异搏定对人皮肤成纤维细胞增殖的影响

目的:探讨钙离子通道阻滞剂异搏定对人皮肤正常成纤维细胞增殖的作用,为钙离子通道阻滞剂治疗瘢痕过度增生提供依据.方法:实验皮肤标本来源于2002-07/2003-07北京大学第三医院整形外科5例美容手术或植皮手术患者,取冗余全层皮肤组织,患者知情同意.体外培养3～8代的人皮肤正常成纤维细胞,实验分为异搏定组:包括1×10-3,1×10-4,1×10-5,1×10-6,1×10-7,1×10-8,1×10-9,1×10-10 mol/L组,分别在细胞培养孔中加入2 mL相应浓度异搏定的培养液;氢化可的松组:在细胞培养孔中加入2 mL浓度为1×10-7 mol/L氢化可的松的培养液;对照组:在细胞培养孔中加入2 mL体积分数为0.005的新生牛血清的Dulbecco's改良的Eagle's培养基.检测细胞活力采用锥虫蓝染色;细胞增殖状况测定应用3氚标记的胸腺嘧啶掺入法;观察细胞增殖抑制率[抑制率(Ⅰ%)=(阴性对照组每分钟脉冲数值-实验组每分钟脉冲数值)/阴性对照每分钟脉冲数值],取各例样本的平均值.结果:①人皮肤正常成纤维细胞的增殖动力学结果:对照组人皮肤正常成纤维细胞在接种12 h开始增殖,24 h达到高峰,48 h又逐渐降低.②异搏定对人皮肤正常成纤维细胞增殖抑制的浓度效应:各浓度的异搏定对人皮肤成纤维细胞的增殖均有抑制作用,其中1×10-6 mol/L异搏定与1×10-7mol/L氢化可的松对成纤维细胞增殖的抑制率无显著性差异(t=0.135,P=0.896＞0.05).③浓度为1×10-6mol/L异搏定对人皮肤正常成纤维细胞增殖抑制的时间效应:氢化可的松在24 h时对人皮肤正常成纤维细胞的增殖抑制作用显著高于6,12,48 h时[(60.67±18.94)%比(-19.69±21.26)%,(10.89±11.61)%,(37.03±12.17)%,q=10.867,6.732,3.197;P＜0.05];异搏定在24 h时对人皮肤正常成纤维细胞的增殖抑制作用显著高于6,12,48 h时[(51.42±15.30)%比(-16.83±16.90)%,(1.09±11.62)%,(17.41±13.41)%,q=10.566,7.791,5.265;P＜0.05];在药物作用48时异搏定对人皮肤正常成纤维细胞的抑制作用低于氢化可的松(t=2.423,P=0.042＜0.05).结论:不同浓度的异搏定对体外培养人正常皮肤成纤维细胞增殖有抑制作用,异搏定可能通过抑制成纤维细胞的增殖达到治疗瘢痕过度增生的作用.

体外培养不同代次人成纤维细胞超微结构观察

背景:成纤维细胞是构建组织工程化皮肤的种子细胞,通过电镜对各代细胞的超微结构进行了观察,以期为组织工程皮肤选择合适的种子细胞奠定基础.目的:观察正常人成纤维细胞体外培养过程中超微结构的改变.设计:自身对照观察.单位:潍坊医学院整形外科研究所、潍坊医学院附属医院普外科.材料:实验于2000-09/2002-09在潍坊医学院整形外科研究所完成.6-8岁正常男性儿童20例包皮环切术切除的健康包皮组织,均征得监护人同意自愿提供.方法:将正常人二倍体成纤维细胞进行连续传代培养,以不同代次的细胞为实验对象,通过倒置相差显微镜和透射电镜对各代细胞进行形态学及超微结构的观察.主要观察指标:①倒置相差显微镜观察的细胞的形态学改变.②透射电镜观察的成纤维细胞超微结构.结果:①倒置相差显微镜观察的细胞的形态学改变:细胞可传65～70代,成活280～300 d.45代以内的细胞生长较迅速,45代后的细胞生长逐渐缓慢,65代细胞几乎无增殖趋势.②透射电镜观察的成纤维细胞超微结构:40代以内细胞的超微结构无明显变化,41～65代细胞出现核膜内折,细胞核/浆比例减小,细胞表面突起和微绒毛减少.结论:体外培养的各代成纤维细胞超微结构改变程度不同,41代后变化明显.提示构建组织工程化皮肤宜选用40代以内的成纤维细胞为种予细胞.

腰椎间隙突出髓核内压力与相邻神经根的受压程度

背景:有关突出髓核占位性变与腰椎间盘突出症神经根受压程度及手法治疗的观察比较多见,尚缺乏从突出髓核内压力入手的相关量化研究.目的:观察腰椎间盘突出症患者突出髓核内压力对神经根受压程度的影响.设计:病例对照观察.单位:空军总医院全军正骨疗法中心.对象:选择2002-10/2003-12空军总医院骨科行手术治疗腰椎间盘突出症患者30例,正骨疗法中心行手法治疗的腰椎间盘突出症患者15例.干预:①30例手术患者根据直腿抬高试验分为直腿抬高阳性组、直腿抬高阴性组,测量术中患者突出髓核内压力大小;手术前后直腿抬高高度.②15例手法治疗患者,手法治疗后当即测量直腿抬高高度的变化.③椎间盘突出髓核大小测量为CT和/或MRI上横截面椎间盘突出顶点到椎体后缘的大垂直距离.主要观察指标:①患者腰椎间盘突出髓核内压力,突出髓核大小.②患者直腿抬高高度.结果:纳入30例手术治疗患者,15例手法治疗患者,全部进入结果分析.①患者腰椎间盘突出髓核内压力,突出髓核大小:手术患者直腿抬高阳性组患者突出髓核内压力明显高于阴性组患者[(2.119±0.753),(0.483±0.420)kPa,P＜0.01].阳性组和阴性组两组患者突出髓核大小无明显差异[(4.688±1.991),(4.857±2.033)mm,P＞0.05].②患者直腿抬高高度:手法治疗患者治疗后直腿抬高高度明显高于治疗前[(54.000±16.388)°,(72.668±15.338)°,P＜0.01],手法治疗前后CT或MRI显示突出髓核大小无改变(P＞0.05).结论:①椎间盘突出髓核对神经根的压迫与突出髓核内压力有关,突出髓核内压力较大时患者直腿抬高受限,突出髓核内压力较小时直腿抬高不受限.突出髓核对神经根的压迫与突出髓核大小尚未见明显影响.②推测:手法治疗可以通过降低突出髓核内压力减轻甚至解除神经根受压,可能不是仅依靠改变突出髓核空间占位达到治疗目的.

胶原蛋白水解酶对背根神经节细胞亚细胞结构急性损伤的实验

目的:观察胶原蛋白水解酶(胶原酶)对大鼠脊神经背根神经节细胞亚细胞结构急性损伤的影响,以期探讨胶原酶应用的安全性,并进一步论证经皮椎间盘胶原蛋白水解酶化学髓核溶解术(胶原酶髓核溶解术)治疗方法的安全性.方法:实验于2002-07/09在中山大学基础医学院完成.SD健康雄性大鼠28只.随机分为3组:正常组9只;胶原酶急性实验组9只、急性假手术组10只.急性实验组和急性假手术组大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉后,分离并辨认大鼠背根神经节,实验组局部滴注胶原酶1 mL(4 mL含1200 U),急性假手术组局部滴注生理盐水1mL.于注药后1 h行各组大鼠背根神经节细胞亚细胞结构的电镜检测.结果:各组大鼠背根神经节的神经元细胞、节内神经纤维检测结果:急性实验组背根神经节观测细胞种类、细胞数量、细胞大体形态、胞膜情况、节内神经纤维情况(有髓神经纤维有无肿胀,脱髓鞘,髓鞘松解等改变)、血管等情况与正常组、急性假手术组比较均无明显变化和差别.急性实验组背根神经节细胞亚细胞结构与正常组和急性假手术组比较均有明显变化和差别:①核仁部分偏向一侧.②线粒体大量肿胀,部分嵴断裂、空泡形成.各组均未见节细胞成群细胞坏死、细胞膜早期破裂、凋亡小体形成等节细胞凋亡相关表现和节细胞坏死相关表现.结论:临床应用于胶原酶髓核溶解术治疗浓度的胶原酶对背根神经节细胞是有损伤的.掌握胶原酶的用量和浓度,使胶原酶作用于精确合适的部位,才能提高胶原酶应用的安全性.

体外冲击波刺激成骨作用对骨不连间隙的影响

目的:观察有刺激成骨作用的体外冲击波对新西兰大白兔骨不连模型的治疗效果.方法:实验于2003-10/2004-10在广西壮族自治区实验动物中心、广西医科大学医学实验动物中心完成.选用清洁级(二级)雌性新西兰大白兔16只,体质量3.0～3.5kg,兔龄五六个月,每只动物右前肢桡骨为实验肢,左前肢桡骨为对照肢.无菌操作麻醉下截除双侧桡骨中段1 cm,缝合伤口,3个月后摄X线片证实骨不连模型形成.麻醉下采用德国多尼尔小王子体外冲击波碎石机对新西兰大白兔实验肢骨不连进行治疗,冲击波焦点能量为0.5 mJ/mm2,频率为70～80次/min,冲击量为800次,焦点聚焦范围为1.5 cm2,在透视下调整冲击焦点,分别对骨折远、近端边缘进行冲击.对照肢不作任何治疗.采用数码成像X射线机分别于冲击波治疗前及治疗后第3天,第2,4,6,8,12周摄实验肢和对照肢前肢正位X射线片,在计算机上精确测量治疗前后骨折间隙的宽度;同时各处死动物1只,取骨折间隙组织进行光学检查,选择第2,6,8周组织作电镜检查.比较实验肢和对照肢以及治疗前后骨折间隙的变化,观察光镜-成骨细胞、骨小梁的数量和排列的形成及电镜-成骨细胞的有丝分裂,线粒体等细胞器的活跃程度.结果:①X线片检测:实验肢4周后可见骨折间隙密度增高,呈云雾状,间隙缩小.12周后,骨折间隙基本骨性连接,骨纹理出现较规律的纵向排列,髓腔开始再通.对照肢织无明显变化.②组织光学及电镜检查显示:实验肢第3天光镜下可见活跃的圆形或类圆形成骨细胞,间隙两端见大量的微小碎骨屑.第2周见大量的活跃的成骨细胞、成纤维细胞和间充质细胞,形成骨样组织,软骨细胞增生活跃.电镜下可见有丝分裂,胞质内见较多的线粒体、高尔基体、粗面内质网.第6～8周时成骨细胞继续活跃成骨,骨样组织逐渐骨化,纤维组织逐渐转化成软骨组织,并出现钙化和骨化;电镜下可见大量成熟的骨细胞形成,细胞器消失.第12周见大量新生骨小梁,排列规则、致密,形成成熟的骨结构.对照肢各时间度所取骨折间隙组织无明显变化,未见成骨细胞,可见慢性炎症浸润、纤维结缔组织增生.③冲击波治疗前后动物模型骨不连间隙的变化:实验肢骨折间隙变化治疗前与第4,6,8,12周比较差异显著[(6.02±2.11),(7.05 ±1.91),(7.35±1.24),(7.51±1.57),(8.62±1.48)mm;t=2.561,3.543,3.922,5.659,P＜0.05～0.001];实验肢与对照肢治疗后第4,6,8,12周比较差异显著[(6.36±1.89),(6.42±2.02),(6.40±2.12),(6.51±2.31)mm;t=2.376,2.531,3.744,5.126,P＜0.05].结论:实验肢经冲击波治疗后骨不连间隙成骨活跃,不同时段摄X线片显示骨折逐渐达骨性愈合,说明体外冲击波是一种治疗骨不连创伤小、效果确切的方法.

