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发现新药的有效方法--反向内分泌学
传统内分泌学是通过纯化,确定其化学和生理学性质来鉴别激素,再利用放射性配体研究配体与受体的相互作用鉴别其特异性受体,后描述基因及其染色体的定位.而反向内分泌学是先采用分子生物学的方法鉴别罕见受体(orphan receptor,为目前尚未找到配体的受体),再确定其特异性配体.新合成的配体可在报道基因(reporter gene,为处于另一基因下游并可反映转录及上游基因表达水平的基因)激活试验中进行测试,筛选出选择性配体,并有望成为内分泌及其相关疾病的新治疗药物.
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信号调节蛋白SIRPα在肝癌内的表达及意义
目的:探讨信号调节蛋白SIRPα与肝细胞癌之间的关系.方法:应用Northern杂交技术,检测36对肝细胞癌(HCC)和相应癌旁肝组织,以及1种正常肝细胞系、4种肝癌细胞系内SIRPα基因表达的变化,并结合各组织标本的病理学特点进行分析.结果:SIRPα在20例肝癌组织及两种肝癌细胞系内表达水平明显下降.在两种主要杂交信号中,肿瘤组织内3.9 kb转录子表达量较癌旁组织下降2~4倍,而2.5 kb转录子表达量则下降4~6倍.有9例肿瘤组织在原基因表达水平下降的同时,在3.9 kb转录子的上方又出现一长度稍大的杂交信号,而相应癌旁肝组织内则为阴性.其中,5例有肝内或门静脉转移的肿瘤组织,SIRPα表达全部下降,且均发现有这种新的基因表现形式出现.结论:SIRPα,尤其是2.5 kb转录子在肝癌内表达下降,与肿瘤进展程度密切相关,且肿瘤组织内存在SIRPα相关的新的基因表现形式.SIRPα可能为肝癌发生发展过程中一个重要的调节蛋白.
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中药天癸方对雄激素致不孕大鼠下丘脑Leptin受体及神经肽Y mRNA的影响(摘要)
目的 从基因转录水平探讨中药天癸方对雄激素致不孕大鼠(ASR)肥胖及无排卵的影响。方法 采用α-32P标记瘦素(leptin)受体(OB-R)及神经肽Y(NPY)寡核苷酸探针原位杂交、放射自显影技术结合图像分析,观察中药治疗前后下丘脑弓状核(ARC)两种物质tRNA的表达变化。结果 ASR中ARC的NPY基因表达水平明显增加(P<0.01),OB-R基因表达水平明显降低(P<0.01),ASR呈肥胖、无排卵状态。用中药天癸方治疗后,NPY基因表达下降,OB-R基因表达上升至正常大鼠水平。结论 ADR肥胖及无排卵可能与NPY mRNA过度表达、OB-R tRNA数目异常有关,中药可调节NPY和O1B-RmRNA表达而发挥减肥及促排卵作用。 [全文刊登于中国中西医结合杂志2000.20(5):362]
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丙泊酚对脑缺血再灌注后c-fos表达的影响
丙泊酚能够降低脑代谢率,减少脑血流量,降低颅内压对神经元具有保护作用,但作为神经保护药应用于临床仍存在争议.本文目的从基因表达水平探讨丙泊酚对脑缺血再灌注的影响.
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白术及茯苓提取物对豚鼠皮肤酪氨酸酶 mRNA基因表达水平的影响
哺乳动物黑素细胞黑素生成受多种因素调控。紫外线、促黑素、 8-甲氧补骨脂素等对黑素生成具有刺激作用 [1,2],而氢醌、熊果苷、甘草酸等对黑素生成则有抑制作用。我们发现中药茯苓、白术能抑制酪氨酸酶活性 [3],使黑素细胞和黑素颗粒减少 [4]。为了研究它们对酪氨酸酶 (TYR) mRNA基因表达的影响,我们应用逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)技术,检测药物干预前后豚鼠皮肤中 TYR mRNA表达水平。 一、材料与方法 (一 )动物:健康雄性棕黄色豚鼠 10只 (南京军区医学实验动物中心提供,普通级 ),体重 332~ 425 g,平均 380.2 g。每只实验动物背部取 6个相离区域, UVB照射后外涂药物。阳性对照外用 3%氢醌。
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人肝癌组织中APRIL及其受体mRNA水平的定量测定
目的:采用实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)技术分析肝癌组织中增殖诱导配体(A-PRIL)及其受体mRNA的表达水平.方法:在APRIL及其受体基因的高保守区设计相应引物和荧光探针,实时检测PCR产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本中靶基因mRNA准确含量,并以靶基因和内参β2M mRNA含量的比值作为评价靶基因表达水平的指标.结果:RFQ-PCR检测靶基因mRNA含量的线性范围为10~109pg/ml,批内和批间重复性测定的变异系数V分别为3.87%~10.12%和6.86%~12.29%.20例肝癌组织样本的检测结果显示肝癌及癌旁组织中APRIL和BCMA的水平均显著高于远端正常组织(P<0.01),而TACI的表达水平在三组间差异无统计学意义(P>0.05).结论:成功建立RFQ-PCR检测APRIL及其受体mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性;而且发生APRIL在肝癌发生、发展过程中可能起了重要作用,有可能还参与了肿瘤细胞的转移,并主要是通过受体BCMA而不是TACI的作用.
