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应用基因芯片技术筛选肝细胞癌相关基因
目的:探讨基因表达谱芯片技术在筛查肝细胞癌(HCC)相关基因群表达中的作用.方法:TRIzol法抽提2例HCC及正常肝脏组织总RNA,分离纯化两种组织的mRNA;逆转录合成掺入生物素标记的cDNA合成探针,与基因芯片(涵盖了18 400个转录本,代表了14 500个明晰的基因)杂交,扫描芯片荧光信号图像,计算机分析,比较2种组织基因表达谱差异.结果:2例HCC组织与正常肝脏组织相比,有2756条基因(19.01%)共同表达差异,其中共同上调基因1772条和共同下调基因984条.对2756条共同差异表达基因作了初步功能分类,这些基因与HCC的发病机制存在相关性.结论:基因表达谱芯片技术可以筛选出HCC表达异常的相关基因群,有助于认识肝癌的发病机制.
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正常与硬化肝组织基因表达差异的初步分析
目的:了解肝硬化的基因表达概况,寻找在肝硬化及正常肝组织中差异表达基因.方法:以各24例肝硬化及正常肝组织的总RNA混合定量后反转录合成含有α-32P dATP的cDNA为探针,与Atlas微阵列表达分析膜杂交.结果:放射自显影结果经AtlasImageTM软件分析显示:在所分析的588种已知基因中,Integrin beta 7、collagen type XVⅢ等17个基因在肝硬化组织中表达上调,TFDP2、BAK、ABL等98个表达下调,参与细胞增生、凋亡、分化、细胞间相互作用、与细胞侵袭相关的基因表达水平发生了明显改变.结论:通过Atlas微阵列系统分析发现的这些基因的表达改变组成了一个肝硬化特异的基因表达谱.系统地研究肝硬化的基因表达改变,与肝硬化发生相关基因的差异变化可为肝硬化诊断和治疗提供线索.
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移植雄性骨髓的雌性小鼠肝组织肝再生相关基因的信号通路
目的:探讨骨髓形成肝细胞的分子机制.方法:采用移植♂骨髓的♀小鼠模型,♀Balb/c小鼠随机分为模型组和正常对照组,选用小鼠基因表达谱寡核苷酸芯片,利用反转录酶合成掺有荧光标记的cDNA探针,将探针与基因表达谱芯片杂交观察小鼠肝组织基因表达谱的变化,筛选样本之间杂交信号比值有差异表达的基因.采用生物信息学方法分析模型组中小鼠肝组织再生相关基因的信号通路变化规律.结果:♀小鼠在移植♂骨髓6 mo后肝组织的基因表达谱显著不同,对照组相对于正常组的差异表达基因有865条,已知功能基因有447条,其中上调基因92条,下调基因355条.与肝再生相关基因信号通路涉及HGF,TGF-β,Focal Adhesion,JAK-Stat,VEGF等信号通路,他们相关基因的上调表达促进肝细胞的增殖分化.TGF-β信号通路中相关基因下调,抑制信号通路的激活,减弱肝再生的负性作用,利于肝细胞的增殖分化.结论:♀小鼠移植♂骨髓后的肝组织基因表达谱显著变化,有可能通过其肝再生相关基因的信号通路激活或抑制调节肝再生.
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乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白研究进展
目前对乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的急性、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的治疗,还没有理想的疗效.利用新型技术对HBV感染肝细胞的相关受体蛋白进行研究,即对HBV表面抗原中蛋白结合蛋白进行筛选是一个重要的研究方向.HBV进入肝细胞之后,其基因组在肝细胞内具有顺式和反式两种调控方式HBV蛋白对肝细胞基因组的反式调节作用影响了肝细胞的基因表达谱,从而对肝细胞的生长、代谢及恶性转化产生重要影响.研究羧基末端截短的表面抗原中蛋白的结合蛋白可能是阐明HBV感染慢性化及引起肝细胞癌的重要分子生物学机制之一.
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溃疡性结肠炎相关基因研究
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种反复发作的难治性肠病,其病因和发病机制复杂,迄今尚不十分清楚,诸多基因与之密切相关.免疫功能的异常是UC发病的关键因素之一,多种细胞因子参与UC的发生发展;凋亡基因、癌相关基因与UC肠道病变及癌变密切相关;UC具有较高的遗传倾向,遗传基因表达失调;新的基因表达谱研究也显示UC与多种基因表达异常相关.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5反式调节基因的筛选
目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5的反式调节基因.方法:以分子生物学技术构建NS5ATP5的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP5,以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP5后,有17条基因表达增强,12条基因表达降低.结论:成功筛选了NS5ATP5的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP5的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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乙型肝炎病毒DNA聚合酶N末端蛋白基因芯片研究
目的:检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶N末端蛋白(TP)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TP在乙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据AF384372 HBVDNA病毒株序列设计、合成HBV DNA P-TP基因序列特异性的引物,以含有AF384372HBVDNA P全基因组cDNA的质粒G318A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HBV DNA-TP编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TP.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有TP蛋白的表达,提取高质量的mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有111个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV DNA P-TP转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TP蛋白致病的分子生物学机制提供依据.