解毒烧伤膏对深Ⅱ度烫伤创面愈合中肿瘤坏死因子α及表皮细胞生长因子表达的调控

目的:烫伤创面给予解毒烧伤膏治疗后,观察肿瘤坏死因子α及表皮细胞生长因子在愈合过程中表达水平的变化.方法:实验于2004-09/11在中山大学北校区实验动物中心完成.选取广东产成年杂种猪8只,用自制恒温恒压水浴循环烫伤仪建立猪深Ⅱ度烫伤模型,于猪背部两侧以98℃热水烫12 s,各制作一个直径8 cm的圆形创面.一侧为解毒烧伤膏治疗侧,创面外用解毒烧伤膏,1次/d,另一侧为空白对照侧.用免疫组织化学方法结合图像数据分析,分别在烫伤后第1,3,5,7,9,11天检测肿瘤坏死因子α及表皮细胞生长因子表达水平的变化.结果:实验纳入猪8只,均进入结果分析.①猪深Ⅱ度创面烫伤后不同时间两侧的大体观察:解毒烧伤膏治疗侧创面愈合时间明显比空白对照侧提前[分别为(8.0±0.4),(10.3±0.6)d,P＜0.05].②猪深Ⅱ度创面烫伤后不同时间两侧的病理学观察结果:伤后第1天解毒烧伤膏治疗侧开始有基底层细胞增生,第5天可见明显增生的表皮细胞,细胞胞体较大,排列紧密,由单层上皮细胞向复层上皮细胞转化,并以毛囊区附近增生活跃.而空白对照侧第2天开始有局部细胞增生,至第7天增殖明显,细胞体积较小,分布疏松,以单层上皮细胞为主.③猪深Ⅱ度创面烫伤后不同时间肿瘤坏死因子α免疫组织化学观察结果:肿瘤坏死因子α在解毒烧伤膏治疗侧和空白对照侧于伤后的表达均有两个高峰,空白对照侧高峰时间分别为伤后第3天和第9天,解毒烧伤膏治疗侧的第1个高峰也是伤后第3天,峰值略低于空白对照侧(17.71±3.32,17.79±3.43,t=1.37,P＞0.05),第2个高峰则位于伤后第7天,较空白对照侧明显提前(P＜0.01).早期肿瘤坏死因子α主要表达在中性粒细胞,后期主要表达在单核细胞,部分血管内皮细胞亦见表达.④猪深Ⅱ度创面烫伤后不同时间表皮细胞生长因子免疫组织化学观察结果:解毒烧伤膏治疗侧在伤后第1天开始表达(7.32±1.79),主要位于基底细胞,第5天显著表达(18.18±3.46),第7和9天维持高水平表达.空白对照侧在伤后第1天基本无表达(2.31±1.12),第3天表达较弱,细胞数量少,于第7天表达出现高峰(18.26±3.56),并于第9和11天维持高水平表达.表皮细胞生长因子在解毒烧伤膏治疗侧的表达明显早于空白对照侧(t=2.21～3.95,P＜0.01).结论:解毒烧伤膏能够促进表皮细胞生长因子在创面修复的早期表达,并抑制肿瘤坏死因子α在创面修复后期的过度表达,有利于创面愈合.

BCR-ABL嵌合基因和佛波酯对EDAG基因表达的影响

目的:EDAG基因是一种与造血细胞发育、分化、恶变相关的新基因,观察具有诱导造血细胞分化的外源刺激剂佛波酯和BCR-ABL嵌合基因分别作用于K562细胞后对EDAG基因表达的影响.方法:实验于2005年在解放军军事医学科学院放射医学研究所杨晓明实验室进行.用聚合酶链反应的方法从人的血液基因组中分离出EDAG基因的调控区2 200bp片段,将其克隆到pGL3-basic的含有荧光素酶报告基因的质粒中,转染K562细胞.用佛波酯诱导细胞分化;转染BCR-ABL嵌合基因两种不同的方法,通过检测荧光素酶报告基因的方法,观察用两种不同的方法处理细胞后对EDAG基因表达的影响.结果:①佛波酯诱导K562细胞分化36,48 h后EDAG基因表达下调,基因活性分别降低2.5倍和3倍.②转染BCR-ABL嵌合基因到K562细胞24h后,发现EDAG基因表达下调,基因活性降低2.5倍.结论:诱导剂佛波酯和BCR-ABL嵌合基因可以影响EDAG基因在白血病细胞系K562中的表达.

外源性转化生长因子β1抗体对胶原瘢痕及神经再生的修复作用

目的:通过神经吻合口局部应用外源性转化生长因子β1的特异性抗体,阻断其诱导局部炎症反应和细胞外基质沉积的作用,以期达到预防或减少神经瘢痕的产生,提高神经修复.方法:实验于2003-04/2005-04在山西医科大学外科实验室完成.选用SD大鼠48只,随机分为转化生长因子β1抗体组和生理盐水对照组,各24只.两组大鼠坐骨神经切断后行神经外膜小间隙缝合,转化生长因子β1抗体组采用微量加样器于神经吻合口间隙内注射质量浓度为50 mg/L的Anti-外源性转化生长因子β1溶液0.1 mL;生理盐水对照组注射等量生理盐水,逐层缝合伤口.分别于术后4,12周取材,按照Petersen分级标准对皮肤、肌肉、筋膜和神经组织与周围组织粘连的程度进行评估.结果:实验纳入大鼠48只,全部进入结果分析.瘢痕成分的评估:①两组术后大体观察:术后两组大鼠皮肤及肌肉、筋膜愈合良好,均未发生伤口进开、进裂、感染现象.转化生长因子β1抗体组术后12周神经吻合口与周围组织粘连明显减轻,优于生理盐水对照组.②两组术后12周神经组织切片Masson染色结果:转化生长因子β1抗体组神经吻合口远端神经轴索增生活跃,胶原纤维形成较少,以神经外膜为主;生理盐水对照组神经吻合口远端神经纤维生长排列紊乱,连续性差,被胶原纤维包裹,胶原沉积较多,神经外膜肥厚.③术后12周两组Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量灰度值测量结果比较:转化生长因子β1抗体组Ⅰ型胶原纤维含量明显低于生理盐水对照组[(41.112±11.065),(49.561±8.097),P＜0.05],而Ⅲ型胶原纤维含量基本相似[(34.223±7.130),(32.284±5.497),P＞0.05].神经再生功能的评估:①术后12周两组坐骨神经功能指数比较:转化生长因子β1抗体组明显高于生理盐水对照组[(-19.090±22.493),(-28.660±22.649),P＜0.05].②两组术后12周电生理学检查结果:转化生长因子β1抗体组神经传导速度明显优于生理盐水对照组[(29.603±3.972),(16.215±4.619)m/s,P＜0.05].③两组术后周围神经纤维的镀银染色及周围神经髓鞘染色结果:转化生长因子β1抗体组髓鞘厚度和再生神经纤维的直径均优于生理盐水对照组[(1.36±0.23),(0.93±0.48);(9.40±0.86),(7.99±0.36)μm;P均＜0.05].结论:周围神经损伤后神经端或对端的吻合治疗中,局部应用外源性转化生长因子β1抗体,能够抑制或减少局部神经胶原瘢痕的产生,从而有效促进大鼠周围神经功能的恢复.

新疆不同民族骨肉瘤患者病变组织中p53及bcl-2和增殖细胞核抗原表达的差异

背景:骨肉瘤在好发于轻少年恶性骨与软组织的肿瘤中居第一位,在临床中,发现新疆少数民族中的发病率较为多见,其发病和预后在基因水平是否存在种族差异.目的:观察新疆不同民族骨肉瘤发生发展中的p53,bcl-2,增殖细胞核抗原基因表达差异情况.设计:非随机临床病理标本对照的实验.单位:新疆医科大学病理中心免疫组织化学实验室.对象:取自新疆医科大学第一附属医院及石河子大学第一附属医院病理科1984-01-01/2001-12-31手术切除的52例骨肉瘤患者组织标本(52块),男29例,女23例;其中哈族12例,维族17例,汉族23例);另取32例瘤样病变患者组织(骨纤维结构不良,纤维异常增殖症)标本(32块),其中哈族7例,维族11例,汉族14例.所取标本患者均获完全知情同意将自己的标本用于此项研究.方法:实验在新疆医科大学病理中心免疫组织化学实验室进行.两种标本中p53,bcl-2和增殖细胞核抗原表达监测应用免疫组织化学ISAB法.以磷酸盐缓冲液代替一抗作空白对照,以已知阳性的肿瘤标本作阳性对照.P53蛋白和增殖细胞核抗原阳性表达在细胞核内,有明显的红棕色颗粒状染色为阳性,而Bcl-2蛋白阳性则定位于胞浆上.主要观察指标:①不同民族骨肉瘤中p53,bcl-2和增殖细胞核抗原的表达结果.②p53,bcl-2,增殖细胞核抗原在骨肉瘤和骨的瘤样病变组织的表达情况.③骨肉瘤中bcl-2与p53和增殖细胞核抗原间的相关性.结果:①不同民族骨肉瘤中p53,bcI-2和增殖细胞核抗原的表达结果:哈族、维族及汉各之间p53,bcl-2,增殖细胞核抗原阳性率无显著差别(P＞0.05).②p53,bcl-2,增殖细胞核抗原在骨肉瘤和骨的瘤样病变组织的表达情况:骨肉瘤中P53,Bcl-2蛋白、增殖细胞核抗原表达阳性率均显著高于瘤样病变组织(42.31%比3.13%,59.62%比0.75%比31.25%,P＜0.01).③骨肉瘤中bcl-2与p53和增殖细胞核抗原间的相关性:骨肉瘤中bcl-2与p53之间、bcl-2与增殖细胞核抗原之间有相关关系(X2=5.8182,4.9000,P＜0.05).结论:结果表明骨肉瘤组织内p53,bcl-2和增殖细胞核抗原表达与肿瘤分化程度,民族分布未见统计学差别,说明这些基因在骨肉肿瘤发生过程中具有共同调控环节,与不同民族的遗传背景关系不大.

P21WAF1基因多态性与乳腺癌发病的关系

目的:探讨P21WAF1基因多态性在乳腺癌发生、发展中的作用.方法:实验在中山大学附属第三医院病理科实验室完成.收集中山大学附属第三医院2002-01/12及江门市人民医院1995-01/2000-12病理存档蜡块120块,收集同期50块乳腺良性病变标本作对照.采用聚合酶链-单链构象多态性分析法检测120例乳腺癌组织和50例乳腺良性组织P21WAF1基因的多态性.结果:①聚合酶链反应扩增结果:聚合酶链反应产物在琼脂糖凝胶电泳中分别显示为536 bp和300 bp.②聚合酶链反应单链构象多态性检测结果:120例乳腺癌和50例良性乳腺组织P21WAF1基因多态性分别为24.2%(29/120)和6.0%(3/50),乳腺癌组织高于良性乳腺组织,两组间差异有显著性(P＜0.05).结论:乳腺癌组织存在P21WAF1基因多态性,P21WAF1基因多态性与乳腺癌发生有关.

人退行性变椎间盘组织细胞凋亡与相关基因Bcl-2和Bax表达的关系

目的:通过对正常与退行性变(简称退变)椎间盘组织细胞凋亡的观察,探讨细胞凋亡和凋亡相关基因Bcl-2及Bax蛋白在腰椎间盘退变中的作用.方法:采用原位DNA片段末端标记和免疫组织化学方法,检测开鲁县医院2002-12/2003-12经手术切除的人退变椎间盘12例及正常椎间盘10例组织细胞的凋亡状态及凋亡相关基因Bcl-2和Bax蛋白表达.①凋亡指数判定:以平均100个细胞核中含凋亡细胞个数为凋亡指数.②形态学变化判定:计算阳性细胞百分比.③平均吸光度值测定.结果:①椎间盘髓核细胞凋亡指数:正常组为24.897±3.620,退变组为49.232±3.440.②椎间盘髓核阳性细胞百分比:正常组Bcl-2为(31.440±4.150)%,Bax为(29.372±2.588)%;退变组Bcl-2为(18.239±2.470)%,Bax为(52.349±3.764)%.③椎间盘髓核细胞内免疫反应产物的平均吸光度值:正常组分别为0.183±0.010,0.203±0.012,0.169±0.005;退变组分别为0.152±0.003,0.310±0.008,0.262±0.014.④两组间凋亡指数均值,Bcl-2和Bax蛋白表达均有显著性差异(P＜0.05).结论:在椎间盘退变过程中,椎间盘髓核细胞的减少是通过凋亡的形式实现的,凋亡相关基因Bax表达增高,Bcl-2表达降低.Bcl-2和Bax参与了髓核细胞凋亡的过程并在促进和抑制凋亡的发生中发挥重要作用.