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BRCA1基因CpG岛甲基化所致转录抑制作用具有位点特异性
表遗传(Epigenetics)是一种可遗传的,非DNA序列改变的,能引起基因表达水平的异常.DNA的甲基化是影响表遗传的主要因素,与基因表达抑制、基因功能缺失有关.许多抑癌基因如p16、Rb、BRCA1等,通过DNA的甲基化而失活,成为某些肿瘤和遗传性疾病发病的重要机制之一.但是,并不是所有的胞嘧啶5′甲基化与基因表达下降有关.研究表明,基因转录抑制可能与基因启动子和第一外显子区域特别是CpG岛的甲基化有关.基因的CpG岛序列长度在200 bp以上,在此区域内存在许多的CpG位点.如BRCA1基因的CpG岛即在-567~+44 bp序列内存在30个CpG位点,并都有可能发生胞嘧啶的甲基化修饰.这些位点的甲基化是否都与转录抑制有关,有没有影响基因转录和表达的特异性、关键CpG位点存在?不同作者对不同基因研究的结果不一致,甲基化的作用方式至今还未得到解决,因此影响甲基化效应的有效分析,甚至可能导致错误结果.Rice(Carcinogenesis,2000,21(9):1761-1765.)对21例乳腺癌患者BRCA1基因CpG岛中30个CpG位点的甲基化情况和基因转录水平进行研究,提出CpG岛甲基化与基因转录抑制有关.我们对该数据用方差分析、多因素线性回归模型重新进行分析研究,探讨BRCA1基因CpG岛区域各CpGs位点的甲基化与基因转录水平的关系,以阐明CpG甲基化对转录抑制的作用方式.方差分析显
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长链非编码RNA在甲状腺癌中的研究进展
甲状腺癌是常见的甲状腺恶性肿瘤,也是内分泌系统常见的恶性肿瘤之一。据统计,无论国内还是国外,甲状腺癌的发病率均是所有恶性实体肿瘤中增长快[1-2],已严重影响到人类健康。但甲状腺癌具体的发病机制尚不完全明了。目前认为90%的人类恶性肿瘤与环境因素有关,环境的改变诱导机体内某些致病基因发生变化,从而促进了疾病的发生[3]。在人类的基因转录组中,发现了一类长度>200nt,本身缺乏明显的开放阅读框,且不参与蛋白质编码功能,以RNA形式在多种层面上调控基因表达水平的RNA,这种RNA即为长链非编码RNA(longnoncoding RNA,lncRNA)[4],其占了RNA总量的绝大部分。不同于编码RNA,lncRNA的保守性要差得多,然而在其分子内部,却含有较为保守的局部区段,且其表达具有时空特异性,这些现象均提示了lncRNA在肿瘤中具有重要的生理生化功能[5-7]。已有研究表明lncRNA参与了X染色体沉默,基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程[8]。而在甲状腺癌细胞的转录水平和转录后水平的调控基因表达中,lncRNA发挥着重要作用,未来可能会成为甲状腺癌诊断及治疗中重要的新型分子标记物和治疗靶点。本文将着重讨lncRNA在甲状腺癌中对基因表达的调控机制以及其发生、发展中的意义。
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CEAmRNA检测对消化道癌症的临床价值
如何早期发现恶性肿瘤的复发和转移是恶性肿瘤诊治的关键性问题之一,但是大多数的肿瘤标志物由于敏感性和特异性不高,限制了它们在临床上的应用.随着当代分子生物学和免疫学的快速发展,肿瘤标志物的检测水平已发展到基因表达水平,敏感性和特异性得到了一定程度的提高,其临床应用价值值得重新评价.本文旨在对癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen,CEA)mRNA表达的检测对消化道癌症的临床价值综述如下.
