中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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不同品系小鼠骨髓间质干细胞扩增能力及细胞表型差异的比较
背景:虽然近年来对小鼠骨髓间质干细胞分离培养的报道层出不穷,但就其方法而言,有的操作步骤过于繁琐,有的不适用于国内相关实验,如采用一系列抗体负选或利用自行研制的新抗体筛选.目的:拟建立简便稳定的小鼠骨髓间质干细胞体外分离和扩增的方法,并比较不同品系小鼠骨髓间质干细胞的生物学特点.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2007-04/09在中山大学中山医学院病理生理教研室完成.材料:清洁级6周龄雄性C57BL/6和BABL/C小鼠各5只,由中山大学中山医学院实验动物中心提供.方法:取两种品系小鼠双侧股骨,去除股骨上附带组织,用含10%FCS的DMEM培养基冲洗骨髓腔,过200目不锈钢网,收集骨髓细胞,用Tris-NH4C1红细胞裂解液溶解2 min,用含10%FCS的DMEM培养基调整细胞浓度,按500个细胞/孔低密度接种于24孔板,置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中.出现成纤维样细胞克隆后消化收集并移至6孔板,待细胞70%～80%融合时消化传代.主要观察指标:细胞形态和生长特点,流式细胞仪检测细胞表型,茜素红染色观察成骨诱导情况,油红O染色观察成脂诱导情况.结果:约培养2周可形成细胞克隆,经历一缓慢扩增阶段后,第6～7代细胞生长明显加快,可见形态均一的成纤维细胞群,呈典型的旋涡状生长,两种品系小鼠骨髓问质干细胞均可传至10代以上,但C57BL/6小鼠骨髓间质干细胞体外扩增能力更强.C57BL/6和BABL/C小鼠骨髓间质干细胞均呈CD45 CD11b CD117,CD44和Sca-1呈阳性表达,可连续表达MHC-Ⅰ,少量表达CD80,此外前者可少量表达MHC-Ⅱ,而后者几乎不表达MHC-Ⅱ.两者体外均能够向成骨、成脂方向分化.结论:通过低密度培养技术可简单方便的体外分离并扩增C57BL/6和BALB/c小鼠骨髓间质干细胞.两品系小鼠骨髓间质干细胞均易向成骨成脂分化,但在扩增能力、细胞表型上略有不同.
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转化生长因子β1诱导以纤维连接蛋白作为生长基质的神经干细胞迁移实验
背景:如何使移植入脑的或自体激活的神经干细胞在迁移途中能大量存活并准确到达病灶部位,以修复和替代受损组织,是应用神经干细胞治疗神经系统损伤的关键问题.目的:观察转化生长因子β1对以纤维连接蛋白为生长基质的神经干细胞定向迁移的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-03/11存佳木斯大学神经科学研究所完成.材料:选取同基因背景Wistar大鼠72只,随机数字表法分成3组:模型对照组、单纯神经干细胞移植组、转化生长因子β1与纤维连接蛋白包被的神经干细胞联合移植组(简称联台移植组),每组24只,移植后1,3,7,14 d每个时间点6只.方法:各组大鼠均采用Zea Longa线栓法建立局灶性脑缺血模型.单纯神经干细胞移植组在左侧侧脑室注入5μL己标记Brdu的神经干细胞悬液.联合移植组在左侧感觉运动皮质区注入100 μg/L的转化生长因子2μL:左侧侧脑室注入5μL已标记Brdu的纤维连接蛋白包被神经干细胞悬液,各组分别于移植后1,3,7,14d取脑组织制备切片.主要观察指标:Brdu标记的的神经干细胞在宿主脑内的迁移.结果:体外培养的神经干细胞移植到人鼠脑缺血模型后,在侧脑室下区,移植1 d时,各实验组均有细胞存活,3 d时细胞逐渐增加.到7 d时,Brdu阳性细胞从侧脑室大量迁出,侧脑室下区阳性细胞数明显增多达到高峰,联合移植组的阳性细胞数多于其他两组,且迁移趋势明显,在皮质区,神经干细胞移植3 d时迁移到皮质区的细胞数开始增加,7 d时达到高峰,各时间点均多于对照组,差异有显著性.并且到达皮质区的神经干细胞终能分化为神经元.结论:转化生长因子β1可以促进以纤维连接蛋白作为生长基质的神经干细胞定向迁移.转化生长因子β1与纤维连接蛋白在诱导神经干细胞迁移方面可能有协同效应.
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成骨细胞共育环境下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨特性
背景:既往研究倾向于分析骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,以及分化过程中的影响因素,涉及成骨细胞对骨髓间充质干细胞分化影响的报道较少.目的:在与成骨细胞共培养的条件下,观察大鼠骨髓间充质干细胞的成骨特性.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2007-01/08在广州中医药大学附属骨伤科医院细胞室完成.材料:1 d龄清洁级SD乳鼠10只,购自中山大学动物实验中心;3月龄SPF级SD大鼠6只,购自广州中医药大学动物实验中心.Transwell双层细胞培养板为Coming公司产品.方法:取SD乳鼠颅盖骨,胰蛋白酶+胶原酶多次消化分离培养扩增成骨细胞.取SD大鼠股骨和胫骨,用DMEM培养液冲洗骨髓腔,冲出液体过滤后按1:1滴加于淋巴细胞分离液上层,离心吸取液面交界处的单个核细胞,调整骨髓间充质干细胞浓度为1×10S/cm,接种后胰蛋白酶消化扩增.Transwell双层细胞培养板的隔膜孔径为0.4 μ m,共培养组于培养上室接种成骨细胞,对照组培养上室未接种细胞,两组培养下室均于预处理的盖玻片上接种骨髓间充质干细胞,培养20 d.主要观察指标:酶联免疫吸附法检测培养上清中骨形态发生蛋白2含量、骨碱性磷酸酶活性、骨钙素含量及钙化结节数.结果:与对照组比较,第15天共培养组上清中骨形态发生蛋白2的含量显著升高(P＜0.01),第20天共培养组上清中骨碱性磷酸酶含量、骨钙素含量及钙化结节数均明显升高(JP＜0.05或0.01).结论:体外构建的成骨细胞.骨髓间充质干细胞共培养模型一定程度上模拟了体内成骨环境,与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞成骨能力增强.
