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骨髓异常增生综合征的血液病理学诊断
骨髓异常增生综合征（MDS）是一组异质性克隆干细胞疾病，其特征为无效血细胞生成，但关于其中造血祖细胞成分中肿瘤克隆的确切来源尚不清楚。其肿瘤性改变及恶性转化也许早在髓样干细胞水平业已发生，造血细胞具有经干细胞水平而达到成熟的能力，但却呈现成熟障碍及功能缺陷。因为异常的和正常的干细胞同时具有活性，故两者均能造血。然而随着疾病的进展，肿瘤克隆乃处于主要地位。形态上，发育不良的改变涉及骨髓内一个或多个造血细胞系列，表现为外周血像有质和量的异常。成熟血细胞形成的减少乃其前级细胞凋亡明显增加的表现，
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骨髓的磁共振成像
磁共振成像已广泛用于骨髓各种病变如感染、水肿、缺血坏死、代谢性疾病、造血系统疾病等的诊断和监测。近年来已越来越注重侵犯骨髓的肿瘤性疾病的研究。正常骨髓的功能解剖 骨髓是存在人类骨骼中较大并重要的器官，它的主要功能是持续供应红细胞、白细胞及血小板，以适应身体对氧、免疫及抗凝的需要。骨髓的细胞包括各发展阶段的红细胞、白细胞及脂肪细胞、网状细胞。造血细胞尽管在生理意义上很重要，但在骨髓成像中的作用却次于脂肪细胞。
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P-糖蛋白与环孢素A的药动学
MDR（多药耐药）基因及其编码的P-糖蛋白与多重耐药及抗性肿瘤细胞发生发展有关，P-糖蛋白是一种ATP-依赖泵，主要的生理功能是减少细胞内药物蓄积，增加抗性肿瘤细胞的数目［1］。 随着对P-糖蛋白其他多种生理功能的研究，P-糖蛋白在药动学及药效学方面的调节作用得到关注。本文综述P-糖蛋白对免疫抑制剂环孢素A药动学方面的影响。1 P-糖蛋白的生理功能 P-糖蛋白在正常组织中均有表达，分布在消化道、肾、血脑屏障、睾丸、胎盘、造血细胞等，主要功能是分泌外源性或排泄内源性的有害物质。但新研究表明mdr-基因敲除小鼠并不表现出生长或发育缺陷，然而这种小鼠对P-糖蛋白底物的毒性非常敏感，且不能分泌或排泄毒性物质［2］。由于P-糖蛋白在正常组织中均有表达，故采用P-糖蛋白抑制剂阻断其泵的外排功能，可导致排泄途径不畅，继而导致细胞毒性物质在组织浓度的增加［3］。通常P-糖蛋白抑制剂与P-糖蛋白底物有很多相似之处，自身也可作为P-糖蛋白底物。维拉帕米和环孢素就是两个典型的P-糖蛋白抑制剂。
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当归注射液对免疫诱导再生障碍性贫血小鼠骨髓细胞周期蛋白D2表达的影响
目的:探讨当归注射液对免疫诱导再生障碍性贫血(AA)小鼠骨髓有核细胞增殖周期及其细胞周期蛋白D2表达的影响.方法: 雌性Balb/c小鼠,随机分为3组:①正常对照组:未经特殊处理.②模型对照组:经60Co 6Gyγ-射线亚致死量全身照射,4 h内由尾静脉输入取自DBA/2小鼠胸腺、淋巴结混合细胞,制成AA模型,于制模当天即给予腹腔注射无菌生理盐水,每天10 ml·kg-1,连续12 d.③当归注射液组:每天予当归注射液10 ml·kg-1,腹腔注射,连续12 d.于第12 d每只小鼠称重后,采集尾静脉血测外周血白细胞计数,后断颈处死小鼠,取出双侧尺骨及股骨,冲出骨髓单个核细胞,计数.并行组织学切片, 粒单系祖细胞培养及骨髓有核细胞G0/G1期细胞百分率及细胞周期蛋白D2的检测.结果:与正常对照组比较,模型对照组造血细胞明显减少,粒单系祖细胞计数明显减低,骨髓有核细胞G0/G1期细胞百分率明显增加,而细胞周期蛋白D2表达水平明显降低,当归注射液组能增加骨髓单个核细胞计数及粒单系祖细胞计数,明显降低G0/G1期细胞百分率,提高细胞周期蛋白D2的表达水平.结论:当归注射液可能通过刺激细胞周期蛋白D2的表达促进造血细胞的增殖.