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bcl-2、p16和nm23基因在肺癌中的表达及其临床意义
目的研究bcl-2、p16和nm23基因在肺癌中的表达及其临床意义。方法应用免疫组化SP法检测bcl-2、p16和nm23基因在82例肺癌组织中的表达并结合肺癌的临床病理学特征及预后情况进行分析。结果肺癌中存在bcl-2基因超量表达和p16基因表达下调,bcl-2基因表达与肺癌的TNM分期有关,p16基因表达与肺癌的分化程度、TNM分期及预后有关,nm23基因表达与肺癌的转移和预后有关,bcl-2与p16基因、p16与nm23基因在肺癌中常联合表达。结论①bcl-2基因超量表达与p16基因表达下调在肺癌的发生、发展中起重要作用。②p16和nm23基因表达可作为判断肺癌预后的较强因子。③nm23基因表达水平是预测肺癌转移潜力的可靠指标。④多基因联合检测对判断肺癌的生物学行为和预后更有意义。主题词肺肿瘤;基因,bcl-2;免疫组织化学自由词 p16基因;nm23基因中图分类号 R734.2;R394.2
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乳腺癌“分子图谱"绘出
对不同的乳腺癌患者来说,肿瘤形成过程、对治疗手段反应能力是不同的。美国科学家认为,这是由于体内相关的多种基因起作用的程度不同造成的。他们使用新技术绘制出了乳腺癌肿瘤组织样本中各基因表达水平的“分子图谱”,这将有助于寻求更有效、不育反应更小的疗法。 美国斯坦福大学医学院的藏维·博斯坦因等人在新一期英国《自然》杂志上报告说,他们使用一种名为“生物芯片”的新技术,成功地从全局同时观察大量基因的活动。研究人员取了42例病人的65份乳腺癌组织样本,利用“生物芯片”技术观察8 102个基因的活动,为每一份样本绘制出各基因表达水平的图谱。然后将数据与临床观察结果相结合,研究基因活动与肿瘤症状及对化疗反应能力的关系。研究发现,同一病人的两份样本之间,“分子图谱”的相似程度总是比其他样本的相似程度要高。这表明,各基因表达水平的不同,确实与肿瘤的外在表现有关。 (摘自《健康报》2000年8月24日第1版)
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镁锌合金对成骨细胞整合素表达的影响
我们前期的实验研究结果表明镁锌合金具有良好的生物安全性和生物相容性,在治疗骨折和骨缺损方面具有潜在的优势~[1-4].但细胞与材料相互作用机制仍有待进一步的研究.我们在基因表达水平进一步研究了镁锌合金对成骨细胞整合紊(Itg)α2、α5和β1的mRNA表达的影响.
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脑胶质瘤实验研究的现状与展望
脑胶质瘤是神经外科的常见病,作为神经外科难点之一,也是实验研究的热点.纵观国内外的各项研究,绝大多数均以胶质瘤的基因治疗为中心,而实现基治疗的关键在于目的基因在胶质瘤组织中的高效转移和表达.今后,脑胶质瘤的治疗仍然是临床研究的重点,基因治疗与免疫治疗可望取得突破进展,从而改变脑胶质瘤治疗的现状.一、脑胶质瘤组织中基因表达水平的研究目前认为脑胶质瘤的发生是正常细胞基因组多重损伤的复杂过程,这种损伤不仅可出现癌基因的激活,而且还可能出现抑癌基因的缺失或失活.细胞癌变是个多阶段过程,可有多种基因和表基因改变,为更好地进行脑胶质瘤基因治疗的研究,国内外对脑胶质瘤组织中基因表达作了大量的研究,认识到p53基因是一种抑癌基因,而突变型p53基因为癌基因,p53基因改变与脑胶质瘤细胞的发生、发展有直接关系,是肿瘤发展到晚期的一个信号.
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小儿恶性淋巴瘤中P53及bcl-2基因表达的免疫组化研究
通过免疫组化染色检测了小儿恶性淋巴瘤中P53抑癌基因和bcl-2癌基因表达水平,探讨两种基因的改变与小儿恶性淋巴瘤发生发展的关系,为临床诊断和判断预后提供参考.报告如下.