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视网膜下移植骨髓间充质干细胞对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的影响
背景:目前视网膜缺血再灌注损伤仍没有一个理想的治疗方案,组织细胞工程尤其是干细胞工程的兴起为视网膜损伤的治疗提供了新思路.目的:以视网膜电图b波、视网膜形态学、神经节细胞密度及内层视网膜厚度为指标,观察骨髓间充质干细胞视网膜下移植对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的影响.设计、时间及地点:完全随机对照实验,于2007-01/12在潍坊医学院眼科研究所完成.材料:选择清洁级Wistar成年大鼠48只.方法:采用密度梯度离心法培养骨髓间充质干细胞.将48只大鼠按随机数字表法分为4组,每组12只.缺血再灌注损伤组采用Daniel法制备视网膜缺血再灌注损伤模型:缺血再灌注损伤后24 h,骨髓间充质干细胞移植组视网膜下移植 Hoechst33324标记的骨髓间充质干细胞2×108L-1;磷酸盐缓冲液组输注等量的磷酸盐缓冲液;正常对照组不做任何处理.主要观察指标:缺血再灌注损伤后6 h,24 h,3 d,7 d,14 d,28 d动态检测各组视网膜电图b波;缺血再灌注损伤后28 d荧光硅微镜下观察骨髓间充质干细胞移植组视网膜Hoechst33324阳性细胞表达情况;缺血冉灌注损伤后28 d处死各组大鼠,分别对视网膜进行苏木精一伊红、尼氏染色观察,检测并比较各组神经节细胞密度及视网膜内层厚度的变化.结果:缺血再灌注损伤后各时间点缺血再灌注损伤组大鼠视网膜电图b波逐渐降低,均显著低于正常对照组(P＜0.01);缺血再灌注损伤后28 d骨髓间充质干细胞移植组视网膜电图b波显著高于缺血再灌注损伤组(P＜0.01).缺血再灌注损伤后28 d骨髓间充质干细胞移植组视网膜各层均可见Hoechst阳性细胞,核染成蓝色.缺血再灌注损伤组视网膜神经节细胞密度与内层视网膜厚度显著小于正常对照组与骨髓间充质干细胞移植组(P＜0.05～0.01),缺血再灌注损伤组与磷酸盐缓冲液组差异无显著性意义(P＞0.05).结论:视网膜缺血再灌注损伤后24 h骨髓问充质干细胞视网膜下移植,可以改善视网膜电图b波、增加神经节细胞密度及内层视网膜厚度,从而达到减轻视网膜缺血再灌注损伤的目的.
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骨髓间充质干细胞对哮喘小鼠CD4+CD25+调节性T细胞及气道炎症的影响
背景:CD4+CD25+调节性T细胞功能降低、数量下降已被公认为是哮喘患者免疫失调的重要表现.间充质干细胞具有免疫调节功能,可上调CD4+CD25+调节性T细胞,抑制淋巴细胞增殖,并已在许多免疫性疾病方面成功应用.目的:观察骨髓间充质干细胞移植对哮喘小鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞及气道炎症的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006 09/2008 05在中山大学附属第二医院中心实验窜完成.材料:SPF级BALB/c小鼠34只,其中3～4周龄雄鼠4只,用于制各骨髓间充质干细胞;6周龄雌鼠30只,随机分为正常对照组、模型对照组、细胞移植组,10只/组.方法:模型对照组、细胞移植组以500mg/L卵白蛋白溶液0.2mL腹腔注射致敏.以50g/L卵白蛋白溶液雾化吸入激发建立小鼠哮喘模型.正常对照组以生理盐水代替卵白蛋白溶液,细胞移植组在诱导哮喘的第10天经尾静脉注入体外分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:流式细胞仪检测小鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞占淋巴细胞的比例,并检测小鼠支气管肺泡灌洗液中的炎症细胞总数,计数嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞,结合病理切片分析气道炎症情况.结果:与正常对照组比较,模型对照组外周血CDM+CD25+调节性T细胞占淋巴细胞的比例明显降低(t=7.742,P＜0.05);与模型对照组比较,细胞移植组该比例明显升高(t=7.455,P＜0.05).3组小鼠支气管肺泡灌洗液炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞计数比较差异显著(P均＜0.05):两两比较,模型对照组支气管肺泡灌洗液炎症细胞总数高于正常对照组(p＜0.05),细胞移植组支气管肺泡灌洗液炎症细胞总数低于模型对照组(P＜0.05).正常对照组小鼠气道无明显炎症改变:模型对照组小鼠支气管、血管粘膜下和周围肺组织有明显炎症细胞浸润、气道上皮增生、气道黏液增多、气道上皮部分断裂脱落;细胞移植组小鼠气道炎症明显减轻.结论:静脉输注骨髓间充质干细胞能上调哮喘小鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞比例,同时可一定程度上抑制哮喘小鼠气道炎症.
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组织块培养的人脐带源性间充质干细胞的生物学特性
背景:间充质干细胞主要来源于骨髓,但骨髓源性间充质干细胞存在病毒污染的可能,且随年龄增长其细胞数量和扩增分化能力会出现明显下降,因此需要寻找新的间充质干细胞来源.目的:拟采用组织块培养法从人脐带中分离间充质干细胞,并观察其生物学特性.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-03/2008-05在吉林大学白求恩医学院组胚教研室完成.材料:脐带来自正常足月产健康婴儿,产妇及家属均知情同意.方法:采用组织块法分离培养和扩增间充质干细胞:将脐带剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小组织块,置于培养瓶中,并在组织块表面覆盖载玻片防止其漂浮,加入含体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养液培养.细胞贴壁后,每隔三四天更换培养基,待细胞出现集落生长达60%以上汇合后,弃组织块,消化后,按1:2～1:3的比例传代.取第7代细胞在含地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油、含体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养液与含体积分数为0.10胎牛血清、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、1-甲基-3-异丁基一黄嘌呤、抗坏血酸、青霉素和链霉素的DMEM/F12培养液中诱导其成骨及成脂分化.主要观察指标;光、电镜观察获得的人脐带源性间充质干细胞形态,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期、免疫表型,碱性磷酸酶染色及油红0染色鉴定细胞分化能力.结果:组织块贴壁后1周可见多数呈长梭形或扁平形的成纤维样细胞,2周后,细胞形态变为均一的纺锤形.透射电镜观察第5代和第7代细胞均为幼稚形态的细胞,细胞膜表面不光滑,核大,不规则,核仁明显,常染色质多,异染色质少,胞浆少,胞浆内可见较多游离核糖体,此外还可见粗面内质网和线粒体.流式细胞术分折细胞周期显示,第3,5,7代70%以上的细胞处于Go/G1期;第3,5,7代细胞均强烈表达CD105、CD90、CD44,不表达CD34、CD31、CD45.第7代细胞在体外可定向诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞.结论:采用组织块培养法可从人脐带中分离出具有间充质干细胞特性的细胞.
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骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子165双基因转染小鼠骨髓基质干细胞的体内诱导成骨
目的:观察骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子165双基因转染的小鼠骨髓基质干细胞是否具有异位诱导成骨能力.方法:脂质体介导下将pIRES-BMP2-VEGF165导入小鼠骨髓基质干细胞,用RT-PCR和免疫组织化学法观察骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因在小鼠骨髓基质干细胞内的表达;将转染双基因的小鼠骨髓基质干细胞植入裸鼠大腿后群肌袋内,4周后用影像学和组织学方法观察体内诱导成骨效果.结果:转染pIRES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质干细胞扩增出1.2 kb及590 bp两条带,胞浆中有棕黄色颗粒阳性信号.该细胞植入裸鼠大腿后群肌袋4周后有大量异位骨形成.结论:转染骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因的小鼠骨髓基质干细胞具有较强诱导异位成骨能力.
