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黄河郑州段水藻类生长预测模式研究
1992年以来,郑州市白庙水厂供水区域水质曾数次出现明显"鱼腥味".调查确认源水中含有大量藻类,出厂水中"含有浓度较低的移码突变型致突变物"[1,4].为摸清黄河郑州段水藻类生长规律及其与影响因素间的关系,提出控制郑州水源厂藻类生长的综合治理措施,在多次调查的基础上,开展了黄河郑州段水藻类生长预测模式研究.
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先天性核性白内障家系致病基因的克隆及在真核细胞中的表达
目的 克隆1个先天性核性白内障家系致病基因-突变型GJA8(mGJA8),研究其编码的蛋白质在真核细胞系中的表达和定位.方法 从研究发现的先天性核性白内障家系患者基因组中扩增突变型mGJA8,克隆入载体pGEF-T,然后酶切,定向克隆到真核表达质粒pEGFP-N1中,构建pEGFP-N1-mGJA8重组表达质粒,然后用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定,后通过脂质体包埋转染法,用pEGFP-N1-mGJA8和pEGFP-N1质粒转染COS-7细胞,荧光显微镜观察其在COS-7细胞内的表达,采用细胞免疫组织化学法验证蛋白表达.结果 经双酶切和DNA序列测定,证实致病基因mGJA8重组质粒构建成功,荧光显微镜观察在COS-7细胞上致病基因mGJA8蛋白表达,细胞免疫组织化学法显示致病基因表达蛋白在COS-7细胞中特异性表达.结论 成功克隆出该家系的致病基因mGJA8,并且完成了该致病基因在体外真核细胞中的特异性表达,为进一步研究该家系的发病机制奠定基础.
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Brugada综合征电生理和基因研究
在美国,心室颤动(VF)引起的猝死每年超过30万人[1,2],其中约5%~12%无器质性心脏病。Brugada等[3]报道一组发作性多形性室性心动过速(VT)或VF患者,心电图QT间期正常,右束支传导阻滞及右胸前导联V1~3 ST段持续抬高,而心脏超声、心室造影和部分病例心内膜活检均未见异常,该组病例被称为Brugada综合征。本文就近年该综合征的细胞电生理、基因突变和ST段抬高的机理研究进行总结。1 心律失常的细胞电生理特点 心脏钠通道SCN5A基因由α-亚单位和β-亚单位组成。Wang等[4]研究Brugada综合征K005家族基因,发现SCN5A基因外显子21突变,导致蛋白质的精氨酸(R)为色氨酸(W)取代(R/W);以及外显子28突变,出现蛋白质苏氨酸(T)被蛋氨酸(M)取代(T/M),认为这两种突变可能与特发性VF的发生有关。Chen等[5]观察蛙卵细胞突变基因异种表达对细胞电生理的影响,与野生型相比较,双突变(R/W+T/M)钠通道稳定态依赖性失活电压上移近10mV(正值);应用Boltzmann分布曲线分析,发现野生型与突变型(R/W+T/M)钠通道1/2电压(V1/2)虽相差近10mV(-72.6 mV和-63.4 mV),但对钠通道稳定态门控性质无影响。复极电位在-80~-110 mV,R/W+T/M突变型钠通道失活恢复明显快于野生型,但对通道激活无影响;R/W突变型钠通道失活恢复时间与野生型接近;T/M突变通道失活恢复时间与双突变(R/W+T/M)型接近,提示T/ M突变参与钠通道表型,而R/W型突变可能属于少见的基因多态性。Makita等[6]研究T/M突变对蛙卵细胞钠通道的影响,发现突变使通道1/2失活电压向正值升高5 mV(T/M -64.4±10 mV vs 野生型-69.2±0.8 mV,P<0.01),但不影响通道激活,与Chen[5]的结果一致;T/M型通道失活恢复速度在-80 mV时不比WT型快(P>0.05),与Chen等[5]结果不同。
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p53与BNIP3在胶质母细胞瘤中表达及其相关性
突变型p53不仅在胶质母细胞瘤中表达增加,而且参与了胶质母细胞瘤对化疗药物的耐药机制[1],且突变型p53可显著抑制BNIP3诱导的细胞凋亡,从而导致肿瘤发生.我们通过免疫组织化学检测p53与bcl-2腺病毒E1B 19 kD结合蛋白( BNIP3)在胶质母细胞瘤中的表达及其相关性.