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PHⅡ-7作用于慢性粒细胞白血病细胞k562的机制研究
目的: PHⅡ-7是以靛玉红为模板合成的一种抗肿瘤药物,并有显著逆转耐药作用。实验室前期研究发现在人慢性粒细胞白血病k562细胞中,PHⅡ-7可与烯醇化酶ENO1相结合。本研究旨在探究PHⅡ-7通过ENO1对k562细胞体外抑癌作用机制。方法构建ENO1表达稳定干扰细胞株k562-shENO1和对照细胞株k562-shCON。通过MTT法检测PHⅡ-7对k562-shCON和k562-shENO1细胞株的生长抑制作用;通过细胞计数法检测k562-shCON和k562-shENO1细胞株生长差异;采用流式细胞仪测定细胞凋亡水平。采用逆转录PCR,实时荧光定量PCR和免疫印迹技术检测相关基因表达水平。结果通过real-time-PCR和免疫印迹实验验证k562-shCON和k562-shENO1干扰细胞株成功建立。k562-shENO1和k562-shCON细胞株体外生长无显著差异,PHⅡ-7对k562-shENO1和k562-shCON细胞株IC50无显著性差异。PHⅡ-7可诱导k562-shENO1和k562-shCON细胞株凋亡,并可激活caspase3、caspase9和PARP等凋亡相关蛋白。与k562-shCON相比较,k562-shENO1细胞对高浓度PHⅡ-7诱导凋亡作用更敏感。结论烯醇化酶ENO1与PHⅡ-7在人慢性粒白血病k562细胞中作用密切相关,干扰ENO1表达能在一定程度上增强PHⅡ-7的抑癌作用。
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吸烟大鼠肺部肥大细胞与c-fos基因表达的动态观察
目的:动态观察吸烟大鼠肺部肥大细胞与c-fos基因表达情况,探讨其在吸烟病变中的作用.方法:Wistar大鼠置于气体刺激装置中进行实验,分别选2周、4周、12周、24周等时点对肺组织取材,H-E染色;采用甲苯胺蓝染色法检测与图象分析仪分析肥大细胞;支气管粘膜上皮表达FOS蛋白则采用免疫组化S-P法检测,以20个高倍视野中免疫反应阳性细胞数反应c-fos基因表达水平.结果: (1)吸烟大鼠肺组织主要为炎性病变:粘膜上皮溃疡,支气管纤毛柱状上皮坏死、脱落,部分粘膜上皮出现增生,甚至鳞状上皮化生,杯状细胞增多,粘膜下淋巴细胞、中性粒细胞以及肥大细胞侵润,平滑肌增厚.(2)吸烟大鼠肺部肥大细胞变化(个/mm2):2周2.82±1.16、4周4.58±1.23、12周5.86±1.32、24周8.02±1.89,除第2周外,其余均显著高于对照组(P<0.05).(3)吸烟大鼠FOS蛋白免疫反应阳性细胞数为(个/20视野):2周10.80±3.40、4周16.20±2.60、12周18.60±3.10、24周19.20±3.80,均明显高于对照组(P<0.05).讨论与结论:吸烟大鼠肺部出现支气管炎病理改变,在4周后出现肥大细胞增殖;2周后支气管粘膜上皮FOS蛋白免疫反应阳性细胞数增多,表明在香烟持续刺激时,c-fos基因激活而表达水平增高.c-fos基因激活和肥大细胞增殖与哮喘、肺纤维化、细胞增生及气道炎症等病变相关;提示肥大细胞与c-fos基因在吸烟所致病变和气道功能紊乱过程中充当重要角色.