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改良五黄油对体外人表皮干细胞生长的影响
背景:烧伤创面外用药物五黄油具有抑菌、促进创面愈合的作用,但长期临床应用发现该制剂在止痛、抑制瘢痕形成等方面疗效不确切,且促进表皮牛长作用仍有待加强.目的:观察加入黄芪、粉防己碱的改良五黄油不同药物浓度和药物作用时间对人表皮干细胞体外生长增殖的影响.设计、时间及地点:对比观察实验,于2005-10/2006-10在南昌大学医学院烧伤研究所细胞培养实验室完成.材料:2-12岁患者包皮环切术后的新鲜包皮(患者对实验内容均知情同意,并自愿捐献),改良五黄油工作液及五黄油工作液由南昌大学第一附属医院药剂科提供.方法:将不同质量浓度的改良五黄油(0,0.15,0.20,0.25,0.30 g/mL)分别加入体外培养的表皮干细胞中,并于5个不同时相点(2,4,6,8,10 d),以五黄油为对照组进行MTT细胞生长增殖检测,观察对细胞增殖影响程度.主要观察指标:利用MTT法在酶标仪上分别测定各组表皮干细胞的增殖率.结果:以0,0.15,0.20,0.25,0.30 g/mL质量浓度药物作用人表皮干细胞,其增殖程度与改良五黄油的质量浓度正相关性;改良五黄油在0.25g/mL和0.30 g/mL质量浓度,相同作用时间(4,6,8 d)对表皮干细胞的增殖率高于五黄油,差异有显著性意义(P＜0.01).结论:在一定的体外作用时间范围内,改良五黄油对表皮干细胞的促增殖能力与药物质量浓度呈正相关;改良五黄油对体外表皮干细胞的增殖效果好于五黄油.
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骨髓间充质干细胞提取方法的改良
背景:目前从大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞仍以密度梯度离心法为主,虽可提取较纯的骨髓间充质干细胞,但步骤较繁琐,容易污染,且较昂贵.目的:试图寻找一种经济、方便及可靠的骨髓间充质干细胞提取方法.设计、时间及地点:以细胞为对象的对比观察实验,于2008-02/04在南方医科大学珠江医院中心实验室完成.材料:10只健康SD大鼠一侧前后肢提取出的骨髓间充质干细胞为实验组,另一侧前后肢提取出的骨髓间充质干细胞为对照组.方法:将实验组骨髓在含体积分数为0.10～0.15的胎牛血清,100IU/mL双抗及0.1%hepes液的DMEM培养基中培养,用注射器进行吹打,使骨髓与培养基充分混匀,吸取混合液,通过200目的筛网滤过后将其置于培养瓶中培养,提取较纯的骨髓间充质干细胞,对照组采用传统的密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞.主要观察指标:传代至第3代时,采用流式细胞仪鉴定提取的细胞,并从形态及数量上比较两种方法提取的细胞差异.结果:两种方法提取的骨髓间充质干细胞形态无明显差别,流式细胞仪检测通过改良法提取的细胞CD29+、CD44+、CD45-,可鉴定为骨髓间充质干细胞.两组间骨髓间充质干细胞数量无明显差异(P＞0.05).结论:实验采用的改良提取方法具有经济、操作简便等特点,是较为理想的大鼠骨髓间充质干细胞提取方法.
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自体外周血造血干细胞移植治疗实验性自身免疫性重症肌无力模型大鼠
背景:自体外周血造血干细胞移植作为近年来一种新的方法,被广泛应用于自身免疫性疾病的治疗,但其治疗重症肌无力还处于初步阶段. 目的:拟建立重症肌无力自体外周血干细胞移植大鼠模型,观察其临床症状、重复神经电刺激动作电位衰减率及血清乙酰胆碱受体Ab滴度变化.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-07/12在郑州大学医学院人体解剖实验室完成.材料:选剧Wistar雌性大鼠50只,按随机数字表法分为4组,正常组10只,佐剂对照组10只,干细胞移植组15只,模型对照组15只.方法:正常组不做任何处理:佐剂对照组给予等量生理盐水和环磷酰胺:干细胞移植组大鼠采用腹腔注射重症肌无力患者血清的方法制备实验性自身免疫性重症肌无力大鼠模型,粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞,采集外周血干细胞,环磷酰胺预处理大鼠后经尾静脉回输:模型对照组仅给予等量的外周血,其余处理同干细胞移植组.主要观察指标:观察干细胞移植后各组大鼠的游泳时间及成活率;检测干细胞移植后第4,9周的重复神经电刺激动作电位衰减率及血清乙酰胆碱受体Ab滴度.结果:①干细胞移植组大鼠的存活率高于模型对照组(P＜0.05).②模型对照组大鼠游泳时间明显短于正常组和佐剂对照组(P＜0.05),干细胞移植后第9周千细胞移植组大鼠的游泳时间明显比第4周延长(P＜0.05).③干细胞移植后第4周,干细胞移植组和模型对照组大鼠的肌电波幅递减幅度高于正常组和佐剂对照组(P＜0.05).④模型对照组大鼠的血清乙酰胆碱受体Ab滴度高于正常组(P＜0.05),干细胞移植后第9周干细胞移植组的血清乙酰胆碱受体Ab滴度低于第4周(P＜0.05).结论:实验成功制备出了重症肌无力干细胞移植动物模型.
