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番鸭细小病毒免疫原蛋白基因的序列测定与分析
番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus MDPV)病是近十年来在我国华南、华东等地饲养的番鸭中普遍流行的一种急性传染病。该病毒的基因组有两个阅读框架,左阅读框主要编码病毒的非结构蛋白;而右阅读框主要编码病毒结构蛋白。其中VP2结构蛋白具有免疫原性,是病毒刺激机体产生保护性抗体的重要抗原蛋白。此外,有研究报道,细小病毒具有肯定的抑瘤活性。其对人类的多种转化细胞和癌细胞有选择性地杀伤作用,而对正常的细胞无可检测的影响。这意味着通过在分子水平上对细小病毒的深入研究,将有可能为人类癌症疾病的治疗开辟一条新的途径。MDPV-Q株是从具有典型临床症状和病理变化的雏番鸭体内分离得到的野毒,经鉴定为番鸭细小病毒。为了解我国分离株与国外分离株之间的异同关系以及为今后研制开发MDPV的基因工程疫苗,我们借助于PCR引物设计软件,设计了一对引物LHMP7/LHMP8,该对引物选取位于2 885~2 900及4 618~4 604的两段序列,跨幅为1 734 bp,同时在这2条引物中分别加入2种限制性核酸内切酶SacII和 KpnI的酶切位点,使扩增后的DNA片段的两端,分别含有这两种酶的酶切位点,以利于鉴定和今后的亚克隆。应用PCR技术扩增了MDPV-Q株的VP2蛋白基因片段。将扩增后的VP2蛋白基因重组到pMD18-T载体上,并对插入片段进行序列测定。测序结果表明,我国分离的MDPV的VP2蛋白基因序列与国外分离株具有很高的同源性,达98.1%。
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Apoptin-肿瘤基因治疗的新选择
人类肿瘤是在各种致瘤因子的作用下,局部组织的细胞在基因水平上对其生长失去正常调控,导致克隆性异常增生而来.其机制,一般认为是由于细胞原癌基因的激活和/或抑癌基因的失活造成的.当上述基因非正常表达的时候,细胞的正常增殖、分化和凋亡等一系列生命过程出现异常,既表现为细胞的无限增殖、分化不良与凋亡减少.结果新生细胞不断产生、细胞的生存期延长.凋亡率下降使细胞数目不断增加导致局部生长优势,形成肿瘤.除了肿瘤细胞自身过度增殖以外,凋亡的异常在肿瘤发生、发展、结局等过程中起重要作用.因此,促进肿瘤的凋亡可能是肿瘤的一有效治疗途径.Apoptin由鸡贫血病毒(CAV)基因组中Vp3基因编码,可特异性的诱导转化细胞和肿瘤细胞凋亡且其凋亡作用不依赖于野生型p53也不受Bcl-2过渡表达的影响.Apoptin不杀伤人类正常二倍体细胞亦无毒副作用.此种特性向我们展示了其在肿瘤治疗领域诱人前景.
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3种镍化合物转化细胞中DNA损伤的研究
[目的]探讨3种不同的镍化合物转化细胞中是否存在DNA链断裂和DNA-蛋白质交联等DNA损伤,进一步揭示不同溶解度镍化合物的相对致癌性.[方法]以培养液为溶剂对照,B(a)P为阳性对照,3种镍化合物转化BALB/c-3T3细胞中的DNA链断裂研究采用单细胞凝胶电泳试验(彗星试验),DNA-蛋白质交联物的检测则应用125I-后标记技术.[结果]不溶性结晶型硫化镍(NiS)和2种水溶性镍化合物(NiCl2和NiSO4)在中等细胞毒性反应剂量水平上所诱导的BALB/c-3T3转化细胞中,与非转化对照细胞(DNA慧星尾长13.4±1.75 μm)比较,有明显的DNA链断裂和DNA-蛋白质交联形成,其中以NiS所致的遗传损害为显著,表明DNA链断裂和DNA-蛋白质交联这两项遗传终点是有用的生物标志,并与镍的细胞转化及其相对致癌作用相关.[结论]除了不溶性NiS具有强致癌性外,部分水溶性镍化合物如NiCl2也具有较强的致癌作用,部分解释了不同种类镍化合物的细胞转化作用及其相对致癌性.