肥厚性瘢痕胶原酶治疗效果的初步观察

背景:肥厚性瘢痕是是烧伤和创伤后局部胶原合成与降解平衡失调,胶原异常聚集的结果.目的:观察胶原酶影响裸鼠移植肥厚性瘢痕胶原降解的过程,以及其对肥厚性瘢痕的治疗作用.设计:对照实验.单位:解放军第三军医大学西南医院康复理疗科.对象:实验于1995-07/1997-04在第三军医大学实验动物中心完成.肥厚性瘢痕标本10例,均为第三军医大学西南医院整形外科手术切除的肥厚性瘢痕,术前已征得患者同意.实验动物:BAVB/C裸鼠15只,雄性8只,雌性7只.共移植肥厚性瘢痕组织15只,一次存活10只,余2次移植,存活动物2只,死亡3只.将存活裸鼠随机分为胶原酶治疗组和对照组,每组6只.方法:将整形手术切除的肥厚性瘢痕移植于裸鼠背部创面,建立肥厚性瘢痕裸鼠移植模型.胶原酶治疗组局部注射1%胶原酶于瘢痕组织,对照组局部注射胶原酶溶解液,1次/周,共4周,治疗结束后取材行肉眼观察、光、电镜观察和分析.主要观察指标:①治疗前后瘢痕组织的肉眼观察结果.②治疗前后瘢痕组织的光镜观察结果.③治疗前后瘢痕组织的电镜观察结果.结果:移植瘢痕后实验裸鼠存活12只,均进入结果分析,胶原酶治疗组6只,对照组6只.①胶原酶治疗组瘢痕面积变小、高度变低、质地变软,与对照组相差十分显著.②在苏木精-伊红染色、Van Gieson氏胶原纤维染色方法和复合染色法切片上,胶原酶治疗组真皮层变薄,胶原纤维结构模糊,排列较疏散;而对照组瘢痕组织真皮层肥厚,含丰富的胶原纤维,胶原纤维排列紊乱.③在电镜下观察,胶原酶治疗组胶原纤维被破坏,结构不清.对照组胶原纤维排列紊乱,横纹明显,结构清楚.结论:胶原酶使肥厚性瘢痕胶原被降解,瘢痕变小变软,提示局部注射胶原酶可能是治疗肥厚性瘢痕较好的方法.

关节软骨缺损修复的基因治疗实验人胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染软骨细胞及其在软骨细胞中的表达

目的:探讨胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人软骨细胞的可能性及其在软骨细胞中的表达,并初步判断转基因细胞的生物学功能变化.方法:实验于2002-07/2003-06在中山大学附属第二医院医学研究中心完成.①构建pcDNA3.1-胰岛素样生长因子I/GS质粒,将构建质粒在大肠杆菌DH10B中大量扩增后,抽提纯化质粒,并对质粒进行测序鉴定.②将鉴定的质粒用阳离子脂质体转染人关节软骨细胞,通过逆转录-聚合酶链反应、Westren-blot等方法检测胰岛素样生长因子Ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达.③分别将同代软骨细胞与转基因细胞的培养液、软骨细胞与转基因细胞裂解液和二甲基亚甲蓝共孵育后,检测各混合液的吸光度,以此判断同代软骨细胞、转基因细胞、软骨细胞培养液、转基因细胞培养液中的蛋白多糖含量.结果:①质粒鉴定结果:质粒抽提纯化后电泳可见3条DNA条带,符合质粒的电泳图谱;质粒的测序结果和胰岛素样生长因子Ⅰ基因序列完全吻合.②胰岛素样生长因子Ⅰ基因在软骨细胞中的表达:质粒转染软骨细胞后,反转录-聚合酶链反应能见到298 bp的胰岛素样生长因子ⅠmRNA片断的表达;Western-blot可见7.6 ku的胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白表达条带.③转胰岛素样生长因子Ⅰ基因对软骨细胞分泌蛋白多糖的影响:转基因软骨细胞裂解液和同代的软骨细胞裂解液的蛋白多糖含量分别是(5.23±0.62)mg/L和(2.47±0.31)mg/L,两组比较,差异有显著性意义(t=2.88,P＜0.05);转基因软骨细胞培养液和同代非转染软骨细胞培养液中的蛋白多糖含量分别为(9.92±1.04)mg/L和(4.56±0.51)mg/L,两组比较,差异有显著性意义(t=6.47,P＜0.05).结论:胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人关节软骨细胞后能在软骨细胞中表达,并能促进软骨细胞分泌软骨基质蛋白多糖,具有促DNA合成和维持软骨细胞表型稳定的能力.转胰岛素样生长因子Ⅰ基因软骨细胞的研究为体外软骨组织工程和关节软骨病的基因治疗提供了直接的实验依据.

非小细胞肺癌细胞周期蛋白D1、p16及视网膜母细胞瘤基因蛋白表达与预后的关系

背景:细胞周期调控失常是造成细胞异常增殖进而导致肿瘤发生的重要机制,p16、视网膜母细胞瘤基因蛋白参与的细胞周期蛋白D1/细胞周期蛋白依赖性激酶通路是一条重要的细胞周期调节途径.目的:了解在非小细胞肺癌中细胞周期蛋白D1、p16、视网膜母细胞瘤基因蛋白表达的情况,并探讨它们与预后之间的关系.设计:应用免疫组织化学方法检测相关指标的表达情况,利用随访资料进行生存率及预后因素的比较分析.单位:福建省立医院呼吸科.对象:实验于2002-01/06月在福建省立医院病理科完成.肺癌组织标本来自68例非小细胞肺癌患者,肺癌组织学分型依据1981年WHO制定的标准,TNM分期依据1997年国际抗癌联盟修订的标准.方法:将肺癌组织标本应用免疫组织化学方法染色,用以知阳性染色的肺癌切片为阳性对照,用磷酸盐缓冲液替代一抗为阴性对照.以肿瘤细胞核或细胞质呈现棕黄色颗粒为阳性.每例标本随机观察5个高倍视野,每个视野计数200个肿瘤细胞,取平均值.根据阳性细胞所占比例分为:阳性细胞数小于5%或看不到明显的阳性细胞为"-";阳性细胞数在5%～20%为"+'";阳性细胞数在21%～50%为"++";阳性细胞数超过50%为"(#)".检测68例非小细胞肺癌组织中细胞周期蛋白D1、p16、视网膜母细胞瘤基因蛋白表达情况.主要观察指标:细胞周期蛋白D1、p16、视网膜母细胞瘤基因蛋白表达情况及患者术后生存期.结果:①非小细胞癌组住中细胞周期蛋白D1、p16、视网膜母细胞瘤基因蛋白表之间的相关性:达率分别为55.9%,48.5%,52.9%,应用x2对资料进行分析,其表达之间均无明显相关.②细胞周期蛋白D1、p16、视网膜母细胞瘤基因蛋白表达与非小细胞肺癌患者预后的关系:细胞周期蛋白D1阳性表达者的平均生存时间较细胞周期蛋白p16阴性者短[(12.40,35.40)个月,(x2=5.31,P=0.021)];p16阳性表达者的平均生存时间较p16阴性者长[(27.84,15.95)个月,(x2=4.38,P=0.036)];视网膜母细胞瘤基因蛋白阳性达者的平均生存时间与视网膜母细胞瘤基因蛋白阴性者相比无显著差别[(18.50,24.19)个月,(x2=0.04,P＞0.05)].③非小细胞肺癌患者预后多因素Cox风险比例模型分析:提示细胞周期蛋白D1过度表达者预后差(P=0.057),而p16则为1个预后保护性因素(P=0.039).结论:与细胞周期G1→S调控相关的基因细胞周期蛋白D1、p16、视网膜母细胞瘤基因均参与了非小细胞肺癌的发生发展,检测细胞周期蛋白D1、p16的表达水平对预测预后有重要意义.

军事训练中发生髌尖末端病的发病率调查

背景:在军事训练中如训练方法不当,容易导致各种训练伤的发生,髌尖末端病即是训练伤的一种.目的:探讨军事训练所致髌尖末端病的发病特点及其实施干预措施前后的发病率变化.设计:抽样调查.单位:广州军区广州总医院骨科,驻香港部队医院外科.对象:观察对象为2000-08(非干预组)和2001-08(干预组)某全训部队在同样训练大纲下进行训练的18～24岁男性陆军战士,非干预组共调查2 783名战士,干预组共调查5824名战士.方法:由具有高、中级技术职称职的医务人员组成调查小组,调查前统一诊断标准,采用问卷调查和现场检查相结合的方式,对问卷中有训练后膝关节疼痛病史者均进行现场检查,对符合诊断者详细了解训练情况及导致该病的致病因素,并进行患膝X射线检查.非干预组为未进行预防干预的情况下于某全训部队部分连队调查髌尖末端病的发病率及病因.干预组为制定防治措施并进行预防和治疗干预,1年后再次于该部进行调查,了解干预后的结果.主要观察指标:两次调查的战士中患髌尖末端病的发病率.结果:第1次共调查2783名战士,第2次共调查5824名战士,均进入结果分析,无脱落者.①非干预组中有17名患髌尖末端病,发病率为0.61%;干预组有15名患髌尖末端病,发病率为0.26%(P＜0.01).②两次调查患病的32名患者中,均有髌尖疼痛症状及典型压痛体征,12个髌骨X射线检查有髌尖延长及"眼泡征".③致病因素:主要与跑跳训练项目有关,23名为400m障碍训练所致,7名为5 km越野训练所致.结论:军事训练所致髌尖末端病多由跑跳训练项目所致,通过预防干预可使发病率明显下降.

乳腺癌术后患者患侧上肢自护培训效果调查

背景:乳腺癌术后患者的患侧肢体由于组织结构创伤破坏严重,常可导致功能活动障碍,直接影响生活和工作.目的:通过3阶段功能锻炼培训及健康指导,促进乳腺癌术后患者患侧上肢功能恢复.设计:临床观察.单位:中国医科大学附属第一医院护理部.对象:以2002-05/2004-05在中国医科大学附属第一医院确诊为乳腺癌并已接受手术治疗的患者168例为观察对象.患者均为女性;年龄34～72岁,平均49.65岁.方法:对乳腺癌术后患者进行患侧上肢自护培训:①术后卧床期(手术后第1,2天):进行手腕、肘部的主动活动和被动活动的培训,2～3次/d,15～20min/次.②下床活动期(手术后第3～14天):进行肩关节活动的培训,3～4次/d,15～20min/次.③出院后(3～6个月):上肢功能锻炼指导培训,2～3次/d,15～20 min/次.通过复诊进行患者自护培训效果的调查,患者自护培训后每2个月复诊1次.主要观察指标:①乳腺癌术后患者患侧上肢功能恢复情况及自护情况.②坚持患侧上肢功能锻炼情况及有无异常.结果:168例患者均进入结果分析.①患者患侧上肢功能恢复90.0%(151/168),并能从事简单工作和家务;患者能在日常生活中时刻注意患侧上肢的自我保护65.0%(109/168).②患者能将出院后的上肢功能训练坚持半年以上75.0%(126/168);患者曾出现过不同程度的患侧上肢淋巴水肿25.0%(42/168).结论:加强对乳腺癌术后患者患侧上肢功能锻炼的培训,告知患者及家属坚持上肢锻炼的实际意义及掌握自我保护的要领,患侧上肢功能恢复效果理想.