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不同种类自体骨髓干细胞移植对梗死心肌左室重构的效果比较
背景:骨髓干细胞移植可改善心功能、预防心室重构,目前用于移植的成体骨髓干细胞有骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞等,不间种类的骨髓干细胞移植后的效果及具体机制尚不清楚.目的:比较自体骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞冠状动脉移植对急性心肌梗死后心室重构的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-03/2006-12在河北省人民医院临床研究中心、河北医科大学电镜室及大连宝生物进行.(basic fibroblast growth factor,bFGF)材料:36只冀中白猪随机分为4组:假手术组6只、模型组10只、骨髓单个核细胞组10只、骨髓间充质干细胞组10只.方法:采用梯度密度离心法分离培养猪自体骨髓单个核细胞,以贴壁法分离培养猪自体骨髓间充质干细胞,移植前均行胶体会标记.除假手术组外,其余3组均以球囊导管压迫冠状动脉前降支的方法建立猪急性心肌梗死模型.造模后90min,经导管由冠状动脉腔内骨髓单个核细胞组移植自体骨髓单个核细胞(6.0±1.3)×107个,骨髓间充质干细胞组移植自体骨髓间充质干细胞(4.5±2.1)×107个,培养28d.主要观察指标:光镜及电镜观察心肌组织病理学改变:超声检查心功能变化:免疫组织化学检测心肌血管数、心肌细胞凋亡、心肌组织核凼子κB及肌钙蛋白Ⅰ阳性表达情况,及其与心功能的关系:RT-PCR法检测心肌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGE)mRNA的表达,及其与心功能的关系.结果:①骨髓间充质干细胞组在梗死区、梗死边缘区均可见大量血管增生,冠脉血管周围可见异常细胞团生长,骨髓单个核细胞组有较多的毛细血管"芽生"现象.②细胞移植前各组心功能指标基本相似(F=1.550,P＞0.05).移植后28 d与模型组比较,其余3组左心室射血分数均明显降低(F=5.30,P＜0.05).③与模型组比较,骨髓单个核细胞组梗死区及梗死边缘区的血管数明显增加(F=29.56～34.87,P＜0.01),骨髓间充质干细胞组无变化;移植细胞两组的梗死区、梗死边缘区心肌细胞凋亡率均显著降低(F=14.31～35.34,P＜0.01),肌钙蛋白Ⅰ阳性率均明显升高(F=19.05,P＜0.01);梗死边缘区核因子κB阳性率均明显降低(F=19.05,P＜0.01).④骨髓单个核细胞组梗死边缘区VEGF基因的表达显著高于模型组、骨髓间充质千细胞组(F=49.41,P＜0.01).骨髓问充质干细胞组梗死边缘区bFGF基因的表达显著高于模型组、骨髓单个核细胞组(F=4.71,P＜0.01).⑤左室射血分数与心肌细胞凋亡率、心肌核因子κB呈负相关(r=-0.4411,P＜0.05;r=-0.5796,P＜0.01);与血管数、VEGF及bFGF表达呈正相关(r=0.775,P＜0.01;r=0.5651,P＜0.05;r=0.573 5,P＜0.05).结论:经冠脉自体骨髓单个核细胞或骨髓间充质干细咆移植均可减轻心肌梗死后左心室重构,心功能的改善与干细胞移植后增加心肌血管数量及心肌VEGF,bFGF表达、减少心肌细胞凋亡及核因子κB水平有关.骨髓单个核细胞移植促心肌血管增生及.VEGF的表达均优于骨髓间充质干细胞,而后者促bFGF基因表达的作用优于前者.
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痿症方联合嗅鞘细胞移植对脊髓慢性压迫损伤后神经营养素3表达的影响
背景:中药痉证方、痿证方具有促进神经营养因子分泌的作用已经诸多实验结果证实,而脊髓功能恢复与神经营养素3的表达与分泌有密切的关系.目的:实验拟观察痿症方联合嗅鞘细胞移植对脊髓慢性压迫损伤后神经营养素3的影响.设计、时间及地点:对照动物实验,细胞学观察,于2005一11/2007 03在上海中医药大学脊柱病研究所完成.材料:新生SD雄性大鼠10g采用酶消化法培养嗅鞘细胞.3月龄雄性SD大鼠以螺钉持续性压迫大鼠C4脊髓的方法建立脊髓慢性压迫动物模型.痿症方由上海中医药大学脊柱病研究所提供,成分为炙黄芪、党参、炒白术、当归.方法:造模1个月后分为:模型组,后路椎板减压,继续喂养2个月:DF12培养液组:注入等剂量DMEM/Ham's F-12培养基,继续喂养2个月.嗅鞘细胞组:嗅鞘细胞移植,按1μL/点在距离脊髓压迫区域上下0.5 mm处取4点注射109 L-1嗅鞘细胞,注入速度为1μ L/min,继续喂养2个月.含药血清培养嗅鞘细胞组:进行经症方含约血清培养的嗅鞘细胞移植,按1μL/点脊髓内注射109 L-1嗅鞘细胞,注入速度为1μL/min,继续喂养2个月.中药灌胃组:瘘症方[l]约连续灌胃1个月,继续喂养1个月.设寺正常对照组.主要观察指标:应用ELISA抗原竞争法、PT-PCR疗法榆测各组大鼠神经营养素3蛋白及mRNA的变化.结果:与模犁组、DF一12培养液组比较.痿疗方和嗅鞘细胞移植治疗后脊髓组织中神终营养素3蛋f1及神经营养索3 mRNA表达均明显增加.痿症方含药血清培养的嗅鞘细胞移植与单纯嗅鞘细胞移植相比,脊髓组织中神经营养索3蛋F1及神经营养素3 mRNA表达增加明辊.与单纯瘘症方相比,痿症方含药血清培养的嗅鞘细胞移植脊髓组织中神经营养素3增加不明显,差异不显著,神经营养素3 mRNA表达差异显著(P<0.01).结论:痿症方和嗅鞘细胞移植均可促进脊髓组织中神经营养素3的表达,但痿症方含药血清培养的嗅鞘细胞与单纯痿症方治疗相比.结果未能在体现出差异.
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pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞
背景:骨形成蛋白2是骨基质中重要骨生长因子,主要生物学作用是促进未分化的间充质细胞和骨系细胞的募集和分化,是骨生成的启动因子,可以作为骨修复基因治疗的理想目的基因.目的:使用前期已经构建成功的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞.设计、时间及地点:细胞学观察实验,于2007-12/2008-06在新疆医科大学自治区地方病分子牛物学实验室完成.材料:良种新两兰大白兔由新疆医科大学动物试验中心提供,pIRES2.EGFP.BMP-2由奉校分子生物学实验室构建、保存.方法:采用贴壁法及密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞.采用脂质体介导转染法将pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞.主要观察指标:通过荧光显微镜、反转录聚合酶链式反应、免疫组织化学及Western免疫印迹检测其转录、表达活性.结果:转染的兔骨髓间充质干细胞细胞可见绿色荧光蛋白的持续表达,绿色荧光蛋白分布于整个细胞.呈胞浆分布,说明重组载体构建成功并能在体细胞中表达.转染pIRES2-EGFP-BMP-2的兔骨髓间充质干细胞经G418抗性筛选并传代、培养4周后,RT-PCR反应可扩增出112 kb条带,大小与预期相符合.Western免疫印迹检测显示,经pIRES2-EGFP-BMP-2转染的兔骨髓间充质干细胞经在相对分子质量为30×103处显现单一特异性条带,表明为骨形成蛋白2基因表达产物.免疫组织化学显示,转染pIRES2-EGFP-BMP-2后经G418抗性筛选并传代、培养4周后的兔骨髓间充质干细胞细胞质中有棕黄色颗粒阳性信号.结论:用pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒成功转染兔骨髓间充质干细胞并获得表达.
