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配对免疫球蛋白样受体B在小鼠树突细胞上的表达及其与免疫耐受关系的研究
目的 研究配对免疫球蛋白样受体B(PIR-B)在小鼠树突细胞(DC)上的表达及其与免疫耐受的关系.方法 DC2.4为C57BL/6小鼠来源的不成熟的DC株.脂多糖(LPS)刺激48 h为成熟DC(mDC).分别以重组小鼠IL-10(rmIL-10)、重组人转化生长因子β1(rhTGFβ1)诱导DC2.4为耐受性DC(T-DC),体外化学合成PIR-B特异性RNA小干扰分子(siRNA),以Lip2000转染DC2.4(siDC),分别用半定量RT-PCR、Western blot检测rmIL-10、rhTGFβ1、LPS及PIR-B特异的siRNA对DC2.4上PIR-B表达的变化.以3H-TdR标记检测同种异体淋巴细胞反应(MLR),ELISA法测定MLR上清中IFN-γ的水平变化.结果 RT-PCR、Western blot结果显示DC2.4表达PIR-B mRNA及蛋白相对值为0.51±0.08和0.58±0.23;mIL-10、rhTGFβ1诱导的T-DC上PIR-B的mRNA及蛋白表达相对水平均明显升高,相对值分别为0.85±0.07和0.87±0.14;0.79±0.10和0.85±0.34(P值均<0.05),LPS刺激的mDC PIR-B mRNA及蛋白表达则降低(0.35±0.10和0.32±0.04,P<0.05),转染PIR-B特异性siRNA后DC2.4上PIR-B的mRNA及蛋白表达水平也明显受抑,干扰48 h后分别下降了78.9%和74.2%(P<0.05).正常DC2.4可以刺激异基因淋巴细胞增殖;LPS-DC刺激异基因淋巴细胞增殖的能力明显增强,其反应体系中的IFN-γ水平明显升高;T-DC刺激淋巴细胞增殖的能力明显受到抑制,其反应体系中的IFN-γ水平明显下降;而转染PIR-B siRNA后,DC刺激淋巴细胞增殖的能力得到明显恢复,其反应体系中的IFN-γ水平明显回升.结论 高度表达免疫抑制性受体PIR-B是小鼠DC获得免疫耐受的共同特征及分子机制之一.
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微小RNA与恶性淋巴增殖性疾病相关性的研究进展
真核生物中存在两种主要的非编码RNA(non-coding RNA),并发挥重要作用.一类为小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),另一为微小RNA(microRNA,miRNA).miRNA是一种大小19~25核苷酸(nt)、非编码蛋白的单链小分子RNA,由具有发夹结构的70~90个碱基大小的前体microRNA(pre-microRNA)经过Dicer酶剪切加工而形成的[1].它广泛存在于真核生物中,其本身不具有开放阅读框(ORF).现就目前miRNA与恶性淋巴增殖性疾病的研究进展作一综述.
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大鼠永生化神经前体细胞CDH1小干扰RNA真核载体的构建
目的 构建大鼠永生化神经前体细胞(INPC)CDH1小干扰RNA(siRNA)真核载体.方法 根据大鼠CDH1基因的编码序列设计3个小发夹RNA(shRNA)干扰序列及1个阴性对照序列,根据pENTR/H1/TO中间载体说明书设计并合成相应的DNA单链,退火后分别连接到pENTR/H1/TO线性载体上,形成完整载体,提取CDH1 siRNA真核载体后(分别为CDH1 siRNA1、CDH1 siRNA2、CDH1siRNA3和CDH1 siRNA对照),进行DNA测序鉴定.采用Lipofectamine 2000法,分别将成功构建的CDH1siRNA真核载体转染大鼠INPC,于转染24 h和48 h时计算INPC转染效率=INPC成功转染数/细胞总数,于转染48 h时提取细胞总RNA,采用实时定量PCR法检测INPC CDH1 mRNA的表达.结果 经DNA测序鉴定构建的3个CDH1 siRNA真核载体和1个阴性对照载体所插入的RNA干扰序列均正确,无碱基突变或缺失;INPC转染24 h与48 h时转染效率分别为(54±5)%和(36±4)%;CDH1 siRNA2转染INPC 48 h时INPC CDH1 mRNA表达水平较CDH1 siRNA3降低,且两者均低于CDH1 siRNA1(P<0.05).结论 本研究成功构建大鼠INPC CDH1 siRNA真核载体.