中老年人群骨关节炎的流行病学特征

目的:了解国内外近期骨关节炎流行病学调查研究进展概况,为中国"十五"科技攻关项目<中国中老年骨关节炎状况研究>的实施奠定良好理论指导基础.资料来源:应用计算机检索Medline 1991-01/2004-12的文章,检索词为"Osteoarthritis,epidemiology'',限定文章语言种类为English;同时检索1995-01/2002-12 http:∥www.wanfangdata.com.cn的文章,检索词为"骨关节炎,流行病学",限定文章语言种类为中文.资料选择:纳入条件:①关骨关节炎流行病学调查研究.②骨关节炎危险因素及防治研究的文章.排除条件:①综述文献.③内容雷同的文献.资料提炼:共搜索1302条文献.筛选出13篇有关骨关节炎流行病学调查及防治研究的典型代表性文章.资料综合:①骨关节炎是一种随年龄增长而患病率明显增加的退性性疾病;女性患病率高于男性.②骨关节炎的患病危险因素较多,既有生活环境因素,又有遗传因素.③骨关节炎的防治主要在于早发现,早诊断,早治疗以降低其发病率.改变病情药物和软骨保护剂的研制和临床应用,以及软骨或软骨细胞移植等,可能是今后很有希望的几种治疗方法;基因治疗是膝关节炎治疗的有效方法之一.④减轻体质量、保护关节不受损、增加运动及维生素的摄入可有效的减少或延缓骨关节炎的发生.结论:骨关节炎对人类的威胁正在迅速增加,有效的治疗和预防保健骨关节炎已成为重大的公共卫生学问题;国内尚缺全国范围内骨关节炎流行病学调查资料;有必要对我国骨关节炎患病率和危险因素进行流行病学研究,为进一步病因和防治研究打基础.

腰椎间盘突出症牵引疗法的技术发展及其量化标准

目的:应用腰椎牵引治疗的方法较多,在临床治疗上应如何解决其准确的定位和量化的标准问题.方法:应用计算机检索Pubmed数据库和万方数据1984-01/2004-12与腰椎牵引相关的文章,对腰椎牵引疗法的机制、牵引方法及与其他疗法配合综合治疗的进展情况进行归纳总结和分析.结果:①腰椎牵引疗法的机制:牵引法能减轻椎间盘压力,使椎间增大,后纵韧带紧张,对脱出的椎间盘形成一种向前的压应力,有利于突出髓核不同程度回纳或改变与神经根相对位置关系.在间断的牵引过程中,对椎间盘所施的拉力形成负压,起到类似吸吮作用而使椎间盘回纳.②腰椎牵引疗法的技术进展:目前有许多样式的机械牵引,包括:自动脉冲牵引治疗床;振动牵引床;立式自动控制腰椎牵引床;成角旋转快速腰椎牵引床等.③腰椎牵引与其他疗法配合的综合治疗:有成角旋转牵引与其他疗法配合进行综合治疗,如骶管注药后成角旋转牵引,成角旋转牵引后配合推拿治疗,旋转牵引过程中同时使用手法;腰椎小关节针刀松解配合牵引治疗;加热牵引法;微电脑控制牵引加微波透热组合整体治疗等均收到较好效果.结论:目前腰椎牵引的方法和种类较多,但还未真正做到牵引时对病椎的准确定位,以及对不同节段牵引角度的统一定量.

儿童疼痛的行为评估

由于儿童患者生理功能尚不完善,对疼痛的认知和表达能力缺乏,影响了评估结果的准确性,因此如何运用恰当的儿童评估工具是治疗工作中需要重视的一个问题.

颈椎螺钉和钢板内固定器械的生物力学评价

目的对颈椎前路钢板、后路侧块螺钉、齿状突螺钉、C1-2关节突螺钉、椎弓根螺钉和枕颈部钢板的生物力学特征作一综述.方法应用计算机检索PUBMED 1998-01/2005-01期间的相关文章,检索词为"Caspar,Orozco,Roy-Camille'",并限定文章语言种类为英文.同时计算机检索万方数据库2001-01/2005-01期间的相关文章,检索词为"颈椎前路钢板、后路侧块螺钉、齿状突螺钉、C1-2关节突螺钉、椎弓根螺钉、枕颈部钢板",并限定文章语言种类为中文.对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容应与颈椎前路钢板、后路侧块螺钉、齿状突螺钉等器械的生物力学特征相关.排除标准:重复研究或Meta分析类文章.结果共收集到96篇相关文献,24篇文献符合纳入标准,排除的72篇文献是由于内容陈旧或重复.生物力学实验证实前路钢板在抵抗伸展和侧屈载荷时优于后路钢丝系统.在颈椎后部结构缺失或功能不全造成不稳时,颈椎后路钢板螺钉固定系统是一种理想的选择.对于Ⅱ型齿状突骨折应用直径为4.5 mm的Herbert中空螺钉,比采用两枚直径为3.5 mm的AO螺钉具有更大的抗扭曲强度.在齿状突骨折伴有明显的旋转和移位不稳时,同时有寰椎横韧带损伤,单独应用后路钢丝技术固定明显地降低融合率.从解剖学和生物力学两个方面来讲,在C2和C7可能更适合应用椎弓根螺钉.结论骨科固定器设计的影响因素很多,用生物力学来评价不同器械的优缺点是一重要方法,前路和后路螺钉和钉板系统成为外科广泛应用的内固定器械,并经过不断的改进,取得了良好的治疗效果.

聚乳酸-聚羟乙酸/磷酸三钙薄膜预防屈肌腱粘连的实验

目的:探讨在屈肌腱损伤修复后应用和不应用聚乳酸-聚羟乙酸/磷酸三钙薄膜包裹两种情况下,术后不同时期屈肌腱的粘连情况和聚乳酸-聚羟乙酸/磷酸三钙薄膜在肌腱愈合过程中的作用.方法:实验于2004-03/10在东南大学修复重建外科研究所实验室进行.选取健康成熟的三黄鸡40只,以右足第2,3趾深屈肌腱横断后修复作为肌腱粘连的动物模型,取右足第2趾为实验趾、第3趾为对照趾.聚乳酸-聚羟乙酸/磷酸三钙薄膜包裹,术后3,4,8周分别取材.通过生物力学、大体观察、组织学及扫描电镜检查,观测肌腱愈合情况、与周围组织的粘连情况、屈趾功能及假鞘结构.结果:进入结果分析的实验鸡39只.①实验趾肌腱的屈趾功能明显优于对照趾[术后3周:(10.53±1.07),(7.78±0.37)mm,术后4周:(14.96±1.51),(9.37±1.35)mm,术后8周:(19.93±0.81),(11.47±0.15)mm,P＜0.05].②大体观察实验趾在各时间段肌腱与腱周组织的粘连均较对照趾轻,肌腱为内源性愈合,并形成具有正常滑膜A、B型细胞的假鞘结构,与肌腱间有间隙.结论:聚乳酸-聚羟乙酸/磷酸三钙薄膜通过刺激周围组织形成假鞘,阻止来自腱周的粘连,且不影响肌腱正常愈合,是较理想的预防肌腱粘连材料.

骨关节炎Ⅰ号方预防氢化可的松对兔软骨细胞的损伤作用

背景:骨关节炎Ⅰ号方中的补肾活血祛风湿中药具有治疗骨关节炎、预防糖皮质激素副作用的作用.目的:建立体外兔关节软骨细胞培养体系,观察骨关节炎Ⅰ号方预防氢化可的松对软骨细胞的损伤作用.设计:完全随机设计,对照实验.单位:福建省第二人民医院风湿免疫科.材料:实验于2003-11/2004-03在福建中医学院骨伤系分子实验室完成.关节炎Ⅰ号方由仙灵脾、巴戟天、川芎、三七、祖师麻组成.用胶原酶Ⅱ消化兔关节软骨,建立软骨细胞体外培养体系,在软骨细胞培养体系中分别加入不同浓度的骨关节炎Ⅰ号方与氢化可的松的混合液,根据加入的药物浓度不同随机分成2组,一组加入1.25g/L氢化可的松和/或150g/L骨关节炎Ⅰ号方,另一组加入2.50 g/L氢化可的松和/或300 g/L骨关节炎Ⅰ号方.每组再分为4个亚组,各组再分别分为对照组、氢化可的松组、氢化可的松+关节炎Ⅰ号方组、关节炎Ⅰ号方组,每组5孔.方法:①1.25g/L氢化可的松+150g/L关节炎J号方组:每孔分别加入1.25 g/L氢化可的松和150g/L骨关节炎Ⅰ号方混合液0.1 mL.②1.25g/L氢化可的松组:每孔分别加入磷酸盐缓冲液和1.25 g/L氢化可的松的混合液0.1 mL.③150g/L骨关节炎Ⅰ号方组:每孔分别加入150g/L骨关节炎Ⅰ号方药液0.1 mL.④对照组1:每孔分别加入磷酸盐缓冲液0.1 mL.⑤2.50g/L氢化可的松+300g/L骨关节炎Ⅰ号方组:每孔分别加入2.50g/L氢化可的松和300 g/L骨关节炎Ⅰ号方的混合液0.1 mL.⑥2.50g/L氢化可的松组:每孔分别加入磷酸盐缓冲液和2.50g/L氢化可的松的混合液0.1 mL.⑦300 g/L骨关节炎Ⅰ号方组:每孔分别加入300g/L骨关节炎Ⅰ号方药液0.1 mL.⑧对照组2:每孔分别加入磷酸盐缓冲液0.1 mL.⑨上述各组加药培养24h后,用倒置显微镜观察各组软骨细胞形态变化.④采用四氮唑蓝比色法检测各孔软骨细胞的A值,以反映软骨细胞增殖情况.主要观察指标:骨关节炎Ⅰ号方与氢化可的松联合用药对兔软骨细胞增殖的影响.结果:①软骨细胞形态:倒置显微镜观察见对照组软骨细胞呈多角形或梭形贴壁生长,1.25和2.50 g/L氢化可的松浓度培养24 h的软骨细胞呈固缩或漂浮状态,各浓度氢化可的松+骨关节炎Ⅰ号方组、骨关节炎Ⅰ号方组的软骨细胞呈多角形或梭形贴壁生长与对照组无差异.②软骨细胞A值:1.25 g/L氢化可的松组明显低于对照组1(0.007 6±0.001 8,0.015 2±0.002 6,t=5.374 0,P＜0.01);1.25 g/L氢化可的松+150 g/L关节炎Ⅰ号方组和150g/L关节炎Ⅰ号方组明显高于1.25g/L氢化可的松组(0.065 6±0.016 9,0.086 6±0.019 0,t=7.630 9,9.255 9,P＜0.01);2.50 g/L氢化可的松组明显低于对照组2(0.0053±0.0014,0.0153±0.0023,t=8.304 5,P＜0.01);2.50 g/L氢化可的松+300 g/L关节炎Ⅰ号方组和300 g/L关节炎Ⅰ号方组明显高于2.50 g/L氢化可的松组(0.0858±0.015 0,0.092 6±0.016 8,t=11.948 3,11.579 4,＜0.01).结论:高浓度氢化可的松可导致软骨细胞已严重损伤或死亡,而氢化可的松加中药培养的软骨细胞生长良好,骨关节炎Ⅰ号方有预防氢化可的松对软骨细胞的损伤作用.

去细胞同种异体神经移植修复人体长段周围神经缺损

目的:探讨周围神经缺损的治疗方法,评价去细胞同种异体神经移植修复人体长段周围神经缺损的效果.方法:实验于2003-04-14/2004-05-14解放军总医院骨科完成.取正常健康捐献者的周围神经,进行化学处理,应用化学萃取法制备去细胞同种异体神经,对11例周围神经缺损的住院患者进行神经移植,修复神经缺损.分别于术后定期对患者进行感觉、运动功能检查,并行肌电图检查.结果:参与的11例患者,均获得随访,无缺失.7例患者术后功能有恢复,改善率64%(7/11),其中1例移植9 cm修复正中神经缺损的患者术后6个月,感觉与运动功能开始恢复,术后16个月,患手能够持物,感觉和肌力恢复.11例患者中6例缺损位于腕部以上的患者恢复3例,术后6个月行肌电图检测,有神经冲动穿过,改善率50%(3/6),5例缺损位于腕部以下的患者恢复4例,改善率80%(4/8).结论:应用化学去细胞神经同种异体移植可修复人体周围神经缺损,并且可以避免取自体神经的弊端.