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脐血源神经干细胞移植修复脊髓损伤的神经功能变化:51例效果评估
背景:神经干细胞移植使脊髓损伤患者重新站起来成为可能,但对脊髓损伤临床应用尚无深入系统的报道.目的:评估脐血源神经干细胞移植对51例脊髓损伤恢复期患者神经功能的影响.设计、时间及地点:自身前后对照观察,于2005-09/2007-07在广东医学院附属深圳南山医院完成.对象:选择同期在广东医学院附属深圳南山医院康复医学科住院的全部外伤性脊髓损伤恢复期患者64例,男47例,女17例,年龄14-66岁,病程5个月～31年,全部患者既往均接受过针灸、推拿或运动疗法等康复训练,但残留感觉、运动功能缺失及自主经功能紊乱等功能障碍.实验所用脐血源神经干细胞由深圳市北科细胞工程研究所提供技术支持.方法:患者蛛网膜下腔推注脐血源神经干细胞悬液1.0-2.0 mL,细胞数量(1.5-3.0)×1010L-1.细胞移植后配合针灸、推拿、运动疗法等综合康复训练,2次/d,30 min/次,1个疗程为8周.治疗后ASIA分级不变,ASIA感觉或运动评分增高为有效.主要观察指标:临床疗效,移植前后AISA评分及体感诱发电位潜伏期波幅的变化,不良反应.结果:51例进入ASIA感觉及运动功能结果分析,19例进入体感诱发电位结果分析.细胞移植后2个月,有效率15%(8/51),AISA评分无明显变化(z=-2.836-2.719,P＞0.05),少数患者体感诱发电位潜伏期波幅有微弱缩短的趋势(z=一3.651～-3.204,P＜0.05).1个疗程以内头痛3例,头晕、呕吐、胸闷、皮疹各1例,出现血象增高等情况,予抗炎及降温处理后,症状均得到缓解,血象恢复正常.结论:神经干细胞移植短时期内无法改善脊髓损伤患者的神经功能,但可能会改善其感觉功能.
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SOX-9真核表达质粒转染兔骨髓基质细胞的可行性
背景:SOX-9在软骨组织的发生和发育中具有重要作用,可促进间充质细胞凝集,具有转录激活结构域,能直接调控转录.目的:选用SOX-9基因构建pDC316-SOX-9质粒转染兔骨髓基质细胞,观察SOX-9基因对骨髓基质细胞生长特性及产物表达的影响.设计、时间及地点:细胞基因工程体外实验,于2006-06/2007-01在中国科学院北京基因组研究所完成.材料:SPF级6周龄新西兰大白兔8只,用于分离培养骨髓摹质细胞.方法:采用脂质体介导法将构建的pDC316-SOX-9质粒转染兔骨髓基质细胞,细胞转染分为SOX-9质粒转染组、空质粒组、只加入等量脂质体的空白对照组.主要观察指标:通过细胞形态、细胞生长活性、免疫组织化学及HE染色、RT-PCR法、EUSA法检测SOX-9基因转染骨髓基质细胞是否成功.结果:pDC316-SOX-9质粒转染4 d出现小片的细胞集落,挑取克隆扩增培养后,细胞呈梭形纤维状.随转染时间的延长.空白对照组细胞逐渐死亡,SOX-9质粒转染组、空质粒组的细胞活性均显著延长,在转染2周达高峰,之后逐渐降低.转染第6天,SOX-9质粒转染组骨髓基质细胞免疫组织化学染色呈棕黄色,稳定表达SOX-9蛋白,HE染色可见多个双核细胞,细胞增殖旺盛,与成软骨细胞类似:空质粒组无SOX-9蛋白表达,组胞增殖分裂不旺盛.SOX-9质粒转染组表达SOX-9 mRNA,宅质粒组及空白对照组均无SOX-9mRNA表达.转染后24,48,72h及1,2周,SOX-9质粒转染组细胞上清液中SOX-9含量均明显高于空质粒组、空白对照组(P＜0.01).结论:利用pDC316-SOX-9质粒成功转染兔骨髓基质细胞,增强细胞生长活性,并能持续稳定的分泌SOX-9蛋白,可诱导骨筒基质细胞向软骨方向分化.
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人骨关节炎关节软骨间充质祖细胞的免疫磁珠分选和鉴定
背景:从骨关节炎关节软骨中分离培养软骨细胞,再用免疫磁珠分选技术从关节软骨中分选软骨祖细胞,并进行鉴定,经作者检索目前国内没有报道.目的:实验选取人工膝关节置换患者软骨组织体外培养并利用免疫磁珠法分离出具有干细胞特性的软骨间充质祖细胞,拟进一步验证在人软骨组织中含有间充质祖细胞.设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2007-06/12在解放军第三军医大学毒理教研室及西南医院烧伤科实验室完成.材料:标本取材于解放军第三军医大学西南医院关节外科中心同期收治的10例人工膝关节置换患者软骨组织(＞3 cm).患者对治疗及实验均知情同意.方法:统一选用原发性骨关节炎患者关节软骨标本,采用免疫磁珠法分选获得CD105/CD166阳性细胞.并进行成软骨和成脂诱导分化.主要观察指标:①免疫磁珠分选细胞用流式细胞仪和免疫组织化学检测,观察细胞生长特性.②分选细胞成骨和成脂分化后细胞形态和功能的变化.结果:①免疫磁珠分选的关节软骨间充质祖细胞原代和传代细胞均具有干细胞的生长特性.②分选的细胞免疫组织化学检测表达CD105和CD166阳性染色,流式细胞仪检测CD105和CD166阳性细胞比例分别为98.72%和97.5%.④分选细胞经成软骨、成脂诱导后能分化为具有相应细胞表型的细胞.结论:人关节软骨组织中存在具有干细胞特性的软骨间充质祖细胞,利用免疫磁珠技术可成功地将其从关节软骨细胞中分离出来.
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绿色荧光蛋白转染大鼠骨髓间充质干细胞及体外向神经元样细胞的分化
背景:成年骨髓间充质干细胞诱导后在体外可分化为神经元样细胞,利用细胞转染技术让其表达绿色荧光蛋白,便于在动物模型体内跟踪观察.目的:观察增强型绿色荧光蛋白转染的骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞的能力,拟为增强型绿色荧光蛋白基因作标志物对外源性骨髓间充质干细胞进行体内追踪做准备.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-06在中国医科大学医学分子生物学国家重点实验室完成.材料:清洁级成年Wistar大鼠32只,由中国医科大学实验动物部提供.增强型绿色荧光蛋白质粒为Sigma公司产品.方法:取大鼠两侧股骨及胫骨,Percoll密度梯度离心+贴壁法体外分离培养骨髓间充质干细胞,达90%融合后消化传代扩增.由脂质体介导,将含有增强型绿色荧光蛋白质粒cDNA转入骨髓间允质干细胞,经G418筛选后,按0.4×109 L-1接种,加入含FBS、碱性成纤维细胞生长因子的DMEM预诱导24 h,更换培养液后再以含BHA、DMSO的无血清DMEM诱导5 h～6d.主要观察指标:荧光显微镜观察细胞转染情况,免疫细胞化学染色检测转染细胞诱导后神经元表面抗原的表达.结果:携带增强型绿色荧光蛋白基因的骨髓间允质干细胞生长旺盛,转染24h后在细胞核中就可见弥散绿色荧光,转染48 h后绿色荧光更加集中,在细胞核中聚集成团块、颗粒状,体外培养3个月后仍能够高水平表达增强型绿色荧光蛋白.与未转染细胞比较,转染细胞诱导后其神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、巢蛋白阳性率均无明显变化(P＞0.05),胶质纤维酸性蛋白呈阴性表达.结论:骨髓间充质干细胞体内能稳定、高效和持久地表达增强型绿色荧光蛋白,转染后生物学性状未发生改变,体外在细胞因子和氧化剂的诱导作用下仍可以分化为神经元样细胞.