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磷酸酶基因上调BIU-87细胞中p53蛋白表达水平并增强其对化疗药物的敏感性
张力蛋白同源、第10号染色体丢失的磷酸酶基因(PTEN)失活是否参与了化疗耐药的形成,目前报道尚少.本研究通过脂质体介导法将野生型PTEN基因(WT-PTEN)与两种突变型PTEN基因:G129E-PTEN(无脂质磷酸酶活性而保留蛋白磷酸酶活性)、C124A-PTEN(无磷酸酶活性)分别导入携带野生型p53基因的人膀胱癌细胞株BIU-87,研究PTEN在膀胱癌细胞中的作用.
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Pokemon与p53在肝癌中的表达及相关性
肿瘤的发生是一个多基因、多步骤的过程,其中癌基因的激活及抑癌基因的失活在该过程中扮演着重要的作用.Pokemon(POK erythroid ontogenic fac-tor)基因于2005年被确定为原癌基因,Pokemon蛋白在致癌转化过程中发挥着至关重要的功能,并与肿瘤的发生密切相关[1,2].我们采用免疫组织化学PV-9000二步法研究Pokemon和突变型p53在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中的表达,分析其相关性并探讨其与临床病理特征的关系.
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载体介导的RNAi对胰腺癌细胞交叉抑制的研究
国内外研究结果显示,以K-ras基因突变位点在内的mRNA片段作为靶序列设计的shRNA(短发卡RNA),能有效的抑制相应突变型K-ras基因的表达和细胞的增值,且不影响野生型K-ras基因的表达[1,2].
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凋亡抑制蛋白bcl-2/bax基因活性水平在乳腺癌发展中的调节作用
我们利用具有表达突变型p53乳腺癌伴有肺转移模型,通过α-干扰素诱导凋亡,观察细胞内bcl-2和bax的蛋白水平变化,探讨p53诱导的细胞凋亡中凋亡抑制蛋白bcl-2/bax基因所起的作用.
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脑胶质瘤实验研究的现状与展望
脑胶质瘤是神经外科的常见病,作为神经外科难点之一,也是实验研究的热点.纵观国内外的各项研究,绝大多数均以胶质瘤的基因治疗为中心,而实现基治疗的关键在于目的基因在胶质瘤组织中的高效转移和表达.今后,脑胶质瘤的治疗仍然是临床研究的重点,基因治疗与免疫治疗可望取得突破进展,从而改变脑胶质瘤治疗的现状.一、脑胶质瘤组织中基因表达水平的研究目前认为脑胶质瘤的发生是正常细胞基因组多重损伤的复杂过程,这种损伤不仅可出现癌基因的激活,而且还可能出现抑癌基因的缺失或失活.细胞癌变是个多阶段过程,可有多种基因和表基因改变,为更好地进行脑胶质瘤基因治疗的研究,国内外对脑胶质瘤组织中基因表达作了大量的研究,认识到p53基因是一种抑癌基因,而突变型p53基因为癌基因,p53基因改变与脑胶质瘤细胞的发生、发展有直接关系,是肿瘤发展到晚期的一个信号.
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P53反义RNA抑制肝癌生长的研究
目的:研究P53反义RNA对肝癌细胞中突变型P53致癌性的抑制效应,为肝细胞癌基因治疗提供新的方法.方法:2.1的人全长cDNA用EcorRⅠ和XbaⅠ的双酶切得到 1694bp长cDNA片段,反向插入哺乳动物表达载体PCR3.1,得到P53反义表达载体PCR3.1-P53(AS),并将其导入人肝细胞株Bel-7402(内源性突变型P53),采用MTT法和FCM方法测定PCR3.1-P53(AS)表达的P53反义RNA对Bel-74 02细胞生长的影响.结果:带有PCR3.1-P53(AS)的Bel-7402细胞,与对照组 Bel-7402细胞和带PCR3.1空载体的Bel-7402细胞比,增殖速度下降,FCM的结果也证明实验组细胞大部分受阻于G0/G1期,与细胞对照组及载体对照组有显著的差异.结论:P53反义RN A可有效地抑制肝细胞癌中突变型P53的致癌性,可用于肝细胞癌实验性基因治疗研究.