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应用基因表达谱芯片技术筛选NS3TP1转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活基因1(NS3TP1)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步NS3TPl蛋白可能的分子生物学功能.方法:设计并合成NS3TPl基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3TP1蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-NS3TPl.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有26个基因表达水平显著上调,14个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS3TPl转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS3TPl蛋白可能的生物学功能及HCV的致病机制提供理论依据.
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基因芯片筛选肝硬化相关基因
目的:应用基因芯片技术研究肝硬化相关基因的基因表达谱.方法:乙肝肝硬化组织为实验组,以正常肝组织为对照.按一步法抽提实验组和对照组标本的总RNA并纯化mRNA;将等量的实验组和对照组标本mRNA分别逆转录合成荧光分子掺入的cDNA做探针,混合后杂交1 568点BioDoorChipLiver-16S芯片.经严格洗片后用ScanArray3000扫描仪扫描芯片获取荧光信号图像,计算机分析后比较两种组织中差异表达的基因.结果:在1 568种基因中,肝硬化组织与正常肝组织间存在差异表达的基因.所检测的3例临床标本中,2例共有的差异表达基因66-76条(4.2-4.8%),3例共有的差异表达基因28条(1.8%).其中包含有与细胞外基质降解相关的基因,与细胞生长因子有关的基因,与信号传导有关的基因等.结论:应用基因芯片技术筛选肝硬化相关基因有助于阐明肝硬化发展机制.
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应用基因表达谱芯片技术筛选NS4ATP2蛋白反式调节基因
目的:对丙型肝炎病毒非结构蛋白4A(HCV NS4A)反式激活新基因NS4ATP2转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4ATP2和pcDNA3.1(-)空载体分别转染的HepG2细胞的mRNA的差异性表达进行检测.结果:基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS4ATP2表达质粒转染的细胞有29条差异表达基因,其中12条基因表达增强,17条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、肿瘤的发生密切相关.结论:基因表达谱芯片技术对于初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS4ATP2生物学功能及HCV-NS4A的致病机制提供了理论依据.
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应用表达谱芯片技术研究NS5ATP13的反式调节基因
目的:应用基因表达谱芯片研究HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP13的反式调节基因.方法:构建NS5ATP13基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP13,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5ATP13转染的人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP13后,有86条差异基因表达,其中46条基因表达增强,40条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导、代谢、凋亡密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP13的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP13的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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基因表达谱芯片筛选双环醇作用HepG2细胞后的差异表达基因
目的:应用基因表达谱芯片技术了解双环醇在肝细胞中可能上调或下调的基因,了解其可能的调节功能线索.方法:以双环醇处理HepG2细胞,同时以二甲基硫氧化物(DMSO)处理的相同细胞系作为对照;24h后制备细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果:经基因表达谱芯片分析,12种基因的表达水平上调,9种基因的表达水平下调.结论:筛选到的一些与细胞周期、蛋白质的翻译合成、能量代谢、体内免疫调节、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的起重要作用及肿瘤发生相关的基因,推测了双环醇可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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应用表达谱芯片技术筛选HBcAg反式调节基因
目的:筛选与克隆HBcAg激活基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:以分子生物学技术构建HBcAg的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBcAg,以表达质粒pcDNA3.1(-)-HBcAg转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HBcAg表达质粒pcDNA3.1(-)-HBcAg经酶切鉴定和DNA测序鉴定正确.经基因表达谱芯片分析,29种基因的表达水平上调,17种基因的表达水平下调.结论:筛选到一些与细胞内信号传导、免疫调节、细胞凋亡、蛋白质翻译合成、肿瘤发生相关的HBcAg反式调节的靶基因.
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基因表达谱芯片技术筛选TAHCCP1转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TAHCCP1在肝细胞中上调或下调的基因,探索其可能的调节功能.方法:设计并合成TAHCCP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TAHCCP1基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的TAHCCP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP1,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA,逆转录为cDNA,应用基因表达谱芯片技术对两组间差异表达mRNA进行检测和分析.结果:在筛选的1 152点cDNA芯片中,有110种基因的表达水平上调(占9.55%),98种基因的表达水平下调(8.51%),包括一些与体内免疫调节、脂类代谢、蛋白质的翻译合成、氧化反应、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的基因.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了TAHCCP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TAHCCP1蛋白可能的生物学功能提供依据.