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人腺病毒E4转录区ORF4蛋白与细胞凋亡
人腺病毒基因早期转录区4的第4开放阅读框架编码的E4 ORF4蛋白是一种多功能病毒调节蛋白,能够特异地引起转化细胞的凋亡,而对正常细胞没有影响,并且这种凋亡机制不依赖于经典的p53途径。E4 ORF4蛋白功能的发挥需要与细胞内蛋白磷酸酶2A的相互作用,而且它还能改变Src激酶的活性。E4 ORF4蛋白的多种功能协调合作,终导致了转化细胞的凋亡。
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端粒酶逆转录酶RNA干扰增加肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体活性
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNFα-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)为肿瘤坏死因子家族成员,与TNFα和Fas配体不同的是它仅诱导病毒感染细胞、转化细胞和肿瘤细胞凋亡,不引起炎症反应而杀伤正常细胞.TRAIL诱导大多数肿瘤细胞凋亡,但也有部分肿瘤细胞不敏感,且TRAIL对不敏感的肿瘤细胞有促增殖作用[1].
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生存素在大肠癌变中表达及与临床病理特征的关系
生存素(survivin)是一种独特的哺乳类凋亡抑制蛋白(IAP)家族成员,具有独特的组织表达差异性,它在胚胎和屯胎儿组织中强烈表达,在成熟的终末分化的组织中不表达,但重新表达于多种转化细胞和肿瘤组织中.这种独特的表达特点使肿瘤的靶向性治疗成为可能[1].我们应用免疫组化SP法检测正常大肠黏膜,腺瘤伴不典型增生和大肠癌中生存素蛋白的表达情况,并分析其与大肠癌临床病理特点的关系,探讨其在人类大肠癌的作用和意义.
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转化生长因子-β与甲状腺
转化生长因子-β(Transforming growth factor-β, TGF-β)是一种多肽生长因子,其活性形式由两条相同多肽链(112个氨基酸)经二硫键相连的二聚体组成,分子量为25KD,可由多种正常细胞和肿瘤组织产生.在人体中,TGF-β存在三种异构体,即TGF-β 1,2,3.其特异性高亲和力受体分为Ⅰ、Ⅱ两型,是跨膜丝/苏氨酸激酶,广泛分布于非转化细胞膜上.TGF-β主要通过自分泌和旁分泌机制调节组织细胞的功能.其生物学功能异常复杂,在组织细胞的增殖、分化、间质形成和损伤修复中起着关键作用.本文重点介绍TGF-β与甲状腺生理和病理之间的内在联系.
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在细胞球内BPV转化细胞抗凋亡的细胞间诱导研究
目的:(1)建立"凋亡的细胞间诱导"的球体细胞培养实验系统,(2)在该系统中研究BPV的致癌机制.方法:采用三维立体细胞培养技术,制作以转化细胞为核心,正常细胞为外壳的细胞球,模拟体内肿瘤细胞生长于正常细胞间的情形,观察癌基因src、化学致癌剂甲基胆蒽及BPV转化细胞在细胞球中凋亡产生情况.结果:在球体细胞培养实验系统中,在src转化细胞产生凋亡的条件下,甲基胆蒽转化细胞同样能产生凋亡,而BPV转化细胞则抵抗了由周围正常细胞所致的凋亡.结论:(1)"凋亡的细胞间诱导"在球体细胞培养实验系统中,即在近似体内的条件下,不需要外源性TGF-β的参与同样可以产生,球体细胞培养实验系统是理想的研究近似体内条件下"凋亡的细胞间诱导"的模型,(2)由于BPV转化细胞能抵抗"凋亡的细胞间诱导",因此可以作为BPV致癌机制一种解释,即BPV不仅能诱导细胞转化,而且能保护已经转化的细胞不被"凋亡的细胞间诱导"所清除.