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AMP-AMPK-AS160信号通路在黄芪多糖刺激L6成肌细胞葡萄糖摄取中的作用
目的:探讨黄芪多糖( APS)对L6成肌细胞葡萄糖摄取的刺激作用及其机制。方法:培养L6成肌细胞,采用2-脱氧-[3 H]-D-葡萄糖法检测细胞的葡萄糖摄取,高效液相色谱法检测细胞内的AMP含量, Western blotting法检测腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和160 kD的Akt底物(AS160)的磷酸化水平;脂质体法瞬时转染4P突变型AS160(AS160-4P)质粒。结果:APS呈时间和浓度依赖性地刺激L6成肌细胞葡萄糖摄取,但可被AMPK抑制剂Compound C或转染AS160-4P质粒所抑制;APS可以提高细胞内的AMP含量;APS可以提高AS160的磷酸化水平,且这一作用可被Compound C抑制。结论:APS可以刺激L6成肌细胞的葡萄糖摄取,其机制可能与活化AMP-AMPK-AS160信号通路有关。
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核纤层蛋白基因LMNA复杂突变引起房室传导阻滞的分子机制研究
目的:房室传导阻滞是心脏电激动传导过程中,发生在心房和心室之间的电激动传导异常,可导致心律失常。前期,我们发现一个遗传性房室传导阻滞伴肥厚型心肌病家系,本次工作主要对其致病基因及机制进行研究。方法:采用候选基因测序的方法对已经确诊为房室传导阻滞的心脏病患者进行致病基因分析,对报道与心脏病相关的 TRP4、 SCN5A、 SCN1B、NKFX2.5、CLCA2和LMNA共6个基因测序并确定致病基因;构建致病基因的野生型和突变型质粒;克隆野生型和突变型,激光共聚焦显微镜检测野生和突变型蛋白在细胞定位,利用Western blot检测目的蛋白的表达情况对该突变功能进行分析。结果:遗传学分析显示在家系中患者LMNA基因第10号外显子缺失,并与疾病共分离。 Western blot结果显示突变型lamin蛋白表达水平正常,定位结果显示,野生型蛋白位于细胞核核膜,而突变型蛋白在核膜上和核内均有表达。 LMNA异常可引起房室结细胞死亡与纤维化,导致房室传导速率降低,并发生房室传导阻滞。自噬和凋亡是细胞死亡的重要形式,LC3-II是检测自噬的标志蛋白。应用Western blot检测LC3-II,结果显示LMNA突变不影响该蛋白表达。结论:本次研究中,我们发现了一个新的导致遗传性房室传导阻滞伴肥厚型心肌病的LMNA基因突变,该突变可使其编码的蛋白不能正确定位于细胞核膜,导致细胞核核纤层结构异常。核纤层在细胞分裂中呈现周期性的变化,因此核纤层的异常会对细胞正常周期产生重要影响从而导致细胞的异常死亡。这可能是导致该家族成员发生房室传导阻滞的原因。
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人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建能在哺乳动物细胞得到常氧下高表达的携带HIF-1α突变型HIF-1α-Ala402-Ala 564基因真核表达载体pShuttle2-HIF1α-Ala402-Ala564.方法 采用分子克隆技术,在业已完成的pShuttle2-HIF1α-Ala564的基础上,用连续聚合酶链式反应(PCR)定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA,构建成双突变HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564.结果 经酶切鉴定及基因测序证实人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α-Ala402-Ala564构建成功.结论 成功构建重组人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α-Ala402-Ala564,为缺血性心脏病的HIF-1α基因治疗研究奠定基础.
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肺癌中凋亡信号途径及其与EGFR通路的关系
肺癌是目前发病率和病死率高的恶性肿瘤,其中约 80%为非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC).目前,肺癌可以简单分为:EGFR突变型、K-RAS突变型、ALK融合型及其他型[1].对于前3种肺癌亚型目前均有相应的靶向药物治疗.第四型约占肺癌的25%,而对于这一占主要比重的肺癌亚型我们是否可以通过直接上调凋亡途径中的凋亡因子如CASP3、8、9等来促进肺癌乃至其他肿瘤细胞的凋亡从而达到抗肿瘤的作用,具有重要的科学研究和应用意义.本文就肺癌中凋亡途径与EGFR通路的关系作一简单综述.