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死亡受体5介导的促动脉粥样硬化形成作用
死亡受体4/5(DR4/5)是肿瘤坏死因子大家族成员TRAIL的受体。和人类不同,小鼠只有DR5基因而没有DR4基因。以往研究证实敲除TRAIL基因加重动脉粥样硬化的形成,提示TRAIL具有血管保护作用。然而DR5在介导TRAIL对动脉粥样硬化调节作用中的角色尚不清楚。我们培育了ApoE/DR5双敲小鼠。我们意外发现,敲除DR5基因并没有复制TRAIL敲除后的血管表型,相反,DR5敲除后动脉粥样硬化形成减轻。我们用外源性TRAIL处理ApoE敲除小鼠,发现TRAIL增加了动脉粥样硬化形成,而这种作用在ApoE/DR5双敲小鼠中观察不到。 TRAIL的促动脉粥样硬化作用可被CCL2加 CCL5的中和抗体所阻断。 TRAIL对小鼠单核细胞的表型没有明显改变。体外研究发现TRAIL可以通过DR5刺激巨噬细胞吞噬脂质,刺激巨噬细胞凋亡,刺激平滑肌细胞的炎症反应。为了解释TRAIL和DR5敲除后相互矛盾的血管表型,我们推测在小鼠体内TRAIL可能还具有非DR5依赖的生物学作用。在DR5+/+和DR5-/-的外周血单个核细胞中,我们用TRAIL刺激后进行了基因转录组的检测。我们发现TRAIL不但在DR5+/+细胞中引起了众多基因表达水平的变化,而且在DR5-/-细胞中也引起了基因表达的变化,而且这些变化的基因只有10%是与DR5+/+细胞重合的,提示TRAIL可能的确有非DR5依赖的作用。我们的结果首次提示DR5介导的信号通路对动脉粥样硬化形成可能具有增强作用。
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大鼠吸入NO2、SO2和香烟时肺部c-fos基因的表达研究
目的:探讨大鼠被动吸入NO2、SO2和香烟烟雾等空气主要污染物与c-fos基因激活的关系.方法:将Wistar大鼠置于气体刺激装置中,被动吸入NO2、SO2与香烟烟雾,分别在1周、2周等时点对肺组织取材,切片H-E染色;采用免疫组化S-P法检测支气管粘膜上皮FOS蛋白,以20个高倍视野中免疫反应阳性细胞数反映c-fos基因表达水平.结果:(1)大鼠肺组织主要为炎症病变为主:支气管纤毛柱状上皮变性、坏死、脱落,部分粘膜上皮出现增生,杯状细胞增多,粘膜下中性粒细胞等炎细胞侵润,肺间质充血、水肿.其中以NO2、SO2刺激的病变程度较香烟的严重.(2)支气管粘膜上皮FOS蛋白免疫反应阳性细胞数为(个/20视野):吸入NO2大鼠:1周8.1±2.8, 2周12.5±2.6; 吸入SO2大鼠: 1周6.9±3.1, 2周9.3±2.8; 吸入香烟大鼠:1周6.2±2.2, 2周10.8±3.4; 以上均显著高于对照组(P<0.05).讨论与结论:NO2、SO2与香烟烟雾作为有害刺激气体可直接损伤呼吸道,出现气管炎的病理改变.c-fos基因被称为"早期即刻原癌基因",类似于细胞活化的"信使",在NO2、SO2与香烟烟雾损伤呼吸道早期即被激活,而且气道炎症可以增强c-fos基因的表达水平,使支气管粘膜上皮FOS蛋白免疫反应阳性细胞数增加;提示c-fos基因激活在一定程度上参与有害气体损伤呼吸道,并可能是呼吸道早期损伤的标志之一.
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新型氧化石墨烯纳米粒子运载Stat3-siRNA质粒靶向治疗肝癌实验研究
目的:探讨新型氧化石墨烯纳米粒子运载Stat3-siRNA质粒靶向治疗肝癌的作用。方法:Western blot和半定量RT-PCR检测H22细胞中Stat3的蛋白以及下游基因表达水平。 HE染色观察GO-PEI-PEG-FA的安全性;TUNEL法检测原位肝癌的凋亡情况。结果:经叶酸修饰石墨烯基因载体成功将Stat3-siRNA质粒转染进细胞内;实验组Stat3的mRNA和蛋白表达明显下调;PCNA阳性表达明显下调;原位肝癌的凋亡上调。结论:经叶酸修饰氧化石墨烯纳米粒子是安全并且有效的靶向基因运载工具,可携带Stat3特异性siRNA质粒靶向进入肝癌细胞内,从而发挥抑制肝癌生长的作用。
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cDNA阵列和微阵列在鼻咽癌发生机制研究中的应用
cDNA阵列(cDNA array)或微阵列(microarray)是通过平面微细加工技术在固相表面构建的微流体分析单元和系统,它不但可高敏感地定量、定性检测基因表达水平,且其大优点是彻底改变了传统的对单个或几个基因表达水平的研究,而可同时研究同一组织或不同组织中成百上千个基因的表达情况.该技术在分析速度成千上万倍提高的同时,所需样品及化学药品却成千上万倍地减少,被认为是生命研究领域中的一次革命.