关键词: 细胞周期末期促进复合物 RNA 小干扰 干细胞 -
RNA干扰对甲型肝炎病毒的复制抑制作用
一、什么是RNA干扰在生物细胞内,双股链RNA(dsRNA)可由RNA酶Ⅲ家族切酶(Dicer)切断分解为21~23bp的小干扰RNA(small interfering RNA: siRNA).
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小干扰RNA在体内的递送和其对自身免疫性疾病治疗的研究进展
RNA干扰( RNA interference , RNAi )发生于大多数真核细胞中负责转录后基因调节,其作用机制是通过导入双链RNA( double strands RNA,dsRNA)有效降解与其互补的信使 RNA ( messenger RNA , mRNA)导致转录后水平的基因沉默[1]。由小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)介导的基因沉默有两方面的应用:①作为一种工具发现、确定疾病发病机制,②作为创新疗法应用于疾病治疗。自身免疫性疾病(Autoimmune diseases,AID)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病,主要包括干燥综合征、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化症等。目前RNAi已经用于癌症[2]、HIV[3]、呼吸系统疾病、神经系统疾病和自身免疫性疾病[4]的治疗。但国内对于siRNA 在自身免疫性疾病治疗中的研究甚少。
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慢性乙型病毒性肝炎抗病毒的基因治疗进展
全世界约有3.5亿人为现症慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者,而我国的慢性无症状HBV携带者可能超过1.2亿[1]其中15%~40%的慢性乙型病毒性肝炎患者在一生中可能会发生严重并发症(肝癌、肝硬化、肝衰竭).严重威胁着人类的健康.随着分子生物学的发展,基因治疗已成为目前研究的热点,如反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶技术、小干扰RNA等,在抗病毒的研究中已显示出可观前景.
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RNA干扰的抗病毒作用及其影响因素
自从在哺乳动物细胞中发现存在RNA干扰现象以来,RNA干扰技术也应用于抗病毒研究.通过多种形式诱发的RNA干扰对细胞中病毒的复制或病毒基因的表达都产生了有效的抑制,为病毒病的预防和治疗提供了新的途径.然而,一些因素制约着RNA干扰的潜在应用,如在RNA干扰压力下病毒逃逸株的出现,有的病毒可以编码RNA干扰抑制因子以及小干扰RNA的脱靶效应等.
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RNA干扰技术应用的研究进展
RNA干扰指双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉寂的过程.它作为一项新的分子生物学研究技术,自1998年发现以来已有了重大进展.RNA干扰技术在哺乳动物中的应用研究自2001年取得突破以后又获得了重大进展,在构建稳定表达小干扰RNA的载体和有效筛选小干扰RNA靶序列技术方面取得突破,并在胞内抗病毒免疫、基因功能应用研究、机体水平应用研究等方面也取得了重大进步.
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009 胆固醇修饰的小干扰RNA静脉注射可抑制小鼠内源性apoB基因表达
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小干扰RNA干扰丙型肝炎病毒RNA的复制
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病毒研究的崭新技术--RNA干扰
RNA分子可参与生物体细胞许多基本的生理活动,继发现核酶、肽核酸和反义RNA等之后,近来有关小干扰RNA及其所致的RNA干扰现象又成为研究热点.小干扰RNA是dsRNA被DICER降解后产生的长19~23核苷酸的小RNA片段,具有5'-磷酸、3'--羟基和2个核苷酸(dTdT或UU)的3'端;而RNA干扰则是由小干扰RNA引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默现象,其本质是小干扰RNA与对应的mRNA特异结合,形成降解,从而阻止mRNA的翻译.RNA干扰是生物进化的结果,是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应.当病毒在宿主细胞内进行复制时,病毒RNA可被降解成小干扰RNA,从而在细胞内产生的RNA干扰,通过RNA干扰的作用抑制病毒的增殖.
