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癫痫病的细胞水平研究及进展
癫痫病是一种难治性神经系统疾病,目前医疗水平还不能将该病完全治愈,大多以控制为主.癫痫病的成因仍然未能阐明,很多学者针对其不同的成因,采用不同的方法来研究癫痫病的发作机制,研究层面也各不相同.技术手段上,膜片钳技术可以更加直接的从功能方面来阐述癫痫病电生理方面的特征与性质.此文主要探讨用于膜片钳技术的细胞材料的特点,以及其应用.
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肿瘤相关抗原CA72-4与胃癌
CA72-4或TAG-72是一种高分子(相对分子量>10 6u)的粘蛋白,其抗原分子二糖NueAc(2,6)GalNAc是从乳腺癌肝转移细胞作为免疫原制作的单克隆抗体B72.3和从结肠癌培养细胞的7AG-72抗原作为免疫原制作的单克隆抗体CC49识别的糖链抗原.
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大批量培养细胞爬片染色的简易装置
细胞培养技术越来越被当今许多学科所重视与应用[1].显示培养细胞形态结构的染色方法因此也受到人们的关注.长期以来研究者们使用的方法取得了较好的结果[2,3].但是应用到大批量的实验上时,就显得比较麻烦,且有染色结果有反应不一致的缺憾.我们经过多次摸索,利用普通染色架制作出一种简易装置,可一次染几十瓶培养细胞的爬片,取得良好效果,现介绍如下.
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当归及阿魏酸钠对内皮细胞中细胞因子表达改变的影响
目的:检测高脂血清对内皮细胞中转化生长因子β1(TGF β1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响,并观察当归、阿魏酸钠的作用.方法:实验分四组,即:正常对照组;高脂血清损伤组;当归+高脂血清组;阿魏酸钠+高脂血清组.用培养人脐静脉内皮细胞(ECV304)为研究对象,以高脂血清为损伤因子,观察当归及阿魏酸钠的作用.实验中用扫描电镜观察内皮细胞形态变化,用免疫细胞化学方法观测培养细胞中TGF β1及bFGF的表达改变.结果:高脂血清能明显使内皮细胞的超微结构受损,细胞表面干裂,有孔隙;微绒毛分布不规则,减少甚至消失.细胞中TGF β1的表达明显降低,而bFGF的表达明显增高;当归、阿魏酸钠可以有效地减轻高脂血清所致的内皮细胞超微结构的损伤;并使细胞中TGF β1的表达明显增高,而bFGF的表达降低.结论:当归及阿魏酸钠对内皮细胞TGF β1、bFGF表达的影响可能为其抗动脉粥样硬化的机制之一;阿魏酸钠可能为当归的有效成分之一.
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复方丹参滴丸对人血管内皮细胞功能的保护作用
目的:观察复方丹参滴丸对细菌内毒素(LPS)所致人血管内皮细胞损伤的影响,以探讨其对心脑血管疾病治疗的机制.方法:人脐静脉内皮细胞培养,建立脂多糖损伤模型(以10 mg/L的LPS培养液作为损伤浓度培养细胞12 h),按分组分别把不同浓度的丹参滴丸(1g/L、0.5g/L、0.25g/L、0.1g/L)于损伤前、损伤后加入,分别进行细胞活力、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、内皮素(ET-1)、细胞内钙的测定及形态学指标观察.