关键词: 凋亡的细胞间诱导 三维立体细胞培养(细胞球) 转化细胞 牛乳头状瘤病毒 -
膜糖脂与恶性肿瘤
膜糖脂是存在于细胞质膜和内膜的糖脂,并以鞘糖脂类的神经节苷脂(Ganglioside,Gls)为主。近年来的研究表明,不论是化学致癌物诱导的、还是病毒癌基因转化的肿瘤细胞,其膜糖脂的组成、数量以及在膜上的分布均发生特异性的改变。现将膜糖脂与恶性肿瘤的关系作一简要综述。1 恶性肿瘤中膜糖脂的异常表达1.1 膜糖脂合成受阻 Gls合成受阻的原因是某一种糖基转移酶的活性由于致癌转化而降低或丧失。结果是正常细胞中应有的Gls减少或丧失,同时还有前体物质的堆积[1]。在早期的研究中,比较了培养的正常成纤维细胞与病毒转化的成纤维细胞的鞘糖脂组成,结果发现转化细胞的糖脂谱较为简单,这是由于一个或几个糖基转移酶受阻,不能(或不能完全)合成较高级糖脂的缘故。典型的例子包括仓鼠BHK-21细胞中GM3合成受阻(唾液酶转移酶I被阻断)。小鼠成纤维细胞中较高级Gls的合成受阻(GalNAc转移酶被阻断)。
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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体研究进展
目前认为,肿瘤的发生发展除了与细胞增殖失控和细胞分化异常有关外,另一个重要原因是发生转化的细胞不能正常凋亡,而细胞凋亡(又称程序性死亡)是基因编程调控的细胞自主性死亡过程.已知多种因素参与诱导和抑制细胞凋亡.而细胞表面的受体和配体相互作用在诱导凋亡中起主导作用.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apop-tosis inducing ligand,TRAIL)或称凋亡素2配体(Apo-2ligand,Apo2L)是近几年来发现的肿瘤坏死因子家族新成员,能选择性诱导转化细胞、肿瘤细胞和病毒感染细胞发生凋亡,而对正常组织无明显损伤,因而成为目前研究的热点.本文就其结构、功能及抗肿瘤研究新进展等方面综述如下.
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TRAIL、DcR1、DR4、Caspase-3与bcl-2在直肠癌及癌旁组织中的表达及其意义
TRAIL也称Apo-2L(Apoptosis-2 Ligand)是Wiley研究小组于1995年早克隆和命名的又一TNF家族成员.大量研究发现TRAIL主要引起肿瘤细胞或病毒感染细胞、转化细胞的凋亡,而不影响正常细胞的生长分化[1-3].我们应用免疫组织化学方法观察TRAIL及DcR1、DR4受体、Caspase-3、bcl-2在直肠癌、癌旁6 cm组织,及正常直肠黏膜组织中的表达,探讨TRAIL在直肠癌中的作用机制.
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硅转化BALB/c-3T3细胞基因组DNA异常甲基化的研究
目的对硅转化细胞基因组DNA异常甲基化进行研究,探讨硅的表遗传致癌机制.方法从结晶型硅(Si)转化BALB/c-3T3细胞中提取基因组DNA,经Mse1(甲基化非敏感性酶)单独消化或Mse1和BstU1(甲基化敏感性酶)联合消化,消化产物用甲基化敏感性内切酶指纹法(MSRF)进行分析,差异显示出异常甲基化基因片段,进一步将异常甲基化DNA片段亚克隆和序列测定,再与基因文库中的基因进行类比分析.结果发现硅转化细胞存在6条异常甲基化DNA(其中1条为高甲基化,5条有低甲基化现象),序列测定显示这些异常甲基化基因片段似乎来源于一些RNA转录和蛋白质翻译等基因家族.结论 DNA异常甲基化会导致基因表达激活或抑制,因此硅转化细胞基因组某些功能基因DNA异常甲基化导致的异常表达,可能间接是硅诱导细胞转化及其致癌作用的一种表遗传机制.
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镍化合物诱发细胞恶变过程中的P53基因的变化
目的 探讨三种镍化合物在诱发细胞恶变过程中不同阶段P53基因突变情况,并比较它们之间的差异。方法 三种镍化合物转化细胞接种BALB/c裸鼠,应用PCR-SSCP法进行肿瘤细胞和转化细胞P53基因第5~8外显子检测。结果 硫化镍组一个经软琼脂筛选的转化细胞系和相应的肿瘤细胞系P53基因第8外显子检出突变。氯化镍组的肿瘤细胞系第6外显子检出突变。结论 本文说明了镍化合物诱发细胞恶变的晚期发生P53基因突变。
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长期低剂量镉致正常肝脏细胞异常增殖及其与caspase-8甲基化的关系
目的:应用L-02细胞建立长期低剂量镉转化细胞模型。观察转化细胞形态学变化,检测转化细胞增殖、凋亡和甲基化的改变,探讨长期低剂量镉导致细胞转化的机制。方法:采用MTT法、形态学分析、Western blot、细胞克隆形成、流式细胞术、限制性内切酶酶切电泳和MSP。分组:对照组、CDT-L-02组、5-aza组和CDT-L-02+5-Aza组。结果:(1)1μmol/L氯化镉培养L-02细胞第2周时,细胞长轴逐渐变长;10周时,细胞从方形变成长梭形;与对照组相比,转化细胞DNMT1表达稳定升高, caspase-8表达稳定下降。与对照组L-02细胞相比,转化细胞的增殖率,克隆形成率明显升高。(2)转化细胞在甲基化抑制剂5-Aza的作用下,与对照组相比,增殖率明显下降,凋亡率明显增加;DNMTs、caspase-8与凋亡和周期相关蛋白的表达在5-Aza的作用下恢复到对照组的水平;基因组和caspase-8基因启动子甲基化的水平也有所恢复。结论:长期低剂量镉能促进正常肝细胞L-02增殖增加,凋亡减少,导致正常细胞发生转化,其机制是提高了基因组DNA和caspase-8基因启动子甲基化的水平。
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TRAIL在树突状细胞杀伤肿瘤细胞中的作用及其机制的研究
TNFα相关的凋亡诱导配体(TNFα-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)是TNF家族中与CD95L同源性高的新型凋亡分子,与CD95L一样,能够诱导多种肿瘤细胞的凋亡;但与TNFα、CD95L不同的是,它对机体正常组织不具有明显的毒性作用,只选择性地杀伤肿瘤细胞或转化细胞,由于这个特点,它目前在肿瘤免疫研究中倍受重视.