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小干扰RNA与RNA干扰
RNA分子参与生物体许多基本的细胞生理活动,其功能之多远未搞清楚。继核酶、肽粒酸、反义RNA等之后,近年来有关小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)及其所致的RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象又成为研究的热点。siRNA是双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)被RNaseⅢ家族中的核酸酶DICER降解后产生的长21~25核苷酸的小片段,具有5′-磷酸、3′-羟基和1~2个核苷酸的3′-粘性末端。所谓RNAi就是siRNA引起的生物体内同源基因特异性沉默(silencing)现象,其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合,使靶RNA降解从而阻止mRNA的表达。RNAi现象首先在转基因植物中发现,当时称为共抑制(co-suppression)或转录后基因沉默(post-transcriptional gene sileneing,PTGS);后来证明在真菌等真核生物中也存在,称为消除(quelling);在线虫和果蝇中则称为RNA干扰。研究表明,这3种现象有共同的转录后基因沉默机制,都是外源性dsRNA被加工成siRNA,然后识别与切割相应mRNA的过程。长度>30核苷酸的外源性dsRNA可在细胞内被核酸酶DICER切割成长21~25个核苷酸的正义和反义RNA链,即siRNA。反义siRNA可与同源单链mRNA特异结合,作为RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)的引物,引导RISC切割相应的靶RNA。……
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RNA干扰抑制丙型肝炎病毒复制的研究进展
RNA干扰技术(RNAi)是近两年来产生的新兴生物技术.RNAi作用的基本原理是双链小干扰RNA(siRNA)结合核酶复合物形成RNA诱导的沉默复合体(RISC),激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上并切割mRNA,进而破坏特定目的基因转录产生的mRNA,使其功能沉默.由于siRNA作用的阶段是在目的基因转录成为mRNA以后,即转录后,所以RNAi引导的基因沉默又称转录后基因沉默(PTGS).
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肝纤维化基因治疗新策略
肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应,其特征性改变是肝内细胞外基质(ECM)过多沉积.近年来,随着对肝纤维化发生机制认识的深人及基因治疗技术的发展,针对肝纤维化发生的多个环节,应用核酶、反义核酸、小干扰RNA(siRNA)、转基因及基因敲除等技术在基因水平进行调控,将可能抑制肝纤维化发展.目前,肝纤维化基因治疗在细胞因子调控、联合基因治疗、siRNA技术运用及靶向载体研究方面取得了较大进展.
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piRNA/PIWI 在肝癌发生发展中的机制研究进展
人类全基因组中仅约1%~2%的核苷酸能够被转录并翻译成蛋白质,余下98%以上均为非编码 RNA (non-coding RNA,ncRNA),可在基因水平上发挥其生物学功能[1]。在ncRNA 中,核苷酸序列长度小于200bp 的称为短链非编码RNA (short non-coding RNA,sncRNA),占全部 ncRNA 的10%~20%[2,3],包括 PIWI 蛋白结合 RNA (PIWI-interacting RNAs,piRNAs)、微小 RNA (microRNA,miRNA)、重复相关小 RNA(repeat associated small interfering RNAs,rasiRNA)以及小干扰 RNA (small interference RNA,siRNA)[4]。肝脏恶性肿瘤是常见的消化系统肿瘤,发生率和死亡率居我国恶性肿瘤的前五位[5]。尽管2016年美国癌症总死亡率下降23%,但肝癌的发病率和死亡率却呈上升趋势[6]。肝癌的早期筛查与诊断对肝癌的治疗和预后的改善至关重要。piRNA 可以在分子水平调控肝癌的发生发展,可以为肝癌的早期筛查和靶向治疗提供新的思路。
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应用干扰RNA技术抑制乙型肝炎病毒抗原的体外表达
RNA干预(RNAi)是双链RNA(dsRNA)启动的选择性基因沉默作用,是一种基因水平的调控机制.序列特异性小干扰RNA(siRNA)可特异性抑制病毒复制[1],而HepG 2.2.15细胞系包含完整的HBV基因组,能介导HBV的高水平复制与表达,作为siRNA作用的靶向模型,实验结果更客观,更有说服力.我们观察HBV X区和核心区(C区)的4对特异性寡核苷酸片段对HepG 2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响,现将结果报道如下.