三氧化二砷及其不同浓度对角膜基质细胞增殖和移行的影响

目的:观察不同浓度三氧化二砷对体外培养的兔角膜基质细胞增殖和移行的影响.方法:实验于2004-11/2005-04在哈尔滨医科大学肿瘤研究所完成.实验动物为健康日本大耳白兔2只,取其角膜用组织块培养法培养原代及传代得兔角膜基质细胞,将传至2～3代的兔角膜基质细胞用于实验.向实验细胞中分别加入含不同浓度(100,50,25,12.5,10,6.25,5,2.5,1.25,0.625μmo1/L)的三氧化二砷培养液,同时以加入不含三氧化二砷的培养液作为阴性对照,以加入含0.0025%丝裂霉素的培养液作为阳性对照.用细胞计数法和四甲基偶氮唑盐法检测三氧化二砷对角膜基质细胞增殖的影响,用缺损闭合法观察三氧化二砷对角膜基质细胞移行的影响.结果:实验纳入大耳白兔2只,取其4只角膜培养传至二三代的角膜基质细胞均无污染,细胞数量足够实验所需.①细胞计数法观察不同浓度的三氧化二砷对角膜基质细胞增殖的影响:低浓度的三氧化二砷(＜12.5μmol/L)对角膜基质细胞增殖无明显抑制作用,而高浓度的三氧化二砷(≥12.5μmol/L)对角膜基质细胞的增殖具有明显的抑制作用,抑制率均在50%以上,且抑制作用随浓度的增加而增强.台盼兰染色显示各组细胞存活率均在90%以上,未见细胞毒性.②四甲基偶氮唑盐法观察不同浓度的三氧化二砷对角膜基质细胞增殖的影响:四甲基偶氮唑盐法检测结果与细胞计数法基本一致,三氧化二砷对角膜基质细胞增殖的抑制率随浓度的增加逐渐增强.与阳性对照比较,给予25,50,100μmol/L三氧化二砷的角膜基质细胞在加药后6 d其增殖抑制率明显降低(56.4%,45,4%,50.2%,55.4%,P＜0.05).③三氧化二砷对角膜基质细胞移行的影响:给予低浓度的三氧化二砷(＜25μmol/L)及阴性对照药的角膜基质细胞在用药后48 h已有较多的细胞长入,4 d后完全闭合,而给予高浓度三氧化二砷的角膜基质细胞在用药后48 h只有极少数细胞长入缺损区,8 d后仍未见缺损闭合,缺损闭合的时间明显延长.结论:三氧化二砷对角膜基质细胞增殖的抑制率随浓度的增加逐渐增强,高浓度的三氧化二砷具有抑制兔角膜基质细胞增殖和移行的作用,而低浓度的三氧化二砷此种作用不明显.三氧化二砷的浓度在100μmol/L以下时,对角膜基质细胞无明显的毒性反应.

骨形成蛋白2重组腺病毒的构建对骨缺损基因治疗的价值

背景:目前,人们利用基因重组技术已经表达出人类基因重组骨形态发生蛋白2,并且在常位和异位成功地诱导出新骨.但由于重组人骨形态发生蛋白2比天然骨形态发生蛋白2的诱导成骨活性较低,且尚未找到十分理想的载体.目的:通过构建骨形成蛋白重组腺病毒,为骨缺损的基因治疗提供可行载体.设计:单一样本实验.单位:西安交通大学第一医院分子生物学实验中心.材料:PACCMV-PLPA质粒,PJM17质粒,293细胞系.方法:实验于2001-09/02-06在西安交通大学第一医院分子生物学实验中心完成.应用反转录-聚合酶链反应法克隆出骨形态发生蛋白质类2全长基因,构建重组腺病毒载体,DNA-磷酸钙共沉法将辅助质粒PJM17转染293细胞,同源重组构建出重组腺病毒.测滴度并用氯化铯梯度离心纯化备用.主要观察指标:①聚合酶链反应产物克隆结果.②PACCMV-BMP2穿梭质粒的鉴定结果.③重组腺病毒的构建结果.结果:①聚合酶链反应产物克隆结果:克隆构建的重组质粒命名为pGEM-T/hBMP2,大小为(3015+1213)bp.琼脂凝胶电泳结果显示实际值与理论值完全一致.②PACCMV-BMP2穿梭质粒的鉴定结果:质粒大小约为10 Kbp,因PACCMV-PLPA质粒多克隆位点属PUC质粒系列,故用EcoRⅠ酶切,可将重组质粒线性化,大小为10 Kbp.而EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切时,可得到8.8 Kbp和1.2 Kbp两个可见片段.③重组腺病毒的构建结果:重组病毒的鉴定应用聚合酶链反应技术,利用BMP2全长特异引物扩增出目的片段1.2 Kbp,与理论值完全一致.结论:骨形态发生蛋白2重组腺病毒的构建成功为骨缺损等疾病的基因治疗奠定了可行的载体基础.

重组人表皮生长因子对体外培养人角质细胞增殖的影响

目的:观察不同浓度条件下表皮生长因子对角质形成细胞增殖的影响,分析表皮生长因子对角质形成细胞增殖过程中有无异常影响.方法:实验于2003-09/2005-01在新疆维吾尔自治区包虫病研究所细胞室完成.实验所用细胞从手术中切取的皮片(中厚皮片)获得.采取体外角质形成细胞的原代培养技术,用浓度分别为0.001,0.01,0.1,1,10,100,500μg/L浓度的表皮生长因子干预体外培养的细胞,采用噻唑蓝法检测细胞活性.选择适浓度表皮生长因子干预的角质形成细胞,用流式细胞仪检测细胞的DNA倍体情况.结果:①角质形成细胞生长过程的观察:细胞培养3 d可见部分贴壁,内有各层角质形成细胞;细胞培养12 d可见明显的贴壁现象,有圆形或椭圆形细胞核,细胞体呈不规则形态;13 d后可见细胞膜片的形成,细胞间隙明显,细胞大部分为多角形,细胞核明显;20 d左右可见细胞膜片仍然存在,细胞形态正常,折光性好.②角质形成细胞的鉴定:胞核内可见棕黄色着色,多数可见明显的细胞核.③不同浓度表皮生长因子对人角质形成细胞增殖的影响:进入对数生长期的细胞在表皮生长因子浓度为0.01～100μg/L时,其吸光度值为0.330±0.014～0.400±0.018,此浓度下对角质形成细胞有增殖作用;浓度为0.1～1μg/L时,其吸光度值为0.386±0.043～0.428±0.024,增殖作用强;浓度为0.001或500g/L时,其吸光度值为0.344±0.013和0.251±0.025,无明显增殖作用.④培养12 d时流式细胞仪对表皮生长因子适浓度下细胞倍体含量的测定:合成前期=95.9%,大多数为二倍体;分裂前期=4.1%,为四倍体;未见非整倍体.细胞分化良好,无异常分化表现.结论:表皮生长因子浓度为0.01～100μg/L时,促角质形成细胞增殖作用明显,在促增殖范围内无致细胞染色体异常分化的现象,细胞多数为合成前期,提示此条件下角质形成细胞具有很强的增生能力.表皮生长因子浓度为500 μg/L时,对角质形成细胞有明显的抑制作用,0.001 pg/L为低有效浓度.重组表皮生长因子对细胞生长周期无影响.

异丁基壳聚糖多功能创面敷料的生物学效应

目的:观察以壳聚糖衍生物-异丁基壳聚糖为基质材料的多功能创面敷料的局部止血、镇痛、抗感染和促愈合作用.方法:实验于2003-03/2004-06在第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成.新西兰大白兔54只,Wistar大白鼠6只,昆明种小白鼠14只.采用:①兔肝叶剪损法观察该敷料的止血效果即平均止血时间.②热板法检测该敷料对小鼠的镇痛效果即涂药前、后平均舔足时间.③用家兔伤口污染模型,观察该敷料对伤口局部及全身情况的影响,以观察其局部抗菌消炎效应.④用大鼠背部切割伤模型,观察该敷料对伤口闭合指数和组织羟脯氨酸含量的影响,从而考查其对伤口愈合的作用.结果:局部止血试验:新西兰兔6只,用药组实验数据为11个,对照组实验数据为13个;局部镇痛试验:昆明种小白鼠14只,所得数据两组均为14个;局部促愈合试验:用大白鼠6只,得用药组和对照组1周的伤口闭合指数各6个,局部组织羟脯氨酸含量数据各6个;局部抗菌消炎试验:新西兰兔48只.①用药组平均止血时间明显较对照组短[(55,6±7.4),(147.9±49.9)s].②涂药前小白鼠平均舔足的时间明显较涂药后短[(19.57±3.63),(39.50±7.98)s].③兔污染伤口实验结果显示:伤后24 h,对照组体温明显高于用药组,两组白细胞变化没有明显差异:伤口局部细菌培养显示对照组菌落数明显多于用药组;用药组伤口情况明显好于对照组,在72 h,7 d时,用药组痂下无脓,有肉芽生长,而对照组痂下有大量脓,无肉芽生长出来;两组各时相点血浆肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和局部肌肉组织肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、丙二醛、髓过氧化物酶、超氧化物歧化酶含量无明显差异.④用药组1周的伤口闭合指数为(60.5±12.8)%,而对照组为(39.1±11.3)%;用药组局部组织羟脯氨酸含量为(60.5±5.4)mg/g,对照组为(17.7±4.9)mg/g.结论:异丁基壳聚糖多功能创面敷料具有明显的局部止血、镇痛、抗菌消炎和促愈合作用.

椎体压缩性骨折疼痛缓解程度与骨水泥充盈程度的关系

目的:随访进行椎体成形术治疗的骨质疏松性椎体骨折患者腰痛缓解程度,并分析与其骨水泥充盈程度的关系.方法:对2001-08/2002-12上海第二医科大学附属瑞金医院骨科行椎体成形术后20～36个月的35例骨质疏松性椎体骨折患者进行随访,了解术后不同时期患者目测类比评分变化,比较不同骨水泥充盈与疼痛缓解程度的关系以及患者的主观满意度.结果:31例患者获随访,平均随访时间26个月.①患者手术前后和随访时的目测类比评分:术前平均为8.5分,术后24 h平均为2.7分,随访时平均为3.1分,手术前与手术后及随访时比较,差异均有显著性意义(Z=4.92,4.91;P＜0.001);术后24 h与随访时比较,差异无显著性意义(Z=1.90,P=0.058).②不同骨水泥充盈与疼痛缓解程度的关系:术后CT提示骨水泥弥散差的有8例,中等的有17例,好的有6例,各组之间的目测类比评分比较,差异无显著性.③不良事件和副反应:有1例患者发生邻近椎体再骨折,没有发生由于骨水泥渗漏而造成的并发症.④患者的主观满意度:患者主观满意度为96.8%.结论:椎体成形术治疗骨质疏松性压缩性骨折的中期疗效满意;但是疼痛缓解程度和骨水泥注射后的充盈程度无密切关系,治疗中不应该把重点放在追求骨水泥的注射量.

碱性成纤维细胞生长因子基因在骨膜成骨细胞中的表达

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子基因在骨膜.成骨细胞中的表达情况,以为其基因转移在骨组织工程中的应用奠定基础.方法:实验于2003-09在广州军区总医院医学实验科完成.采用聚乙烯亚胺介导重组真核表达载体pcDNA3.1-碱性成纤维细胞生长因子经转染至原代培养的成骨细胞中,培养36 h后,采用细胞免疫组化、免疫印迹杂交、酶联免疫吸附法、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色等方法检测碱性成纤维细胞生长因子在成骨细胞中的表达情况以及其生物学活性.结果:①pcDNA3.1-碱性成纤维细胞生长因子转染的成骨细胞能分泌表达碱性成纤维细胞生长因子至细胞培养液中,表达量约为(1.56±0.08)ng/mL,高于未经转染的细胞培养液[(0.53±0.048)ng/训,(P＜0.01)].②经转染的成骨细胞的培养上清可以明显促进3T3细胞的增殖,表明成骨细胞所分泌表达的碱性成纤维细胞生长因子具有一定的生物学活性.结论:碱性成纤维细胞生长因子基因能够转移至骨膜成骨细胞中,经转染的细胞能够超表达碱性成纤维细胞生长因子.

