单胞菌mucA基因突变情况及其与菌落形态、藻酸盐合成之间关系.方法:对58株临床分离铜绿假单胞菌(50株黏液型菌株和8株非黏液型菌株)mucA基因进行PCR-SSCP及DNA序列分析,与GenBank中野生型铜绿假单胞菌PAO1标准序列进行比对,并用比色法测定58株细菌藻酸盐浓度.结果:细菌mucA基因突变总发生率为100%,能够影响氨基酸编码的有意义突变在非黏液型菌株中未能检获,在黏液型菌株中为32%(16/50);共发现14个突变位点,其中导致氨基酸编码发生改变的位点有5个,其余为沉默突变;黏液型菌株藻酸盐含量较非黏液型细菌显著增加(P＜0.01),发生了有意义的mucA基因突变的菌株,藻酸盐合成较发生无意义突变的菌株显著增加(P＜0.01).结论:mucA突变与临床分离铜绿假单胞菌菌落形态以及藻酸盐合成能力有关.

结直肠癌与DNA甲基化

表观遗传调控是真核基因的表达调控之一,在结直肠癌的发生发展中具有重要作用.DNA甲基化修饰是表观遗传调控中目前研究较多的部分,DNA甲基化异常引起抑癌基因失活和癌基因激活是结直肠癌形成的分子机制之一.DNA异常甲基化的逆转可能有助于结直肠癌的诊断和治疗.

Noonan综合征1例附文献复习

Noonan综合征是一种罕见的常染色体显性遗传疾病, 新生儿中发病率达1/2 000～1/1 500~([1]).其主要临床表现为身材矮小,特殊面容和先天性心脏病. 近50%的病例为12号染色体上11型非受体蛋白酪氨酸磷酸化酶(protein tyrosine phosphatase, non-receptor 11,PTPN11)基因发生错义突变,导致非受体蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2自体磷酸化而获得自身功能所致.

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