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小干扰RNA表达质粒转导逆转人结肠癌羟基喜树碱耐药表型的研究
目的 探讨结肠癌羟基喜树碱(HCPT)多药耐药现象的逆转策略.方法 应用RT-PCR法检测结肠癌HCPT耐药细胞中耐药相关基因的表达;构建并转导乳腺癌耐药蛋白(BCRP)基因小干扰RNA(siRNA)表达质粒;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法进行药物敏感实验;流式细胞仪测定细胞周期分布;软琼脂克隆形成实验检测肿瘤细胞体外成瘤性;RT-PCR和Western印迹法测定BCRP基因敲除效果.结果 SW1116/HCPT细胞8个耐药相关基因中,2个表达下调,4个表达上调,还有2个表达无明显改变;成功构建BCRP基因siRNA表达质粒,转染效率约42%;与耐药细胞相比,转染细胞对HCPT敏感性增加,IC50下降62.5%;转染细胞周期分布有明显改变:G1期细胞减少,S期细胞增加;转染细胞体外成瘤性下降,形成克隆体积减小;RT-PCR和Western印迹显示,转染细胞中BCRP基因mRNA和蛋白质的表达下降甚至消失.结论 siRNA表达质粒转导是逆转结肠癌HCPT耐药现象的一种有效手段.
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小干扰RNA沉默bcl-2基因抑制胃癌细胞生长的研究
目的 利用RNA干扰技术,研究靶向bcl-2的小干扰RNA(siRNA)在体内外对胃癌细胞生长的影响,探讨其对胃癌治疗的可行性.方法 化学合成bcl-2基因的siRNA,脂质体法将bcl-2siRNA转染胃癌SGC 7901细胞,采用实时定量PCR和Western印迹观察bcl-2 siRNA转染前后胃癌细胞bcl-2基因的表达变化,四甲基偶氮唑盐(MTT)实验、流式细胞检测技术和端粒重复序列扩增法(TRAP)分别检测胃癌细胞增殖、凋亡和端粒酶活性变化.并将转染bcl-2 siRNA的胃癌SGC 7901细胞接种于裸鼠皮下,观察其在裸鼠体内成瘤及生长情况.结果 数据经方差分析,bcl-2 siRNA转染胃癌SGC 7901细胞后,明显抑制bcl-2基因表达,并与其浓度和作用时间相关,以100 nmol/L bcl-2 siRNA对bcl-2基因表达抑制效果佳.以该浓度的bcl-2 siRNA转染胃癌SGC 7901细胞后,bcl-2 mRNA和蛋白表达抑制分别为79.9%和85.3%;经bcl-2 siRNA作用的SGC 7901细胞生长明显缓于对照组(P<0.05),细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),端粒酶活性明显低于对照组(P<0.05).转染100 nmol/Lbcl-2 siRNA的胃癌SGC 7901细胞接种裸鼠皮下后,肿瘤出现时间晚,体积小,生长受到明显抑制(P<0.05).结论 靶向bcl-2的siRNA可明显下调靶基因bcl-2的表达,在体内外抑制胃癌SGC 7901细胞的生长,为探索胃癌基因治疗提供新的策略.
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小干扰RNA组蛋白去乙酰化酶1对人胰腺癌细胞甲基化的作用研究
基因甲基化是抑癌基因失活的主要机制.胰腺癌中许多抑癌基因因CpG岛异常超甲基化而失活,如人类错配修复基因1(human mutL homolog 1,hMLH 1)、维甲酸受体β基因(retinoic acid receptor,RAR-β)等.组蛋白去乙酰化后的异染色质蛋白1(heterochromatin protein 1,HP1)可募集DNA甲基转移酶,从而使基因启动子CpG岛甲基化[1].甲基化CpG结合蛋白通过与组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)复合体相互作用而实现其抑制作用[2].甲基化抑制基因转录有赖于抑制性染色质环境.HDAC1过表达可导致组蛋白去乙酰化.本研究通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术研究HDAC1在胰腺癌中对DNA甲基化的影响.
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小干扰RNA干扰Wnt/β-连环蛋白信号转导通路抑制肝癌细胞生长
以β-连环蛋白(β-catenin)为中心的Wnt信号转导通路是肿瘤发生、发展过程中关键的信号传导通路之一.本实验应用RNA干扰技术沉默β-连环蛋白基因的表达,研究Wnt/β-连环蛋白信号传导通路对肝癌细胞生长的影响,以进一步揭示肝癌的发病机制,并观察小干扰(si)RNA能否用于肝癌的治疗.