成纤维细胞生长因子对弹性软骨细胞增殖和基质形成的影响

目的:观察成纤维细胞生长因子对软骨细胞增殖和细胞外基质合成的影响.方法:实验于2003-03/2004-12在第四军医大学口腔颌面外科实验室和南方医科大学南方医院组织工程中心完成.酶消化法从兔耳获取软骨细胞与12 g/L藻酸钠混合,细胞浓度1010 L-1,经注射器滴入125 mmol/L的氯化钙溶液,形成软骨细胞/藻酸钙凝胶微球,用含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液体外培养,培养液中分别加入0,10,50和100μg/L浓度的碱性成纤维细胞生长因子,14 d终止培养,进行生物化学分析.观察各组DNA总量、糖胺多糖总量、单位DNA的糖胺多糖含量.结果:①DNA总量:0,10,50和100μg/L成纤维细胞生长因子浓度组分别为(3.44±0.23),(4.70±0.22),(6.60±0.35)和(6.82±0.33)μg.②糖胺多糖总量:0,10,50和100μg/L成纤维细胞生长因子浓度组分别为(15.35±0.80),(20.63±0.72),(29.72±2.08)和(31.11±2.39)μg.③单位DNA的糖胺多糖含量:0,10,50和100μg/L成纤维细胞生长因子浓度组分别为(4.47±0.09),(4.39±0.13),(4.50±0.13),(4.55±0.18)g/g.结论:成纤维细胞生长因子明显促进了软骨细胞的增殖,糖胺多糖合成总量也得到明显提高,但单位DNA的糖胺多糖合成量无明显变化,表明成纤维细胞生长因子影响软骨细胞的生物学特性.

不同胚胎起源骨质贴附骨移植后宿主骨变化的计量学分析

目的:应用荧光素双标记和不脱钙骨切片,以骨计量学指标对宿主骨变化进行组织学和动态计量分析,以进一步探明不同胚胎起源骨质贴附移植后宿主骨的变化.方法:实验于2002-07/2003-03在军事医学科学院国家二级动物实验室完成.选取新西兰兔10只,分别截取5 mm×10mm大小的颅骨(膜内成骨)和髂骨(软骨成骨)各一块,植入兔口鼻部骨膜下,于术后第33,41天分别肌注四环素50 mg/(kg·次),进行荧光素双标记,术后第45天处死动物,将移植骨与宿主骨一同取下,制成5 μm的不脱钙骨切片,保留平片,其余行Giemsa和Von Kossa染色.选用类骨质宽度、骨矿化沉积率指标,对宿主骨变化进行组织学观察和计量学分析.结果:实验纳入新西兰兔10只,全部进入结果分析.①膜状骨和软骨成骨贴附移植后组织学观察:膜状骨移植区宿主骨侧可见明显的成骨细胞排列,宿主骨内及界面类骨质沉积部位较多,可见明显的荧光双标记线及标记区,荧光双标记线距宽.而软骨成骨移植区宿主骨侧可见部分成骨细胞活动,类骨质沉积及荧光标记区少,双标计线窄,增生活跃程度明显较低.②膜状骨和软骨成骨贴附移植后宿主骨区骨计量学的比较:膜状骨移植宿主骨区的骨矿化沉积率、类骨质宽度均明显优于软骨成骨移植区宿主骨区[(3.19±0.37),(2.18±0.36);(14.35±3.48),(5.92±1.68);P均＜0.01].结论:不同胚胎起源骨质移植后的宿主骨,在骨质修复再生速度与成骨量上产生了明显不同的变化,膜内成骨优于软骨成骨,提示膜状骨在口腔颌面部应用时对宿主骨有着更为明显的诱导成骨作用.

应用生物力学的方法观察十一酸睾酮对老年雄性大鼠骨的作用

目的:运用生物力学的方法,观察雄激素十一酸睾酮在动物大体内对老年大鼠骨的作用.方法:实验于2002-10在上海市伤骨科研究所完成.鼠龄23个月Wistar雄性大鼠20只,随机分为治疗组10只、空白对照组10只,另选鼠龄3个月Wistar雄性大鼠10只为青年对照组,治疗组十一酸睾酮26.7 mg/kg灌胃,1次/d给药两周,后改为维持剂量(药量减半)用药,空白对照组和青年对照组给予普通饮食.1个月后取材,并在取材前第3天、第13天行四环素标记.①取各组大鼠左侧股骨做三点抗弯实验测定大载荷、大应力、大应变、弹性模量、抗弯硬度、吸收能量.②取各组大鼠第五腰椎做椎体抗压实验测定大载荷、大应力、大应变、弹性模量、抗压硬度、吸收能量. 结果:实验大鼠30只均进入结果分析.①与空白对照组相比,股骨的大载荷、吸收能量、大应力值显著增高[治疗组:(129.08±12.36)N,(49.40±7.4)Nm,(128.47±16.73)N/mm2,青年对照组:(132.04±25.84)N,(64.27±10.73)Nmm,(145.78 ±23.54)N/mm2,空白对照组:(102.03±11.62)N,(32.00±8.50)Nmm,(107.55±17.37)N/mm2,P＜0.01],弹性模量、抗弯硬度值亦明显增加[治疗组:(4 072.1±434)mN,(214.73±40)N/mm,青年对照组:(4 318.6±201)mN,(281.17±66.85)N/mm,空白对照组:(3624.7±269)mN,(189.47±45.2)N/mm,P＜0.05],其中大载荷增加26.5%,抗弯硬度增加13.3%.②与空白对照组相比,治疗组第五椎体大载荷增加29.2%(P＜0.05),抗压硬度增加34.6%(P＜0.01),弹性模量值增加39.93%(P＜0.01),大应力值增加19.45%(P＜0.05).结论:雄激素能够提高骨的力学性能,增加骨强度.

复合降解膜对异体神经再生的影响

目的:探讨抑制结缔组织增生的复合降解膜对异体神经再生作用.方法:实验于2003-04/2004-04在沈阳医学院附属奉天医院动物实验室完成.选取SD大鼠60只随机分成干预组、对照组和正常组,每组20只.用20g/L戊巴比妥钠25 mg/kg腹腔麻醉后,将大鼠左下肢坐骨神经切除2 cm,用同种异体坐骨神经移植.干预组在神经移植处置入包裹含有抑制胶原纤维合成试剂的降解膜;对照组在神经移植处置入不含试剂的降解膜;正常组在神经移植处不放任何膜.术后180 d取材标本制作,并测定各组大鼠神经植入处有髓神经纤维数量、直径,神经近端缝合处胶原纤维数量、羟脯氨酸含量,各组大鼠坐骨神经支配腓肠肌的潜伏期及波幅等.结果:60只实验动物均纳入结果分析.再生坐骨神经纤维的数量、直径以及电生理的潜伏期和波幅等指标上,均明显较不置药的对照组和正常组的多、粗、恢复快、短而大.干预组和对照组胶原纤维数量分别为(521±135,1 020士133)条,两组比较有显著性差异(t=-11.833,P＜0.05);干预组羟脯氨酸含量较正常组低[(13.13±3.36,21.72±2.85)ug/g,(t=-5.374,P＜0.05)];对照组羟氨酸含量(20.65±2.83)ug/g,与正常组(21.72±2.85)ug/g比较差异无显著性意义(t=-0.798,P＞0.05).维生素正常浓度明显较对照组和正常组低.干预组术后潜伏期明显小于对照组与正常组(P＜0.05),波幅明显大于对照组和正常组(P＜0.005).结论:抑制结缔组织增生的复合降解膜有提高同种异体神经移植的再生作用.

核因子-κB与细胞间黏附分子-1在角膜移植排斥反应中的表达及环孢素A对两者表达的影响

目的:探讨核因子-κB在角膜移植排斥反应中的作用,为进一步研究角膜移植排斥反应发病机制及治疗提供新的思路.方法:实验于2004-12/2005-02在南方医科大学珠江医院眼科完成.实验分组:同基因移植组Wistar大鼠5只为供者,Wistar大鼠10只为受者;同种异体移植组Wistar大鼠5只为供者,SD大鼠10只为受者.同种异体移植+环孢素A治疗组Wistar大鼠5只为供者,SD大鼠10只为受者.建立大鼠穿透性角膜移植动物模型,用免疫组织化学染色法检测角膜移植术后植片中核因子-κB和细胞间黏附分子-1表达,显微镜下记数植片中央区400倍视野中阳性细胞数的平均值,并以植片排斥反应指数及病理学表现作参照.结果:纳入实验大鼠30只,均进入结果分析.①同基因移植组角膜植片中的角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞有核因子-κB和细胞间黏附分子-1的微弱表达,表达强度分别为3.16±1.25,2.83±1.54;同种异体移植组角膜上皮细胞、内皮细胞、基质层细胞及新生血管内皮细胞核因子-κB和细胞间黏附分子-1表达增强,分别为16.77±2.76,13.63±1.93;同种异体移植环孢素A治疗组角膜上皮细胞、内皮细胞、基质层细胞及新生血管内皮细胞有核因子-κB和细胞间黏附分子-1的弱表达,分别为6.77±1.86,4.57±1.91.②各组间核因子-κB和细胞间黏附分子-1的表达强度有显著性差异(P＜0.01).③对比观察发现,各组角膜植片中NF-κB和细胞间黏附分子-1的表达部位和强度相似,相关性分析核因子-κB与细胞间黏附分子-1的表达强度呈正相关(r=0.875,P＜0.01),且核因子-κB的表达与排斥反应指数也具有明显的正相关性(r=0.829,P＜0.01).结论:核因子-κB可能通过调控细胞间黏附分子-1等基因的表达,参与角膜移植排斥反应的发生,在角膜移植免疫中起着中心调控者的作用.而免疫抑制剂GsA通过减弱核因子-κB核转位和发挥活性,抑制排斥反应.

缬沙坦对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响

目的:观察特异性血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响.方法:①实验于2004-06/2004-10在哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心完成.取Wistar成年大鼠150只,雌雄不拘.②大鼠自体移植静脉模型的建立:将大鼠麻醉后,显露并游离左颈总动脉及左颈外静脉长约1.5 cm,游离并切取静脉长约1.0 cm,肝素生理盐水冲洗,阻断并切取动脉0.8 cm,将静脉端吻合于左颈总动脉.③实验过程中有4只大鼠因出血而死亡,有6只大鼠因移植静脉阻塞而不符合模型要求,随机将剩余140只大鼠分为2组,缬沙坦组和对照组,每组70只.缬沙坦组于造模前2天开始用缬沙坦灌胃[3 mg/(kg·d)],对照组造模前2天开始用等量生理盐水灌胃,1次/d,直至取材.两组动物分别于造模后1,3d及1,2,4,6,8周取材备检,每组每个时间点10只.④采用苏木精-伊红染色,应用计算机图像分析仪计算新生内膜面积/中膜面积表示内膜增生程度;应用免疫组化方法检测增殖细胞核抗原和p-选择素的表达.光镜下观察,400倍高倍镜下,随机选取4个视野,计数单位视野阳性细胞数占总细胞数百分比,并取平均值.⑤两组间均数比较采用t检验.结果:实验过程中有4只大鼠因出血而死亡,有6只大鼠因移植静脉阻塞而不符合模型要求,终进入结果分析140只,缬沙坦组、对照组各70只.①移植静脉新生内膜面积与中膜面积比:造模后2,4,6,8周缬沙坦组明显低于对照组(0.2752±0.0061,0.783 6±0.005 8,0.880 9±0.005 0,0.760 9±0.005 3;0.699 9 ±0.004 8,1.613 1±0.005 6,1.933 9±0.007 1,1.789 7±0.009 1,t=173.35,325.29,382.91,308.95,P＜0.01).②移植静脉增殖细胞核抗原阳性细胞百分比:造模后1,2,4,6周缬沙坦组明显低于对照组[(26.88±6.28)%,(30.45±6.80)%,(16.20±3.57)%,(5.37±1.34)%;(35.33±8.34)%,(40.49±10.04)%,(20.87 ±4.51)%(9.29±2.44)%,t=2.56,2.62,2.57,4.45,P＜0.01].③移植静脉p-选择素阳性细胞百分比:造模后1,2,4,6,8周缬沙坦组明显低于对照组[(6.41±2.61)%,(12.82±3.71)%,(23.46 ±7.75)%,(30.33±7.78)%,(18.61±5.90)%;(9.88±3.05)%,(18.41 ±5.33)%,(34.61±11.19)%,(40.11±7.36)%,(28.71±5.58)%,t=2.73,2.73,2.59,2.88,3.93,P＜0.01].结论:自体静脉移植后,移植静脉发生了内膜增生性变化;缬沙坦可抑制静脉移植术后增殖细胞核抗原及p-选择素的表达,从而减少白细胞与血管内皮细胞间的黏附,达到抑制内膜增生的目的.