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卡介苗增强人肺腺上皮细胞Fall-39 mRNA表达及其抗菌活性
目的:Fall-39是Cathelicidine家庭中唯一存在人体内的抗菌肽,具有广谱抗菌活性和细胞毒性,对天然免疫与获得性免疫均发挥作用,因此在抗生素肽开发领域日益受到重视,本研究观察卡介苗能否增强人肺腺上皮细胞表达Fall-39.方法:根据GenBank中人Fall-39的cDNA序列资料,设计特异性引物,应用RT-PCR的方法检测mRNA的表达.超声击粹、蔗糖密度梯度离心及SDS抽提等步聚提取卡介苗胞膜蛋白,Sephadex G-75柱层析粗分其不同分子量蛋白.结果:卡介苗的确可刺激人肺腺上皮细胞Fall-39 mRNA的增强表达,这种增强表达具刺激物剂量和时间依赖性.BCG 100 mg/L刺激8 h时,Fall-39 mRNA表达量达到高.BCG胞壁蛋白经Sephadex G-75柱层析,获得的组分4(分子量范围约2.1-2.9 kD)刺激SPC-A-1细胞后Fall-39 mRNA的表达增强了8.5倍.培养细胞上清抗菌试验显示被刺激细胞培养上清的抗菌活性亦明显增强.结论:结果提示除细菌LPS外,BCG胞壁蛋白亦是Fall-39基因的激活因子,可诱导其基因的上调表达.
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尼可地尔在抑制内皮素诱导的血管平滑肌细胞增殖中的作用
目的:探讨丝裂素活化的蛋白激酶(MAPK),在ATP敏感钾通道开放剂尼可地尔抑制内皮素(ET-1)诱导的培养大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用.方法:将10-7~10-5mol/L的尼可地尔导于培养血管平滑肌细胞,ET-1诱导培养大鼠血管平滑肌细胞增殖.用Western Blot法测定磷酸化MAPK蛋白表达.[3H]胸腺嘧啶核苷酸掺入测定平滑肌细胞DNA合成.结果:ATP敏感钾通道开放剂尼可地尔抑制ET-1诱导的培养大鼠血管平滑肌细胞[3H]胸腺嘧啶核苷酸掺入并同时剂量依赖性下调MAPK蛋白表达.结论:ATP敏感钾通道开放剂尼可地尔可通过下调MAPK的表达从而抑制ET-1诱导的培养大鼠血管平滑肌细胞增殖.
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体外肝细胞三维培养的研究进展
肝细胞体外培养如何能长时间维持肝细胞分化表型及功能活力,是目前生物人工肝研究关键问题之一。体外培养细胞功能改善的一个重要原则就是模拟体内细胞环境,由此,众多研究学者提出体外肝细胞三维培养是解决上述问题的有效途径。近年来,国内外在该领域取得了较大的进展,使体外肝细胞培养功能活力、细胞分化表型维持时间都大大延长。本文就近年来体外肝细胞三维培养的研究进展、存在问题及展望做一简要综述。
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组织工程中天然支架材料的研究现状
组织工程学是近年来发展起来的一门新学科,是材料学、工程学和生命科学共同发展并相互融合的产物,其基本的思路是在体外分离、培养细胞,将一定量的细胞接种到具有一定空间结构的支架上,通过细胞之间的相互黏附、生长繁殖、分泌细胞外基质,从而形成具有一定结构和功能的组织或器官[1],因而,充足的种子细胞、合适的支架及促进种子细胞在支架上增殖分化的因子便成为组织工程的三大要素.
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顺铂对人肝癌细胞凋亡及相关基因野生型p53、p21WAF1/CIP1和c-myc表达的影响
1.材料与方法:主要试剂:人肝癌细胞株SMMC-7721引自第二军医大学,顺铂购自美国Sigma公司,生物素标记人野生型p53(wtp53)、p21WAF1/CIP1和c-myc探针为北京中山公司产品,原位杂交试剂盒购自北京医科大学病理系,细胞总RNA提取试剂盒购自华美生物工程公司.方法:(1)细胞凋亡模型的构建:用MTT比色法观察抗癌药顺铂对肝癌细胞生长的抑制作用并计算抑制率.收集不同药物浓度作用下的培养细胞,进行HE染色,倒置光显微镜下观察细胞凋亡及坏死的形态变化并计算凋亡率.不同作用点的细胞培养至预定时间,收集后离心沉淀常规提取RNA、琼脂糖凝胶电泳、紫外灯下观察并照像.