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基因修饰造血细胞移植后重建免疫功能的实验研究
目的:探讨mFasL基因转移造血细胞移植后,受者免疫功能的重建情况.方法:采用脂质体法将FasL-cDNA转入BALB/C鼠造血细胞,体外与BAC鼠骨髓移植物混合培养后输注给经致死量照射的BALB/C鼠,通过观察死亡率、存活受者混合淋巴细胞反应,以了解移植后免疫功能的重建.结果:未经骨髓移植组于1周内全部死亡;未转基因骨髓移植组60 d 存活率为30%,转基因组60 d 存活率为80%;存活受者淋巴细胞对刺激原均表现有增殖反应.结论:mFasL-cDNA基因转移的造血细胞能成功地重建免疫功能.
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当归注射液对环磷酰胺损伤小鼠骨髓细胞组织形态及超微结构的保护作用
目的 探讨当归注射液对环磷酰胺损伤小鼠骨髓细胞组织形态及超微结构的保护作用.方法 将30只Balb/c小鼠随机分为正常组、模型组和治疗组.于第7天断颈处死小鼠,取出尺骨和股骨,计数骨髓单个核细胞,并行尺骨组织学切片和超微结构观察.结果 与正常组比较,模型组骨髓单个核细胞明显减少(P＜0.01);而治疗组与模型组比较,骨髓单个核细胞明显增多(P＜0.01).骨髓超微结构观察显示模型组线粒体和内质网数量减少且明显受损,血窦减少、窦壁断裂.治疗组线粒体、内质网和血窦数量增加,形态基本正常.结论 当归注射液能通过促进骨髓造血细胞增生,改善骨髓微环境而对受环磷酰胺损伤的小鼠进行保护.
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脐带间充质干细胞支持脐血单个核细胞冻存复苏后的体外生长
目的:研究人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)对冻存复苏后脐血单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)体外生长的支持作用,以提高冷冻损伤后的造血细胞在体外的生存率.方法:用组织块培养法分离获得hUC-MSC,流式细胞仪检测其表面分子并诱导分化进行鉴定.分两组培养冻存复苏后的脐血MNCs:一组以hUC-MSC为滋养层共培养,另一组单独培养.光镜下观察两组MNCs密度.培养第10天,流式细胞仪检测两组造血细胞的百分比,并计数MNCs总数和造血细胞数进行对比.结果:成功分离培养获得hUC-MSC,符合各项鉴定标准.共培养组MNCs总数、CD45、CD14及CD19阳性造血细胞数均明显多于单培养组.结论:hUC-MSC可有效支持冻存复苏后脐血MNCs的体外生长.
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干细胞和新技术革命
1 干细胞概念的来源和变迁Regawd在100多年前首先提出了干细胞这一概念[1][2].同时,由于显微镜的发明和应用,可以使人们直接在显微镜下观察到血液是由红细胞、白细胞和血小板组成.血液学家关于这些血细胞的起源众说纷纭.1901年,Maximov提出了造血的一元论.此学说得到了Pappenheir、Mackchmob、Ferratta的支持,并由Mackchmob原则上确定下来,认为一切血细胞起源于共同原始的造血细胞,称为原血细胞.这种细胞由固定的原网细胞或网状内皮系统产生,它是多潜能的细胞,能变成向一个方向发育的干细胞.
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不同造血微环境对诱导人胚胎干细胞向造血细胞分化的影响
目的:通过观察人卵黄囊基质细胞、人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞对人胚胎干细胞向造血细胞分化诱导效率,探讨不同造血微环境对造血发生的影响.方法:本实验诱导人胚胎干细胞分化为造血细胞的方法采用两步法:先用细胞因子培养形成5 d的拟胚体,然后再模拟体内造血发生的微环境,分别用人卵黄囊基质细胞、人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞诱导拟胚体10 d,通过流式细胞术检测细胞的flk,CD34和CD45表面抗原表达情况,观察3种基质细胞对人胚胎干细胞向造血细胞分化的影响.结果:5 d拟胚体与卵黄囊基质细胞接触培养10 d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别1.80%±0.56%,1.30%±0.14%,1.05%±0.63%;与胎肝基质细胞接触培养10 d生成的细胞表达为flk,CD34,CD45百分率分别为34.0%±25.45%,38.4%±24.8%,72.6%±25.7%;与骨髓基质细胞接触培养10 d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别为2.50%±1.48%,3.20%±0.56%,1.65%±0.21%;5 d拟胚体自发分化10 d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别为0.30%±0.07%,0.65%±0.07%,0.15%±0.07%.与自发分化10 d比较,3种基质细胞与5 d拟胚体接触培养,均能够促进拟胚体向造血细胞的分化,且胎肝基质细胞诱导的效率显著优于其他两种基质细胞(P＜0.05).结论:与卵黄囊基质细胞和骨髓基质细胞比较,胎肝基质细胞更有利于诱导人胚胎干细胞向造血细胞的分化.