与内皮抑制素相互作用的蛋白及其抑制血管生成作用的分子机制

目的:探讨与内皮抑制素相互作用的蛋白,阐明其抑制血管生成作用的分子机制.方法:实验于2002-01/2004-12在解放军总医院呼吸科实验室、军事医学科学院放射医学和生物工程研究所实验室完成.应用酵母双杂交系统3,以内皮抑制素为诱饵,筛选人肝cDNA文库,寻找与之相互作用的蛋白.再利用一对一酵母回复性杂交、β-GAL实验和生物信息学分析技术筛除假阳性克隆.结果:成功构建稳定表达内皮抑制素基因的载体;酵母双杂交共获得281个克隆,经验证,6个为阳性克隆,测序发现其中一个克隆为未知序列;FAST CAT试验发现阳性克隆中4个克隆可明显的与内皮抑制素相互作用.结论:6个阳性克隆表达的蛋白可能能与内皮抑制素相互作用,并不同程度的参与了内皮抑制素调节的血管生成过程.

自体骨髓干细胞移植治疗慢性下肢缺血94例不同病变分期患者的效果比较

目的:观察自体骨髓干细胞移植对慢性下肢缺血间歇性跛行期、静息痛期、溃疡期和坏疽期患者治疗效果的比较.方法:选取2003-03/2005-02首都医科大学宣武医院收治慢性下肢缺血患者94例(102条患肢),男59例,女35例,年龄平均69.5岁.病因:糖尿病性下肢缺血90条患肢(84例患者),单纯动脉硬化闭塞症7条患肢(6例患者),血栓闭塞性脉管炎5条下肢(4例患者).间歇性跛行期13条患肢(12例患者);静息痛期41条患肢(38例患者);组织缺损期包括溃疡期和坏疽期,分别有26条患肢(24例患者)和22条患肢(20例患者).①全部患者均行自体骨髓干细胞移植,采用下肢局部肌肉注射、下肢动脉腔内注射、下肢局部肌肉注射和动脉腔内注射同时进行3种方法.下肢局部肌肉注射是将经过分离、提纯的自体骨髓干细胞,采用多点方法注射在患肢缺血部位的肌肉内;下肢动脉腔内注射是将骨髓干细胞注射在下肢动脉腔内,注射时要用球囊导管阻断下肢动脉闭塞处的近端血流,时间3～5 min;下肢局部肌肉注射并动脉腔内注射的方法是同时采用前2种方法进行移植.②主要临床症状与体征主观指标的评估:间歇性跛行期根据在正常速度下行走的距离分为5级(0级:行走≥500 m,无疼痛;1级:行走400～499 m,有疼痛;2级:行走300～399 m,有疼痛;3级:行走100～299 m,有疼痛;4级:静息痛,无法行走或行走＜100 m,有疼痛).静息痛期根据疼痛与否及疼痛程度分为5级(0级:无疼痛;1级:偶有疼痛,被问及能回忆起;2级:疼痛经常出现但能耐受,不需或偶用一般止痛剂;3级:经常使用一般止痛剂;4级:因疼痛影响睡眠,一般止痛剂难以缓解).患肢冷感根据患肢有无冷感及冷感的程度分为5级(0级:无冷感;1级:受累肢体偶有发凉、怕冷的感觉;2级:受累肢体经常有发凉、怕冷的感觉;3级:受累肢体明显有冷、凉的感觉,采用局部保温措施后症状能得到一定程度的缓解;4级:受累肢体明显有冷、凉的感觉,采用局部保温措施后症状仍无明显改善).③主要临床症状与体征客观指标的评估:新生侧支血管评估根据其数量分为4级(0级:无新生侧支血管;1级:少许新生侧支血管;2级:中量新生侧支血管;3级:丰富新生侧支血管).保肢率以术后2个月为基准,观查各期的截肢率和保肢率.④疗效评估:患肢疼痛、冷感和间歇性跛行未减轻为无变化,减轻1级为改善,减轻2或3级为明显改善,达到0级为症状消失;创面愈合并且疼痛消失为治愈,创面明显缩小为明显改善,创面缩小为改善,创面及疼痛无变化或扩大为无效.结果:按意向处理分析,纳入实验的94例患者102条患肢全部进入结果分析.①不同患病期的下肢缺血总有效率比较:间歇性跛行期100%,静息痛期92.7%,溃疡期83.3%,坏疽期59.1%.前3期比较基本相近(x2=1.01～2.23,P＞0.05);静息痛期与溃疡期比较仍无差异(x2=1.11,P＞0.05);前3期均显著高于坏疽期(x2=10.48,P＜0.01;x2=5.18,P＜0.05;x2=3.93,P＜0.05).②不同患病期的踝肱指数变化:间歇性跛行期、静息痛期、溃疡期、坏疽期踝肱指数增加分别为46.2%,31.7%,34.6%和27.3%,无明显差异.③不同患病期保肢率:间歇性跛行期100%,静息痛期97.6%,溃疡期88.5%,坏疽期59.1%.前3期比较基本相近(x2=0.32～0.41,P＞0.05);静息痛期与溃疡期比较也基本相近(x2=2.35,P＞0.05);前3期均显著高于坏疽期(x2=15.87,P＜0.01;x2=5.18,P＜0.05;X2=5.48,P＜0.05).④不同患病期经皮氧分压增加与血管生成情况:经皮氧分压测定各期之间无明显差异.下肢动脉造影显示,有丰富血管生成的百分比各期之间也没有明显差异.结论:自体骨髓干细胞下肢局部肌肉注射移植治疗下肢缺血患者,在病变的早、中阶段和单纯溃疡阶段,其有效率和保肢率均无明显差异,但以上3阶段的有效率和保肢率均明显高于晚期的有组织坏疽阶段,充分说明自体骨髓干细胞移植特别适合下肢缺血患者病变的早期与中期,对于缺血晚期特别是患肢存在组织坏疽者的治疗效果仍有待进一步提高.

软脑膜细胞诱导神经干细胞高比例分化为神经元的效应

目的:观察软脑膜细胞对神经干细胞分化的影响.方法:实验于2004年在上海体育学院运动科学系实验中心完成.从脑组织分别分离和培养软脑膜细胞和神经干细胞,并进行两种细胞的共培养,同时按照免疫细胞化学染色方法,观察和鉴别神经干细胞在软脑膜细胞提供的微环境下的分化状态.结果:自然分化条件下,微管相关蛋白-2ab阳性的神经元、胶质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和2,3-环核苷酸磷酸二酯酶阳性的寡突胶质细胞在神经干细胞后代中所占比例分别为(14.6±4.5)%,(11.3±3.8)%和(73.6±18.7)%.而在共培养条件下,神经元、星型胶质细胞和寡突胶质细胞在神经干细胞后代中所占比例分别为(40.5±15.8)%,(44.6±16.7)%和(15.3±4.1)%.结论:软脑膜细胞可诱导神经干细胞高比例分化为微管相关蛋白-2ab阳性的神经元.

经冠状动脉移植自体骨髓单个核细胞用于治疗心肌梗死后的心力衰竭

目的:观察经冠状动脉直接注射进行自体骨髓单个核细胞移植时细胞能否进入心肌组织并有效改善心肌梗死后的心脏功能.方法:成年犬24只,随机分为对照组与移植组,移植组于移植前一天抽取骨髓液分离骨髓单个核细胞(数量约为2×108).结扎冠状动脉左前降支后,移植组于冠状动脉内注射骨髓单个核细胞悬液,对照组注射培养基.6周后处死动物,比较其心肌梗死面积、瘢痕区毛细血管数量、超声心动图指标及血流动力学指标的变化.结果:对照组和移植组各死亡4只犬,分别有8只犬进入结果分析.①各组犬心脏标本病理研究结果:骨髓单个核细胞经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性率约为50%;移植6周后于梗死区的心肌组织内能够检测到5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记阳性的细胞;移植组的梗死区面积和梗死范围比对照组分别下降了30.9%和35.0%,但无显著性差别(P均＞0.05);瘢痕区每个高倍视野(0.2 mm2)的毛细血管数量,移植组为5.33±0.58,明显高于对照组2.03±0.46(P＜0.01).②血流动力学指标的变化:移植组与对照组相比,6周时左室内压大上升速率、大下降速率及心输出量均显著上升[(3 039±1 164)比(1 569±618)mm Hg/s,＜0.01;(2951±793)比(1465±647)mmHg/s,P＜0.01;(1.88±0.33)比(1.41±0.29)L/min,P＜0.05].③超声心动图心功能指标的变化:移植组左室射血分数明显高于对照组(46.01%,35.28%,P＜0.05).④不良事件和副反应:在实验中仅在移植组1例实验犬的细胞注射部位观察发现一炎性包块,移植后6周时观察未见明确的恶性心律失常出现及肿瘤组织形成.结论:经冠状动脉直接注射进行骨髓单个核细胞移植可行且安全,它能够促进梗死区的新血管生成并有效改善心肌梗死后的心脏功能.

骨髓源性神经干细胞周围神经移植的实验

背景:由于周围神经只是神经元细胞的轴突,有关神经干细胞的研究几乎都集中在神经元细胞上,因此,关于周围神经修复的研究可以借鉴神经干细胞研究的某些经验.目的:观察自体骨髓源性神经干细胞于周围神经损伤区移植后周围神经修复情况,以及所移植神经干细胞能否在周围神经损伤区以分化神经元的形式存活并迁移到脊髓.设计:观察对比实验.单位:南方医科大学珠江医院神经医学研究所.材料:清洁级新西兰大白兔8只,体质量1.5～2.5 kg,雌雄不拘.方法:实验于2004-04/10在南方医科大学珠江医院神经医学研究所完成.①取新西兰大白兔骨髓基质细胞体外培养及诱导分化为神经干细胞.②采用以溴脱氧尿嘧啶核苷标记细胞和免疫细胞化学SABC法检测观察培养细胞.③制备兔坐骨神经损伤模型,随机选择一侧坐骨神经损伤区为移植侧,注入生理盐水、胶原基质蛋白及细胞包埋液至0.01 mL(含干细胞1×1010L-1);另外一侧为对照侧,注入胶原基质蛋白悬液0.01 mL.移植后3个月灌注固定,行自体周围神经损伤区移植;移植区、脊髓区、对侧损伤区和正常神经区取材观察.主要观察指标:神经干细胞移植区、脊髓区、对侧损伤未移植区神经纤维形态及神经元细胞.结果:移植区生长的神经纤维密度及连续性明显比对侧未移植区高,光镜下可见较多的许旺细胞;放大至400倍视野下,还可见有髓神经纤维的郎飞氏结;神经纤维间隙也可见有黏液基质,并有少数成纤维细胞;移植区、脊髓区和对侧未移植坐骨神经损伤区均未见有神经元样细胞存在.结论:自体骨髓源性神经干细胞周围神经缺损区移植有利于神经纤维的修复,不能在周围神经移植区、脊髓区和对侧缺损对照区以神经元的形式存活.