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半乳凝素1诱导脑损伤大鼠内源性神经干细胞原位增殖及定向分化
背景:半乳凝素1表达于室管膜下区的星形胶质细胞中并诱导其分化,分化的星形胶质细胞可明显提高脑源性神经生长因子的产生.目的:观察半乳凝素1诱导脑损伤大鼠内源性神经干细胞的原位增殖和定向分化效果.设计、时间及地点:细胞学体内观察实验,于2007-03/11在佳木斯大学神经科学研究所完成.材料:纯种清洁级成年Wistar大鼠48只,随机分为模型组、药物组,24只/组.半乳凝素1为北京晶美生物工程公司产品.方法:两组大鼠均采用线栓法制作局灶性大脑中动脉闭塞模型.造模后24h,药物组经右侧侧脑室注入10μ L浓度为0.2g/L的半乳凝素1,模型组注射等量生理盐水.分别于缺血再灌注后3,7,14,28 d处死大鼠,取脑组织制作石蜡切片,处死前1 d腹腔注射Brdu.主要观察指标:免疫组织化学染色检测海马齿状同颗粒细胞层下区Brdu和巢蛋白阳性细胞的表达,免疫荧光双标法检测海马齿状回颗粒细胞层下区胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达.结果:模型组脑缺血后3 d Brdu、巢蛋白阳性细胞开始增加,7 d增殖达高峰,14 d后表达开始下降,28 d后下降甭低.药物组脑缺血后3 d两种阳性细胞均明显增加;7 d增殖达高峰,半定量分析Brdu、巢蛋白阳性细胞数分别是模型组的1.8倍和2倍;14 d后开始下降;28 d降至低,但仍明显多于模型组(P＜0.05).脑缺血后各时间点两组Brdu+/胶质纤维睃性蛋白+细胞基本相似(P＞0.05);药物组脑缺血7 d Brdu+/神经元特异性烯醇化酶+细胞开始大量增多.28 d达高峰,半定量分析所有BrdU+细胞中约27%表达神经元特异性烯醇化酶,明显高于模型组(JP＜0.05).结论:半乳凝素1在大鼠脑缺血后可激活内源性神经干细胞的原位增殖及分化.且分化后表达成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶阳性细胞明增多.
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自体造血干细胞移植治疗急性髓系白血病77例
背景:急性髓系白血病采用化疗方案效果欠佳,而异基因造血干细胞移植虽然是有效的治疗方法,但寻找到HLA相合的供者概率较低,且易发生严重并发症.目的:评价自体造血干细胞移植对急性髓系白血病的改善效果.设计、时间及地点:回顾性病例分析,于1989-01/2007-03在解放军总医院血液科完成.对象:选取急性髓系白血病患者77例,中位年龄27.6岁,均同意行自体造血干细胞移植,实验经医院医学伦理委员会批准.单次造血干细胞移植72例,其中自体外周血造血干细胞移植21例、自体骨髓移植51例:移植前CR1期69例,CR2期2例,CR3期1例.双次造血干细胞移植5例,其中均为自体骨髓移植1例,其余4例分别为首次进行骨髓移植和第2次进行自体外周血造血干细胞移植,移植前均为CR1期.方法:骨髓移植患者按单个核细胞(0.8-1.5)×108/kg采集骨髓细胞,外周血干细胞移植患者在联合化疗后行粒系-巨噬集落刺激因子动员,当白细胞＞5.0×109L-1时采集造血干细胞.骨髓移植及外周血干细胞移植患者回输单个核细胞中位数分别为2.62×108/kg,4.03×108/kg.25例患者行TLI预处理方案,47例患者行TBI预处理方案,5例患者行不含TBI的高剂量化疗预处理方案.9例患者给予移植后治疗,接受VP/MM维持化疗3例,接受白细胞介素2+干扰素α免疫维持治疗4例,三者联合维持化疗2例.移植后每3个月进行随访,定期检测血常规、骨髓象等变化.主要观察指标:移植后造血重建情况、存活情况以及维持治疗对患者骨髓功能的影响.结果:所有患者均获得髓系造血重建.72例单次自体造血干细胞移植患者无病存活42例,其中移植前CR1期41例,CR3期1例,至今无病存活率58.3%;5例双次自体造血干细胞移植患者至今无病存活4例.定期进行血象和骨髓象复查,均未发现移植后维持治疗对患者骨髓功能有明显影响,患者对维持治疗的耐受性良好.结论:自体造血干细胞移植治疗急性髓系白血病安全有效,可改善难治急性髓系白血病患者预后.
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兔自体骨髓间充质干细胞移植覆盖骨膜修复关节软骨缺损:与单纯骨膜覆盖及空白对照的比较
背景:目前软骨缺损主要通过自体软骨移植来治疗,患者不易接受.随着组织工程的兴起,间充质干细胞成为研究的焦点.多数学者认为动态应力、低氧环境和一些生长因子是骨髓间充质干细胞向软骨方向分化的有利因素,这使人自然地想到关节腔微环境.目的:建立一种骨髓间充质干细胞的分离培养方法,将自体骨髓间充质干细胞移植于兔关节软骨损伤区并用骨膜覆盖,建立关节腔微环境,观察损伤修复的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-07/2007-07在山西医科大学第二医院骨科实验室完成.材料:选用24只新西兰大白兔,制备全层关节软骨损伤模型.方法:采集兔骨髓间充质干细胞,密度梯度离心法对其进行分离纯化,体外贴壁培养扩增.将24只大白兔按随机数字表法分为3组(n=8),未诱导的骨髓间充质干细胞+骨膜覆盖组在关节软骨缺损区植入未诱导的骨髓间充质干细胞并用骨膜覆盖;单纯骨膜覆盖组用骨膜覆盖缺损区;空白对照组不作处理. 主要观察指标:分别于术后6,12周取材,观察兔软骨损伤的修复情况.结果:①自体骨髓间充质干细胞移植后6周.未诱导的骨髓间充质干细胞+骨膜覆盖组软骨损伤区已由透明软骨样修复组织填充,术后12周软骨和软骨下骨得到良好修复,修复组织进一步改建,免疫组织化学结果证实修复组织内产生了Ⅱ型胶原.②单纯骨膜覆盖组损伤区有部分修复,基底和表面细胞成分较多.③空白对照组由纤维组织修复,但基底也可见少量软骨样细胞.结论:3组结果比较后,认为以体外培养扩增的兔骨髓间充质干细胞复合骨膜移植可促进关节软骨损伤的修复,在尚无更为完善的治疗方法出现之前,利用此法修复损伤关节软骨不失为一种有效的技术.