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三种镍化合物诱发转化细胞恶性度的鉴别与分析
目的:利用已建立的三种镍化合物体外转化细胞进行裸鼠体内成瘤实验研究,比较它们恶性度的差异.方法:三种镍化合物转化细胞接种BALB/C裸鼠,进行肿瘤细胞和转化细胞的透射电镜及扫描电镜观察.结果:硫化镍,氯化镍,硫酸镍分别诱发的转化细胞都能在BALB/C裸鼠皮下形成肿瘤,病理组织学检查确定为纤维肉瘤.经扫描电镜与透射电镜观察瘤细胞形态与转化细胞有一定差别.结论:本文进一步说明了三种镍化合物所诱发的细胞转化为恶性转化,且都具有体内致瘤性.
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p21WAF1/CIP1的功能研究新进展
细胞周期由周期蛋白和周期蛋白依赖激酶(cyclin2dependent kinase,CDK)的相互作用而完成.尤其是G1期过渡到S期受细胞周期负调节因子家族周期蛋白依赖激酶抑制因子(eyclin-dependent kinase inhibitots,CDKI)的调节,其在体外通过与CDKs,cyclins或cyclin-cdks复合物的结合达到抑制CDK催化外源性底物的活性.两个家族:CIP家族和INK4家族.p21WAF1是CIP家族中的一员.转化细胞中p2lWAF1/CIP1的表达对增长停滞起关键性作用[1].
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骨唾液蛋白的糖基化与功能
骨唾液蛋白(bone sialoprotein,BSP)是细胞外基质中的一种酸性糖蛋白,主要由成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞合成,其含量约占骨细胞外基质中非胶质蛋白质的15%[1-2].BSP的分布相对局限,主要在矿化组织特异性表达.在胎盘滋养层细胞、血小板和多种骨转移瘤中也能检测到BSP的表达.近年来的研究表明,BSP具有细胞黏附性能,参与细胞黏附、细胞转移和信号识别,不仅能介导成纤维细胞、成骨细胞和破骨细胞黏附于骨基质表面,BSP以及与整合素受体结合还直接影响癌转化细胞的转移能力,并对血管生成有促进作用.
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转化生长因子α与肺纤维化关系研究进展
1980年被正式命名的转化生长因子α(TGF-α)是由50个氨基酸组成的单链多肽,与表皮生长因子(EGF)共用EGF受体(EGFR),属于表皮生长因子家族一员.TGF-α广泛分布于肿瘤细胞、转化细胞、胚胎组织中,在肺纤维化发生、发展中亦有着重要作用.其受体分子靶向药物EGFR酪氨酸激酶抑制剂在肿瘤治疗领域已经取得了令人瞩目的成绩,能否有益于肺纤维化的治疗值得关注.
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TGF-β1与肝纤维化的关系再探讨
转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)是一簇具有多种功能的蛋白多肽,广泛存在于动物正常组织细胞以及转化细胞中,以骨组织和血小板中含量为丰富.目前至少发现有5种异构体,分别命名为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5[1](其中肝脏中含量高并有牛物活性的是TGF-β1).正常情况下,TGF-β1的表达极少,而肝损伤时其表达明显增加,是肝纤维化形成的关键因子.