成年大鼠脑损伤后神经前体细胞的增殖及迁移

背景:成年哺乳类动物中枢神经系统存有神经前体细胞,其基本生物学特性主要包括多向细胞分化和维持自身数量稳定.目的:观察中枢神经系统损伤后神经前体细胞增殖和迁移的反应过程,探讨神经前体细胞在中枢神经系统损伤修复中的作用,设计:随机对照实验.单位:北京市神经外科研究所病理生理研究室.材料:实验在北京市神经外科研究所病理生理研究室完成.选择成年Wistar大鼠67只,随机分为正常对照组7只,损伤后1,3,7,14,30 d组,每个损伤组12只.以上每个损伤组再随机分为人工脑脊液组2只,碱性成纤维细胞生长因子组5只和神经营养因子-3组5只.方法:各损伤组制作液压冲击性脑损伤模型,正常对照组仅开颅,不致伤.各损伤组每次腹腔内注射BrdU 50 mg/kg,处死前2 h注入后一次,其中损伤后1 d和3 d组每天注入3次,损伤后7 d和14 d组每天注入1次.碱性成纤维细胞生长因子组每日灌注碱性成纤维细胞生长因子总量360 ng,神经营养因子-3组每日灌注神经营养因子-3总量240ng,人工脑脊液组每日灌注液中不含碱性成纤维细胞生长因子和神经营养因子-3,灌注4 μL.免疫组织化学方法动态检测各组大鼠脑组织中Nestin和BrdU的表达.BrdU标记方法确定增殖的神经前体细胞;Nestin的表达用于确定神经前体细胞. 主要观察指标:Brdu,GFAP+/Brdu+和GFAP-/Brdu+在各组大鼠脑损伤不同时相中的表达.结果:67只大鼠均进入结果分析.①与正常对照组相比较,伤侧皮质、海马及室下区的Nestin阳性细胞数于伤后1 d明显增多[(3.1±1.1),0个/视野;(5.5 ±0.9),(1.3 ±0.8)个/视野;(8.1±0.9),(2.3±0.8)个/视野,P＜0.05],7 d达高峰[(7.5±1.2),(10.2±1.5),(13.6±1.2)个/视野],30 d消失[0,(1.2±0.9),(2.1±0.8)个/视野].②伤侧皮质、海马及室下区的BrdU阳性细胞数于伤后3 d达高峰[(12.6±1.5),(9.9±1.1),(13.4±1.0)个/视野],而7 d以后逐渐减少.③室下区BrdU阳性细胞及Nestin阳性细胞经胼胝体向对侧迁移.结论:液压冲击性脑损伤可激发成年大鼠脑皮质、海马及室下区神经前体细胞增殖及迁移,其中Nestin阳性细胞数于伤后7 d多,BrdU阳性细胞数于伤后3 d多.

幼龄成骨细胞移植促进骨质疏松性骨折愈合中不同类型一氧化氮合酶的动态表达

目的:追踪观察移植细胞在骨折愈合不同时间点的神经型一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合酶与内皮型一氧化氮合酶动态表达的生物学意义.方法:实验于1999-01/2004-02在中山大学动物试验中心、中山大学病理教研室完成、中山大学肿瘤防治中心完成.选择SD清洁级大鼠96只,按配对原则分为实验组48只,对照组48只;SD清洁级乳鼠20只进行成骨细胞原代培养.建立SD大鼠老龄骨质疏松骨折的动物模型,实验组将SD乳鼠颅骨体外培养的成骨细胞移植到SD雌性大鼠骨质疏松性骨折部位,对照组注入等量无血清培养液.手术后3,7,10,14,21,28,56,84 d处死,每组每个时间点6只.用免疫组化检测骨折愈合不同时相的标本诱导型一氧化氮合酶、内皮型一氧化氮合酶和神经元型一氧化氮合酶的动态表达情况.结暴:96只大鼠均进入结果分析.实验组:诱导型一氧化氮合酶在3 d左右可见较多阳性表达的细胞,7 d有表达高峰.内皮型一氧化氮合酶在3 d左右可见少量阳性细胞,14 d有表达高峰.神经元型一氧化氮合酶在10 d左右可见少量阳性细胞,14～21 d表达稍有增高,整个实验过程中神经元型一氧化氮合酶表达较弱,表达高峰不明显.而对照组诱导型一氧化氮合酶、内皮型一氧化氮合酶均有较弱表达,表达峰低平,而神经元型一氧化氮合酶表达很弱,未见明显表达高峰.结论:诱导型一氧化氮合酶、内皮型一氧化氮合酶在成骨细胞移植促进老年骨质疏松性骨折愈合的表达具有时效性,且表达的定位细胞不同,表达的量有差别,提示骨折部位一氧化氮合酶的释放可能对促进骨质疏松性骨折愈合有意义.神经元型一氧化氮合酶在成骨细胞移植促进老年骨质疏松性骨折愈合过程中的作用不明显.

体外培养骨髓基质细胞增殖和分化的相互关系

目的:建立一种简单可靠的骨髓基质细胞向成骨细胞转化的体外培养方法,探讨骨髓基质干细胞增殖和分化的相互关系.方法:实验于2003-02/12在新疆医科大学第1附属医院包虫病临床研究所细胞室完成.将兔骨髓基质细胞悬液进行体外培养,传代培养后分组:①普通培养基组传代后仍使用普通培养基培养,每3天换液1次.②条件培养基组,分5种情况,在普通培养基中培养至第3,10,20代后即分别使用条件培养基(Dulbecco's改良的Eagle's培养基中加入地塞米松10-7 mmol/L,p-甘油磷酸钠10 mmol/L,维生素C 50 mg/L)持续培养30 d,每3天换液1次;传代后使用条件培养基持续培养30 d,每3天换液1次;传代后使用条件培养基持续培养30 d,每4天传代1次.形态学观察采用倒置显微镜;碱性磷酸酶染色采用偶氮偶联法;观察钙结节形成采用Von kossa's染色.结果:①各组细胞形态学观察结果:普通培养基组在形态上与条件培养基组细胞无明显差别.②各组细胞钙结节和碱性磷酸酶染色结果:普通培养基培养至第3,10,20代后用条件培养基及传代后用条件培养基(每3天换液)组细胞碱性磷酸酶阳性率达80%以上,表现为成骨细胞形态并形成钙结节,Von kossa's染色阳性;普通培养基组及传代后用条件培养基(每4天换液)组细胞的碱性磷酸酶染色为阴性,未能形成钙结节,Von kossa's染色阴性.结论:①贴壁筛选法是一种简单可靠的分离骨髓基质细胞的方法.②骨髓基质细胞的分化和增殖是两个对立的状态.

等高投影法辅助矫正颌面的不对称畸形

目的:建立一套简单实用的面部不对称畸形计算机化三维测量和实体模型制作手术预测分析系统.方法:实验于2004-03/2005-01在第三军医大学大坪医院野战外科研究所口腔科实验室完成.利用等高线投影仪获取面部正位等高云纹图,将图像资料输入计算机,用专门软件将图像转化为等高线图,利用正中垂线做镜像处理,进一步分析后,输出图样,直接进行植入体的制作.结果:建立了一套快速经济实用的面部不对称畸形术前预测系统,舍去面模制作,制作的缺损区植入体十分接近与健面侧对称的效果.结论:该方法能够忠实地反映颜面局部三维轮廓,在此基础上获得面部两侧形态差的实体模型,具有操作简单、制作迅捷、经济实用的特点.

植入人工腰椎间盘后小关节应力分布的有限元分析

背景:目前所使用的人工椎间盘结构、材料特性及生物学特性等与正常生理的椎间盘有着很大区别,因此,人工椎间盘植入后相应脊柱节段的应力传导将发生一定的变化.目的:通过三维有限元的方法研究正常椎间盘、髓核摘除、人工腰椎间盘三组小关节的应力分布,探讨人工腰椎间盘植入对小关节应力分布的影响.设计:观察对比实验.单位:中山大学附属第三医院骨科、附属第二医院骨科及南方医科大学生物力学实验室.对象:以健康人意外死亡的无任何脊柱疾患的脊柱标本(家属志愿捐献)建立起脊柱运动节段的有关正常椎间盘、人工椎间盘、髓核摘除的三种三维有限元模型作为实验对象.方法:利用有限元软件MSC.MARK,建立正常椎间盘模型,高度为10.00 mm,横截面积1 300.00 mm2,髓核横截面积495.80 mm2;髓核摘除模型,将髓核内压取值为零;人工腰椎间盘及L4-5运动节段的三维模型,小关节高度10.53mm,宽度13.37mm,关节面面积135.00mm2.然后模拟腰椎节段的运动,进行小关节应力分布的比较研究.主要观察指标:上述三种椎间盘的运动节段模型在6种运动状态下小关节应力大小的比较.结果:髓核摘除组小关节的上边缘部、后中部、下边缘部和前中部在前屈、后伸、压缩、侧屈、旋转状态应力大,人工腰椎间盘组的小关节的应力比正常椎间盘高,但明显小于髓核摘除组,但正中部在旋转状态下,人工腰椎间盘小关节的中心部位承受的应力大.结论:人工腰椎间盘植入后与髓核摘除组相比可降低小关节的应力,但仍高于正常的腰椎间盘组;人工腰椎间盘组的抗旋转能力明显低于正常腰椎间盘组和髓核摘除术后组,由此可见,目前的人工腰椎间盘具有腰椎间盘大部分的力学功能,与真正的腰椎间盘仍有差别.

高分子聚乙烯颈椎融合器在山羊体内的应用

背景:颈椎病手术中常用钛合金颈椎融合器,但其出现下沉等情况常影响疗效.目的:观察自制高分子聚乙烯颈椎融合器在动物体内应用后的生物相容性和稳定性.设计:随机分组,观察对比实验.单位:郑州大学动物实验中心.材料:雌性未孕山羊20只,年龄在1.1～1.6岁.方法:实验于2001-06/11在郑州大学动物实验中心完成.①将山羊随机分为实验组10只,对照组10只.②实验组植入自制颈椎融合器,内填塞自体松质骨,对照组植入自体髂骨块.③6周后两组山羊分别摄X射线片观察椎间隙高度改变;并在麻醉状态下处死动物,将部分颈椎标本置于YJ-14生物力学试验机上测试抗压缩力、椎间隙高度及做病理学观察.主要观察指标:①两组抗压缩力测试及颈椎椎间隙的高度变化.②两组椎间融合处组织病理学观察结果.结果:①两组抗压缩力测试及颈椎椎间隙的高度变化:实验组压缩载荷显著大于对照组[(358.64±15.63),(268.82±11.36)N,P＜0.05];两组相比椎间隙高度差异无统计学意义(P＞0.05).②两组椎间融合处组织病理学观察结果:实验组融合器周围组织切片有大量骨母细胞生长,与对照组无明显差别.结论:自制颈椎融合器具有很强的支撑力和良好的稳定性,可起到稳定颈椎间隙高度的作用.

应用三维有限元建立下颌第一磨牙模型的生物力学特征

目的:建立下颌第一磨牙的三维有限元模型,为下颌第一磨牙的生物力学研究提供一个数字模型.方法:实验于2004-04/12完成.CT扫描在第四军医大学西京医院放射科进行,三维有限元模型的建立在西安理工大学理学院应用数学系实验室进行,样本取自第四军医大学口腔医院牙体科教学组.选取中国人标准形态的右侧下颌第一磨牙为样本,螺旋CT扫描正常下颌骨得到下颌第一磨牙的24副断层图像,将图像在计算机上进行处理得到下颌第一磨牙的三维有限元模型.结果:建立的有限元模型包括牙齿、牙槽骨、牙周膜在内,共4862个节点,4 051个单元.结论:该模型可满足对该下颌第一磨牙进行牙体修复时的各种力学分析.

干细胞的生物学特征研究

中国组织工程研究专家们认知的人体组织器官的"克隆"工程