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缺氧预处理脂肪基质细胞对心肌细胞凋亡的影响
背景:近年来人们发现了一种脂肪来源的基质干细胞,将其移植到发生梗死的动物心肌中可以改善心功能,其机制除分化为心肌、内皮细胞外,对宿主心肌细胞仃无直接作用尚需进一步研究.目的:观察缺氧预处理脂肪基质干细胞对心肌细胞凋亡的影响并探讨其机制.设计,时间和地点:完全随机区组设计的细胞分子学实验,于2007一12/2008-06在南昌大学第一附属医院高血压病研究所完成.材料:胶原酶I、红细胞裂解液购自Invitrogen公司(美国),Dulbecco改良Eagle培养基、胎牛血清,胰蛋白酶购自GIBCO公司(美国).方法:选用雌性SD大鼠10只,取大鼠脂肪组织用胶原蛋白酶I消化后培养获得脂肪基质干细胞,流式细胞术鉴定其表型.乳鼠5只用于培养乳鼠心肌细胞.根据培养环境分为4组,分别应用DMEM、常规培养脂肪基质干细胞上清、缺氧培养脂肪基质千细胞上清和渥曼青霉素进行培养,应用DMEM组为对照组.4组细胞均在缺氧条件下(02、CO2、N2体积分数分别为0.02,0.05,0.93)培养3 d.主要观察指标:AnexinV/PI双染色法测定心肌细胞的凋亡率,Western blotting法测定心肌细胞蛋白激酶、磷酸化蛋白激酶蛋白表达.结果:培养获得的脂肪基质干细胞.表型为CD44+CD90+CD31CD45.对照组心肌细胞凋亡率明显高于常规脂肪基质干细胞组和缺氧脂肪基质干细胞组(P＜0.01),缺氧脂肪基质干细胞组心肌细胞凋亡率明显低于常规脂肪基质干细胞组(P＜0.05).渥曼青霉素组心肌细胞凋亡率与对照组比较,差异无显著性意义(P＞0.05).缺氧脂肪堆质干细胞组磷酸化蛋白激酶/蚩白激酶比值明显高于对照组和常规脂肪基质干细胞组(P＜0.01).渥曼青霉素组磷酸化蛋白激酶/蛋白激酶比与对照组比较,差异无显著性意义(P＞0.05).结论:缺氧预处理脂肪基质干细胞能提高对心肌细胞凋亡的保护,其机制可能和脂肪基质干细胞分泌细胞因子激活P13一K/蛋白激酶信号通路有关.
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大鼠骨髓和脂肪来源间充质干细胞的成骨特性比较
背景:尽管骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞均具有向骨和软骨分化潜能,但终究带有各自来源组织的特点,那么是否意味着两者在非基因影响下成骨特性存在一定差异呢?目的:比较大鼠骨髓和脂肪来源的间充质干细胞在体外成骨分化中的特性区别.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-07/2008-03在中国科学院昆明动物研究所国家级重点实验室完成.材料:6周龄和18周龄SD大鼠各2只,分别用于制备骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞.方法:选取第3代骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,按5×107L-1接种后各分为2组:诱导组加入含10-8mol/L地塞米松、10 mol/L β-甘油磷酸、50 mg/L维生素C的成骨诱导培养基1.5 mL,未诱导组不加入成骨诱导培养基.主要观察指标:碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果,碱性磷酸酶和骨钙素定量分析结果.结果:成骨诱导7,14d,经诱导的骨髓基质干细胞和脂肪间充质干细胞呈碱性磷酸酶阳性,有钙结节形成,未诱导组呈阴性.成骨诱导3,7,10d,未诱导组间比较碱性磷酸酶及骨钙索含量均基本相似(P＞0.05);与未诱导组比较,脂肪间充质干细胞诱导组碱性磷酸酶及骨钙袭含量均明显升高(P＜0.05),骨髓间充质干细胞诱导组升高幅度更为显著(P＜0.001).结论:大鼠骨髓来源间充质干细胞体外成骨性能强于脂肪来源间充质干细胞,在骨组织工程种子细胞的选用中应优先考虑前者.
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胰蛋白酶差速脱壁法分离纯化人表皮干细胞
背景:表皮干细胞对于修复皮肤缺损具有重要意义,但如何方便、快捷地对所获取的表皮干细胞进行纯化培养一直没有比较好的技术方法.目的:拟应用胰蛋白酶差速脱壁法去除表皮干细胞中混杂的成纤维细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-06在解放军军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室完成.材料:实验所用皮肤来源于20一30岁女性乳房缩小整形术患者,由北京协和医院整形外科提供.方法:无菌条件下切取皮肤,剪除皮下脂肪组织,采用胶原酶/Dispase酶和胰蛋白酶两步法体外分离培养表皮干细胞.待细胞生长达70%～80%融合时,加入胰蛋白酶消化尚未脱壁的细胞,30 s～1 min后吸出脱壁细胞,同法传代培养至第5代细胞.主要观察指标:第1,5代表皮干细胞表面标志CD29、CIM9f、CD71的表达.流式细胞仪检测第5代细胞生长周期.免疫荧光检测第5代表皮干细胞和传代时胰蛋白酶消化30 s～1 min即脱壁细胞角蛋白19及波形蛋白的表达.透射电镜观察表皮干细胞超微结构.结果:第1代表皮干细胞CD29阳性率94.32%,CD49f阳性率86.24%,CD71呈弱阳性,经过4次胰蛋白酶差速脱壁去除混杂细胞后,第5代表皮干细胞CD29阳性率96.77%,CD49f阳性率96.31,CD71呈弱阳性,82.58%表皮干细胞处于G0～G1期.第5代表皮干细胞角蛋白19呈阳性,波形蛋白呈阴性,而传代时胰蛋白酶消化脱壁的细胞角蛋白19呈阴性,波形蛋白呈阳性,证实为成纤维细胞.表皮干细胞呈克隆样生长,透射电镜下胞质中可见呈束状排列的角蛋白丝.结论:应用胰蛋白酶差速脱壁法能够简单,有效地获取纯化的表皮干细胞.