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内毒素对体外培养的肝细胞凋亡相关基因表达的影响
内毒素(lipopolysaccharide,LPS)在体外可以诱导肝细胞发生凋亡[1]。细胞凋亡的发生发展与许多凋亡相关基因表达的改变有密切的关系。 1. 材料与方法:采用Seglen法将雄性Wistar大鼠的肝细胞分离后培养24h。在培养基中直接加入LPS 10mg/L,分别在3h、6h、12h、和24h收集肝细胞,同时设正常对照组。用Moore等[2]的方法提取培养细胞的DNA片段。一步法提取RNA。半定量RT-PCR法检测在不同时间点基因PCR产物的含量。
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离心速度及时间对培养细胞透射电镜样品制备的影响
目的:探讨消化离心法中不同的离心条件对培养细胞超微结构的影响,寻找佳的离心速度及时间.方法:将培养细胞消化后分成不同的离心速度和时间组,电镜下比较各组细胞超微形态的变化.结果:当离心速度低于800 r/min,8min时,无法收集到足够的细胞量.离心速度2 000 r/min,15 min时细胞挤压变形,胞浆出现撕裂等人工假象.离心速度在800~1 500r/rain,8~15min时制样较容易,细胞超微结构保存良好.结论:消化离心法制备培养细胞透射电镜样品,其佳的离心速度和时间是800~1 500r/min,8~15min.
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培养细胞牵张损伤装置及测试系统的研制与应用
目的为从细胞水平直接观察应力、应变作用后细胞形态和功能的改变,研制计算机控制的培养细胞牵张损伤装置和相应的测试系统.方法应用空气动力学原理,采用微型空气压缩机、电磁阀、压力传感器、程控放大器和模数转换多功能卡研制了体外培养细胞牵张损伤装置,用于实验研究.其致伤参数由计算机精确控制,并采用压力法获取细胞在致伤过程中的应变规律.对培养的新生大鼠大脑皮层星型胶质细胞应用本致伤装置采用不同的条件致伤,检测乳酸脱清酶(LDH)活性和台盼蓝含量,并观察其形态学的改变.结果采用不同的致伤参数可复制出轻、中、重度的细胞损伤模型.结论培养细胞牵张损伤装置及测试系统的各项性能指标均达到设计要求,致伤过程简便、重复性好、结果稳定.新的乳胶膜变形规律检测方法和装置,明显优于国外文献报道的图像处理检测法,满足实验研究的需要.
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培养神经细胞透射电镜样本制备方法的探讨
目的 探讨培养神经细胞透射电镜样本制备的新方法.方法 分离SD大鼠大脑皮层神经细胞,培养于铺有琼脂糖和多聚赖氨酸薄膜的盖玻片上,适时固定、取膜,按常规程序制作超薄切片,电镜观察.结果 电镜观察神经细胞及髓鞘超微结构清晰,原有位置关系和连接方式保存良好,可见细胞间的紧密连接.结论 薄膜细胞培养法是培养细胞超微结构研究的好方法,也适用于培养细胞电镜免疫组化、电镜原位杂交的研究.
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外加直流电场干预细胞培养的装置
目的设计制作直流电场干预装置,作用于培养的细胞,用于研究外电场对细胞生物学行为的影响.方法采用有机玻璃和玻璃片制成细胞培养室、琼脂-盐桥电极和银-氯化银组成电极系统,设计制作微安级直流稳压稳流电源,组合直流电场干预装置.结果该装置能够产生稳定的生理强度的电场,培养细胞在细胞培养室中存活并保持正常生理状态.可在显微镜下观察细胞活动情况.结论电场干预细胞培养装置性能稳定,重复性好,可用于研究外加直流电场对细胞生物学行为的影响.
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丙型肝炎病毒感染细胞模型的研究概况
丙型肝炎病毒(HCV)是输血后肝炎的重要病原体,近年来对HCV的研究日益受到重视.但由于HCV是一种低复制病毒,实验动物及患者血清和组织中含量较少,直接研究HCV复制表达的机制十分困难,因此迫切需要建立HCV的细胞模型.