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EGFR突变型肺癌患者血清CEA对TKI的疗效预测及预后价值
目的:探讨在表皮生长因子受体(EGFR)突变的晚期非小细胞肺癌患者中,血清癌胚抗原(CEA)对EGFR络氨酸激酶抑制剂(TKI)的疗效预测及预后影响。方法:回顾性分析了我院胸部肿瘤科接受EGFR-TKI治疗的EGFR突变患者,记录患者血清CEA水平,分析CEA水平与TKI疗效及患者预后的相关性。结果:83.1%患者基线CEA水平升高,56.6%患者在TKI治疗后1月CEA下降幅度达到20%,取得了CEA response。72.3%的患者接受EGFR-TKI治疗后达到了影像学的客观缓解,CEA response与影像学缓解无相关性。全组患者接受TKI治疗的中位无疾病生存期为9.6个月,中位总生存期为22.0个月。多因素回顾分析显示,基线血清CEA水平及EGFR-TKI治疗时机是影响突变型NSCLC患者总生存的独立影响因素。结论:血清CEA水平不能预测晚期EGFR突变患者的TKI疗效,但基线CEA升高患者预后更佳。
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p53家族新成员-p63基因的类型、功能及应用
p53是研究得为广泛和深入的肿瘤相关基因,分为野生型和突变型,野生型p53为肿瘤抑制基因,而突变型具有致癌作用,其家族成员直至1997年才陆续被发现,分别是p73和p63.
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作者介绍:张恒术(1965-).男,副主任医师,硕士
1979年,Lane和Crawford在SV大T抗原基因转染的细胞中首次发现了p53基因[1].近二十年的研究表明,p53基因是与人类肿瘤关系密切的基因,它存在两种类型:野生型和突变型.正常情况下,p53基因以野生型参与多种细胞内过程,其产物具有抑制G0/G1期细胞进入XS期及诱导细胞凋亡的作用,故被认为是一种抑癌基因.而突变型p53基因由于结构变化丧失了上述功能,成为人类肿瘤中常见的癌基因之一.现将皮肤恶性肿瘤及其它皮肤疾病中p53基因的突变情况及表达综述如下.
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野生型及突变型survivin基因重组逆转录病毒的构建及表达研究
目的构建含绿色荧光蛋白和野生型及第34位氨基酸突变型survivin基因的双顺反子逆转录病毒载体,并进行真核细胞表达.方法用PCR的方法由含survivin基因的真核表达载体扩增所需目的片段,然后将该片段插入逆转录病毒载体pMIG.酶切鉴定重组子,脂质体介导下转染包装细胞Phoenix E,病毒上清感染NIH3T3细胞,RT-PCR检测外源基因mRNA的表达、流式细胞仪检测GFP的表达从而确认外源基因的转录.结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,目的片段成功的连接到pMIG载体上.载体转染NIH3T3细胞,RT-PCR显示目的片段mRNA能够表达,流式细胞仪检测GFP获良好的表达.结论成功构建了人survivin基因野生型及突变型逆转录病毒,并在NIH3T3细胞进行了表达,为下一步的研究工作提供了有效的分子工具,并且为将来能在体内应用抑制survivin基因表达的肿瘤治疗奠定基础.
关键词: Survivin基因 野生型 突变型 逆转录病毒载体 -
血清p53抗体与肺癌的研究进展
由于肺癌发病率的升高,肺癌的早期诊断和临床监测已经越来越受到重视.近年来随着分子生物学的进展,人们对肿瘤发生机制在分子水平上有了更新的认识,基因研究越来越受到重视.p53基因在人类肿瘤的发生过程中起着重要作用,其与肿瘤发生、生长调控以及肿瘤细胞凋亡等关系十分密切.p53基因突变后大量表达的突变型P53蛋白,可引起机体自身的免疫应答,产生针对P53蛋白的自身抗体,对于肺癌的辅助诊断、预后、临床监测和免疫治疗有重大的意义.其中,血清p53抗体(p53 antibody,p53-Abs)的检测以其操作方便、性质稳定而倍受瞩目.
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COL9 A2基因野生型与G143 C、G884 A突变型质粒构建及鉴定
目的:构建IX型胶原α2(collagen type IX alpha 2 chain,COL9A2)基因野生型与G143C、G884A突变型质粒,为进一步研究COL9A2基因功能奠定基础.方法:应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、酶切、连接等技术,将COL9A2基因野生型、携带突变位点G143C与G884A的基因分别插入pUC57空质粒中,基因测序技术进行鉴定.结果:经酶切和基因测序证实COL9A2基因野生型与G143C、G884A突变型分别插入pUC57质粒中.结论:成功构建了pUC57-COL9A2基因野生型、pUC57-p.Gly48Ala和pUC57-p.Gly295Asp突变型质粒.