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元参组方对粒系造血祖细胞的增殖作用
目的 研究中药方剂对急性骨髓型放射病的治疗效果和对造血系统的作用及其作用机理.方法 选用元参等11种中药组成元参组方,小鼠一次皮下注射后,观察不同时间外周血细胞、胸腺重量、骨髓有核细胞、粒系造血祖细胞、胸腺细胞与骨髓细胞混合培养后粒系造血祖细胞的变化.结果 元参组方早期加速粒细胞的成熟和释放,第6天约为注射前的1.5倍.给药8 d后,试验组胸腺重量、骨髓有核细胞、脾指数分别为(85.9±5.6)mg、(8.9±1.3)×10~6/每根股骨、1.42,对照组胸腺重量、骨髓有核细胞、脾指数分别为(74.2±6.2)mg、(6.8±0.5)×10~6/每根股骨、1.0, 试验组明显高于对照组.试验组小鼠胸腺细胞与对照组小鼠骨髓细胞按20∶1混合培养,骨髓CFU-G约为加入未注射元参组方的小鼠胸腺细胞的1.5倍.未注射元参组方则未见有放大作用.结论 元参组方对外周血白细胞、骨髓有核细胞、胸腺重量和粒系造血祖细胞有明显的升高作用,激活胸腺细胞对粒系造血祖细胞的增殖有明显的放大作用.这种放大作用通过元参组方激活胸腺细胞实现.
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β5整合素在造血细胞上的表达及其与细胞增殖和诱导凋亡的作用
目的:整合素(integrins)是一类广泛存在于细胞表面的糖蛋白.在造血细胞的整合素由α和β两个亚基组成,参与细胞与胞外基质、细胞骨架的莲接,并通过酪氨酸和丝氨酸蛋白激酶系统介导细胞信息的传递.αvβ5的过度表达与肿瘤转移及血管形成有关.αvβ3也已证实与血管形成时的能动性调节及肿瘤的转移有关.αvβ3和αvβ5均可作用在摄取腺病毒易感的细胞,因而αvβ3和αvβ5的上调可引起腺病毒与易感细胞再结合增加.为研究αvβ5的功能及其对血源性细胞的作用,我们成功的构建了逆转录病毒载体系统和四环素控制下的诱导表达载体系统,并研究其对造血细胞整合素表达时细胞凋亡和增殖的影响;方法:用去除血清的方法,观察血源性细胞凋亡和分化时αvβ5和αvβ3的变化;用抗αvβ5单克隆抗体封闭血源性细胞上的αvβ5时,观察它们对凋亡和增殖的影响.结果和结论:用pGβ5CHT载体转导造血细胞,β5 cDNA未得到表达,用无血清培养诱导血源性细胞分化和凋亡时,αvβ5和αvβ3发生不平衡表达,αvβ5表达升高,αvβ3表达下降,与有血清培养相比,αvβ5和αvβ3比例是增加的,与K562相比,αvβ5对αvβ3的比例从有血清1.146升到无血清1.370,BV173细胞从0.147到0.464,U937从0.188到0.370,HL60从0.220到0.610,这些结果提示αvβ5的表达增加可促进无血清培养细胞的凋亡;用抗αvβ5单抗隆抗体封闭U937细胞,发现U937细胞的磷脂酰丝氨酸密度显著下降,这提示封闭细胞表面αvβ5可抑制细胞无血清引起的细胞凋亡;K562细胞β5表达水平的增加可抑制细胞的增殖.通过对β5反义转录单位的诱导表达研究发现,四环素可阻止tet/vp 16调控的反义β5基因的表达,从而导致外源性和内源性β5基因的表达,β5基因表达的提高可抑制细胞增殖,因而反义β5表达的缺乏与β5表达水平的增加及细胞生长抑制有关.