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贴壁细胞培养过程中支原体污染的几种救治方案疗效比较研究
支原体是细胞培养中常见、不易被察觉和干扰实验结果的污染物,约有30.3%~50.5%的细胞培养物中有支原体污染[1].培养细胞中支原体污染的来源包括:所使用的动物来源的一些产品如血清或已被支原体污染的细胞株系.
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培养细胞的石蜡切片用于DcR3免疫化学染色的探讨
[目的]建立一种培养细胞进行石蜡切片用于免疫细胞化学染色的方法.[方法]分别采用细胞爬片和石蜡切片方法处理细胞,比较HE及免疫化学染色效果.[结果]石蜡切片细胞分布均匀,阳性反应明显,定位明确,背景清晰.[结论]细胞石蜡切片的染色效果明显优于细胞爬片,值得推广.
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培养细胞的免疫细胞化学操作体会
对培养的细胞进行免疫细胞化学反应,可以在培养皿内直接进行,亦可经树脂包埋后,在半薄切片上进行.本实验应用上述二种方法,对培养的大鼠内耳血管纹的组织细胞进行了免疫细胞化学显示.组织细胞处理:1)平皿培养和盖玻片上培养的大鼠内耳血管纹处组织细胞,经Bouin固定液固定4h,0.01Mol/L PBS浸洗,0.1%的Triton x-100处理20min;2)平皿培养的细胞经酶处理,离心收集,2%戊二醛固定液固定4h,经丙酮脱水与锇酸固定(-20℃)、树脂包埋、半薄切片.免疫细胞化学反应:上述处理的细胞或切片进行免疫细胞化学反应,其反应步骤如下:①3%H2O2 10min;②正常羊血清封闭,室温20min;③角蛋白抗血清1:1000;波形蛋白抗血清1:10 00,4℃,24h;④先后滴加生物素化羊抗兔IgG和ABC复合物,室温各孵育45 min;⑤用0.03%H2O2和0.05%DAB反应8~10min,终止反应 .反应步骤③~⑤过程中,每步骤后均用0.01Mol/L PBS,(pH7.3)清洗.切片经酒精脱水,二甲苯透明,树脂封片.平皿培养和盖玻片上培养的大鼠内耳切片上可见来自血管纹上皮细胞的新增生的边缘细胞, 角蛋白免疫细胞化学反应呈阳性显示;也可见来自于螺旋韧带的结缔组织细胞,波形蛋白免疫细胞化学反应呈阳性显示.用以上二种方法处理的细胞进行免疫细胞化学反应的操作过程比较:1)培养皿内直接进行免疫细胞化学反应效果好,但需要抗体多;如果是塑料平皿,培养的细胞不宜用二甲苯透明、封片,细胞进行高倍照像时有一定的困难;2)盖玻片进行免疫细胞化学反应效果好,需要抗体少,标本能完成脱水、透明、封片,高倍照像无困难;但盖玻片进行培养时,培养的细胞可能有选择性.对于半薄切片的免疫细胞化学反应,虽然实验操作较为复杂,但只要能较好保存抗原性,免疫细胞化学反应一般没有困难.根据本实验的比较分析,我们认为细胞在充分脱水时的低温处理对抗原的保存有重要意义.
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46,XX,t(11;22)染色体平衡易位一例
患者 女,24岁,确认海鲜过敏史、否认有害物质接触史,原发闭经.出生时父、母年龄均为24岁,母亲无不良孕产史.丈夫26岁,少量吸烟,非近亲结婚.近5年先后妊娠3次,但均于40天左右自然流产,因此来我院进行遗传咨询.细胞遗传学检查:取患者及其丈夫、哥哥及父母外周血,肝素抗凝,无菌接种于1640培养基中0.8mL,37℃培养细胞68~72 h,常规收获细胞制片,G显带,镜下分析分散良好的中期染色体分裂相30个.患者核型为46,XX,t(11;22)(q25;q13),见图1.其丈夫、哥哥及父母表型、核型均正常.