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基因表达谱技术从消化道肿瘤基础研究到临床转化
基因表达谱技术是进行全基因组功能研究的一种新技术新方法,也是生命科学与信息科学相结合的一种综合性研究技术手段.基因表达谱在消化道肿瘤研究中,就针对其基因功能、发病机制、基因网络调控及生物学特性等方面进行了深入的基础性研究,同时也已转化应用于临床病理诊断、鉴别诊断、分子分型、靶向治疗等方面的探讨.但要对这一转化过程中不断产生的海量数据进行充分的挖掘与利用,对现有基因表达数据库进行有效的规范化建设与管理,应逐步实现数据共享,加强基因表达谱技术质量控制,才能使基因表达谱技术在未来的研究中得到健康、稳定和快速的发展.
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乙型肝炎病毒蛋白反式激活基因的研究
0引言乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生、发展过程密切相关[1-5 ].病毒进入到肝细胞之后,肝炎病毒蛋白在肝细胞内不是孤立存在的,病毒基因组在肝细胞内具有两种调控方式:其一是顺式调节,如启动子及增强子序列,以直接方式影响另外一些基因组的功能,是基因组内部调节方式;其二是反式调节,即基因组中一部分基因片段通过其转录或翻译产物产生对另一部分基因片段表达的调节方式,如病毒基因组表达的反式激活蛋白,以其表达产物的间接方式参与另外一些基因的功能调节,可以对基因组内部的基因片段,甚至可以对另外细胞或病毒的基因组有调控作用.这种病毒蛋白对肝细胞基因组的反式调节作用,影响了肝细胞的基因表达谱,是病毒感染慢性化以及引起感染的肝细胞发生恶性转化的重要的分子生物学机制之一[6-8].
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6上调新生多肽相关复合物α多肽基因的表达
目的:探讨HCV核心蛋白结合蛋白6对新生多肽相关复合物α多肽启动子的激活作用.方法:以基因表达谱芯片技术筛选HCBP6表达质粒转染HepG2细胞后的差异表达基因为基础,利用生物信息学技术确定NACA的启动子区域(NACA-p),聚合酶链反应(PCR)扩增NACA-p,克隆至真核表达载体pCAT3中,构建pCAT3-NACA-p表达载体;以该质粒转染COS-7、NIH3T3细胞系,用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;与pcDNA3.1(-)-HCBP6共转染NIH 3T3细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:质粒pCAT3-NACA-p在NIH 3T3、COS-7细胞中能够激活CAT的表达;共转染实验中pCAT3-NACA-p+pcDNA3.1(-)-HCBP6组CAT的表达活性是pCAT3-NACA-p的4倍.结论:pCAT3-NACA-p具有启动子活性;HCV核心蛋白结合蛋白6对NACA-p有激活作用.本研究为探讨HCV核心蛋白结合蛋白6的功能提供新的实验及理论基础.
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基因表达谱芯片筛选NS5ATP3转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP3的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的分子生物学功能.方法:设计并合成NS5ATP3基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP3编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP3.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有6个基因表达水平显著上调,18个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP3转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的生物学功能提供依据.
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表达谱基因芯片技术研究甘草甜素上调白介素-18基因的表达
目的:了解甘草甜素调节白介素-18(IL-18)基因启动子的活性,为甘草甜素的作用机制提供理论依据.方法:应用基因表达谱芯片技术对于甘草甜素刺激HepG2细胞之后的基因表达谱进行研究.聚合酶链反应(PCR)扩增IL-18基因启动子,命名为IL-18P.以T-A克隆法,将IL-18P基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pT-IL-18P,与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnI和Bg1Ⅱ双酶切后构建IL-18启动子报告基因表达载体pCAT3-IL-18P,以重组表达质粒pCAT3-IL-18P瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,甘草甜素刺激后24 h后收获细胞.用酶联免疫黏附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性.结果:表达谱基因芯片研究结果表明,甘草甜素可上调IL-18基因表达水平达2.815倍.构建的报告载体pCAT3-IL-18P经过序列分析和酶切鉴定正确.pCAT3-IL-18P和甘草甜素瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是CAT3空载体的7.7倍,pCAT3-IL-18P的1.5倍.结论:甘草甜素可以上调IL-18启动子的活性,进而上调IL-18基因的表达.为深入了解甘草甜素的免疫调节作用及其在病毒的清除过程中的作用机制提供新的理论依据.
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筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白4B转染细胞差异表达基因
目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达基因,进一步阐明NS4B蛋白在丙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成HCV NS4B基因序列特异性的引物,以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS4B蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HCV NS4B编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS4B.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有NS4B蛋白的表达,提取高质量的mRNA并逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有22个基因表达水平显著上调,34个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HCV NS4B转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS4B蛋白致病的分子生物学机制提供依据.