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IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白靶向杀伤白血病细胞的新策略
目的:利用细胞因子-受体的特异性结合来靶向杀伤肿瘤是新一代导向杀伤策略.鉴于白血病细胞异常高地表达IL6/IL6R系统,而正常造血细胞几乎不表达抑或微量表达这一事实,我们率先在国际上开展了利用IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白特异性杀伤高表IL6R白血病新策略的科学性及可行性的探讨.方法:1. IL6-PE40的构建、表达及纯化:常规进行RNA提取、RT-PCR、质粒提取、酶切、回收、连接、转化、鉴定IL6、PE40及IL6-PE40融合基因的序列分析等.将所构建的含IL6-PE40重组质粒在大肠杆菌表达,用HPLC半制备分离其产物,SDS-PAGE及Western-blot鉴定.IL6-PE40的细胞毒活性采用[3H]-亮氨酸掺入U266骨髓瘤细胞检测.
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脐血造血细胞的定向诱导分化
大剂量化疗是临床治疗恶性肿瘤和骨髓移植前预处理的常规手段之一,但它可导致粒细胞减少,从而引发严重的感染.虽然应用抗生素和造血生长因子可以减少感染并发症,但大剂量化疗往往损伤的是晚期祖细胞和白细胞,由此而导致的感染则需成熟的白细胞来治疗.脐血作为一种新的血源,含有较多的白细胞和具有自我复制及多向分化潜力的造血干、祖细胞,体外诱导造血细胞向粒系定向分化,可以增加脐血粒细胞群数量.目前的研究多限于针对分离纯化的CD34+细胞和采用小牛血清培养[1].我们采用脐血单个核细胞研究脐血血清联合造血生长因子诱导干/祖细胞向粒系的定向分化,为单份脐血粒细胞输注治疗大剂量化疗后的感染奠定实验基础.
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MDS的诊治与药物选择
骨髓增生异常综合症(myelodysplastic syndrome,MDS)是一组起源于造血体系定向干细胞或多能干细胞的异质性克隆性疾患,主要特征是无效造血和高危演变为急性体系白血病(acute myeloblasticleukemia,AML),临床表现为造血细胞在质和量上出现不同程度的异常变化.其具体临床表现为贫血,可伴有感染或出血,部分病人可无症状.
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抗CD33单克隆抗体在急性髓细胞性白血病中的应用
成人急性髓细胞白血病(AML)是成人白血病的主要类型(占60%左右).上世纪70年代末采用DA方案诱导化疗可使69%病人获得完全缓解(CR).80年代开始以IA方案诱导化疗使CR率达到73%,但不论采用何种化疗方案总有70%左右的病人复发.近年来,分子生物学研究进展为AML的治疗开辟了一个新兴的领域.研究发现,绝大多数急性髓细胞性白血病(AML)肿瘤细胞表面都存在CD33的表达,而在正常造血多能干细胞以及非造血细胞上却不存在这种糖蛋白.因此,CD33成为AML免疫治疗适宜的靶抗原.目前,运用单克隆抗体治疗AML已经取得了很大进展,使用的单克隆抗体形式也多种多样,包括未修饰的单克隆抗体、与放射性核素偶联的单克隆抗体以及与药物或者毒素相偶联的单克隆抗体等等.在上述众多单克隆抗体中,引人注目的莫过于Gemtuzumab ozogamicin(GO,Mylotarg),本文就将主要介绍GO在AML不同阶段治疗中的应用.
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急性髓系白血病化疗中吉妥单抗如何合理应用
CD33在90%急性髓系白血病(AML)的原始细胞表面表达,而造血干细胞、淋巴细胞及非造血细胞不表达CD33[1] , 因此CD33成为AML抗体靶向治疗的一个合适的靶点.吉妥单抗(Gemtuzumabozogamicin, GO)是人源化抗CD33单克隆抗体与刺孢霉素的偶联物,与CD33抗原结合后形成的复合物可被靶细胞内吞,在细胞内刺孢霉素从偶联物上水解游离,进入细胞核,导致双链DNA断裂、细胞死亡[2] .
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MHC Ⅰ类基因逆转录病毒表达载体的构建及其在造血细胞中的表达
目的构建BALB/c小鼠MHC Ⅰ类基因的逆转录病毒表达载体并探讨该基因在C57BL/6小鼠造血细胞中的表达.方法由逆转录病毒载体pMSCV介导,将BALB/c小鼠的H-2Dd基因导人C57BL/6小鼠的造血细胞中,并用逆转录聚合酶链反应和流式细胞仪检测转染后基因的表达.结果用EcoRⅠ和Xho Ⅰ双酶切鉴定证实,H2Dd基因正确插入载体pMSCV.重组逆转录病毒感染的C57BL/6小鼠造血细胞整合了BALB/c小鼠的H2Dd基因,且能转录为mRNA,在其细胞膜上有H2Dd分子的表达.结论成功构建小鼠H-2Dd编码基因的逆转录病毒载体,该基因已稳定地整合进C57BL/6小鼠造血细胞的基因组内,且在细胞中得到表达.
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骨髓造血细胞移植治疗克罗恩病的动物研究
目的:探讨骨髓造血细胞(hematopoietic cells,HCs)移植于克罗恩病(Crohn's disease,CD)大鼠模型后其在大肠的定位情况.方法:用三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠法制作SD大鼠CD模型.用悬浮法培养同种异体HCs,并用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)标记,经尾静脉注入体内,并以生理盐水为对照.于移植后第7天、第14天及第21天处死大鼠,取全段大肠组织,用免疫组化方法检测HCs的定位情况.结果:免疫组化显示移植组各时间段大肠组织均有BrdU阳性细胞定位,主要在黏膜上皮层,对照组阴性.结论:HCs可定位于大鼠CD模型的肠道中.
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大鼠骨髓间充质干细胞体内向造血细胞分化的研究
目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)及其天麻定向诱导神经细胞后向造血细胞分化的潜能.方法:建立以亚致死量照射的BALB/C小鼠为受体动物模型,体外扩增的大鼠6～7代MSC为供体细胞,分以下3组,每组12只进行实验:实验组1(A组),放疗单纯输注MSC;实验组2(B)组),放疗+输注等量无血清培养液.照射后4h内,分别经尾静脉注射.移植60d后取骨髓(BM)、外周血(PB)、脾(SP)细胞悬液,用流式细胞仪检测供体大鼠源性CD11a、CD45.对照组为阴性.A、B两组相互比较,具有显著差别意义(P<0.05).结论:MSC及天麻定向诱导神经细胞后具有向造血细胞分化潜能.
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蝎毒多肽Ⅱ对小鼠骨髓造血细胞的辐射保护作用
目的 研究东亚钳蝎蝎毒多肽Ⅱ(SVP Ⅱ)对C57BL/6小鼠骨髓造血细胞的辐射保护作用.方法 应用台盼蓝染色法、集落形成实验和长期骨髓细胞液体培养分别检测SVP Ⅱ对X射线(2 Gy)辐射后C57BL/6小鼠的造血祖细胞和造血干细胞功能的作用,分为Control组(加入生理盐水)、BSA组(加入BSA 1.0mg/L)、IL-3组(加入IL-3 10 μg/L)和SVP Ⅱ组(加入SVP Ⅱ 1.0 mg/L)4组;观察7 d和14 d半固体培养的集落生成情况,在21.d和35 d观察液体培养集落生长数量和形态,并每周进行细胞计数.应用MTS方法 检测不同浓度SVP Ⅱ(0.5、1.0 mg/L)作用于P388细胞24 h的影响.结果 SVP Ⅱ作用于正常和辐射后小鼠骨髓细胞,在35d时观察骨髓基质细胞较其他组显著增多;SVP Ⅱ作用下,辐射后7 d的集落数(CFUs)为13.00±2.18,与Control组(4.67±1.53)相比显著增加(P<0.01),SVP Ⅱ作用下14 d的CFUs为16.83±1.04,与Control组(5.33±0.76)相比显著增加(P＜0.05);辐射后骨髓细胞长期液体培养35 d后计数造血克隆数,SVP Ⅱ可显著增加辐射后骨髓造血细胞的造血克隆数(145.00±54.62),Control组(9.00±2.65)和IL-3组(44.00±38.57)与其相比,差异有统计学意义(P＜0.01),台盼蓝细胞计数结果 与该结果 相符.SVP Ⅱ对P388细胞的细胞活力无明显影响.结论 SVP Ⅱ对辐射后小鼠骨髓造血细胞具有辐射保护作用.