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丹参诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化及相关基因的表达
背景:骨髓间充质干细胞在适当的诱导条件下,可在体内外分化为神经细胞与神经前体细胞,但多数研究多以含血清及细胞因子的培养基为诱导剂.目的:以丹参作为诱导剂,观察骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化前后相关基因的表达,拟寻找新的诱导方法.设计:以细胞为观察对象的重复观察测量,对照性体外实验.单位:四川大学基础与法医学院人体解剖教研室.材料:实验于2004-10/2005-12在四川大学基础与法医学院人体解剖教研室完成.为四川省重点实验室.SD大鼠,体质量150～200 g,由本校动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.丹参注射液由安徽天洋药业有限公司提供,批号20050411.方法:采用密度梯度离心和细胞贴壁法培养骨髓间充质干细胞,取第5代细胞进行诱导.用丹参注射液诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,对照组以不含丹参注射液的无血清培养液进行培养.采用RT-PCR检测诱导前后细胞ngn-1,mash-1的表达,免疫组织化学检测诱导前后的骨髓间充质干细胞NSE和GFAP的表达.主要观察指标:①RT-PCR检测细胞诱导前后ngn-1,mash-1的表达.②免疫组织化学检测诱导前后的骨髓间充质干细胞NSE和GFAP的表达.结果:①骨髓间充质干细胞贴壁生长情况良好,大部分细胞贴壁呈长梭形.加入诱导剂后,细胞体秘缩小,部分细胞有突起,形状类似神经元.②RT-PCR反应检测显示,未经诱导的骨髓间充质干细胞ngn-1,mash-1mRNA为阴性,诱导后呈阳性表达.③细胞免疫组织化学检测显示,诱导后的细胞NSE和GFAP呈阳性反应,对照组为阴性.结论:丹参注射液能够诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化.
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紫绀型先天性心脏病患儿外周血内皮祖细胞的体外分离培养和鉴定
背景:一些基础研究成果对于新生血管形成和内皮祖细胞的自动募集机制已做出了合理的解释,体外培养的内皮祖细胞可分化为成熟的内皮细胞,有助于血管内皮修复.目的:拟建立从紫绀型先天性心脏病患儿外周血获取内皮祖细胞的方法.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08/2008-04在中南大学湘雅二医院完成.材料:外周血来源于2007-10/12中南大学湘雅二医院胸外科收治的15例法洛四联症患儿,安静状态下末梢氧饱和度为(78.0±5.0)%.方法:采用Ficoll密度梯度离心法从外周血中分离单个核细胞,以含体积分数为0.2的胎牛血清、4 mg/L牛脑垂体提取物、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL氨苄青霉索、100g/L硫酸链霉素的M199培养基进行体外诱导分化,调整细胞密度为2×109L-1,接种至预铺人纤维连接蛋白的6孔培养板,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下,贴壁法纯化培养10d.主要观察指标:细胞形态和生长情况,Di1标记的乙酰化低密度脂蛋白/FITC标记的荆豆凝集素双荧光染色鉴定结果,vWF、CD34及CD31免疫组化鉴定结果,PE标记CD133抗体与藻蓝蛋白标记KDR抗体免疫荧光鉴定结果,透射电镜观察内皮祖细胞特征细胞器.结果:接种后0.5 h细胞贴壁生长,培养第7天形成典型的细胞集落,第14天呈铺路石样外观,细胞数量级可达108.培养第10天,贴壁细胞中70%呈Di1标记的乙酰化低密度脂蛋白/FITC-UEA-I双阳性,为正在分化的内皮祖细胞:vWF、CD34及CD31免疫组化染色均呈阳性表达:PE标记CD133抗体呈红色荧光,藻蓝蛋白标记KDR抗体呈蓝色荧光.透射电镜可见内皮祖细胞特征性幼稚线粒体及Weibel-Palade小体.结论:实验成功从紫绀型先天性心脏病患儿外周血中分离培养并获取高纯度的内皮祖细胞,且在体外稳定快速扩增.
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骨髓间充质干细胞移植联合冠心Ⅱ号对大鼠急性心肌梗死心功能和血管新生的影响
背景:虽然大量的实验和临床研究均证实骨髓间充质干细胞应用于心脏修复的安全性和有效性,但心肌梗死后缺血缺氧的环境及早期炎症反应均不利于移植细胞的存活,致使其治疗效果受到限制.目的:观察冠心Ⅱ号联合骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死模犁鼠心功能及血管新生的影响,探讨两者是否具有协同治疗作用.设计,时间及地点:随机对照动物实验,于2006-08/2008-01在广西医科大学科学实验中心和中国中医科学院西苑医院基础医学研究中心完成.材料:清洁级雄性SD大鼠78只,由广西医科大学动物实验中心提供.冠心Ⅱ号汤剂由中国中医科学院中药研究所仝燕老师制备完成并提供.方法:取4只大鼠双侧股骨骨髓,应用全骨髓法+差速贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代行CM-DiI标记.取10只大鼠作为正常对照组,余64只建立急性心肌梗死模型,造模后随机均分为4组,模型组、冠心Ⅱ号组在心肌梗死区及边缘区分5点注射L-DMEM培养基,前组用生理盐水灌胃,后组以冠心Ⅱ号汤剂灌胃,1次/d,共7 d:细胞移植组、联合组在心肌梗死区及边缘区分5点注射2×106个CM-DiI标记的骨髓间充质干细胞,前组用生理盐水灌胃,后组以冠心Ⅱ号汤剂灌胃,1次/d,共7d.主要观察指标:通过多普勒超声心动图分析心功能变化,心肌组织冰冻切片荧光显微镜下观察移植细胞;免疫组织化学染色检测心肌梗死边缘区微血管密度和血管内皮生长因子的表达,荧光定量RT-PCR检测血管内皮生长因子 mRNA的表达水平.结果:与模型组比较,冠心Ⅱ号组、细胞移植组和联合组左室舒张末内径及左室收缩术内径均显著减小(p＜0.01),短轴缩短率及射血分数均显著升高(P＜0.01),其中联合组变化幅度优于冠心Ⅱ号组、细胞移植组(P<0.01或0.05).荧光显微镜下细胞移植组、联合组左心审心肌组织冰冻切片可见发出红色荧光的CM-DiI标记移植细胞,其余各组未见阳性细胞.与模型组比较,冠心Ⅱ号组、细胞移植组和联合组心肌梗死边缘区微Ⅱ血管密度、血管内皮生长因子表达、血管内皮生长因子mRNA表达均显著提高(p<0.01),其中联合组变化幅度优于冠心Ⅱ号组、细胞移植组(P<0.01).结论:单纯冠心Ⅱ号汤剂治疗或骨髓间充质干细胞移植以及两者联合均可改善心肌梗死大鼠心功能,减少心室扩张程度,但两者联合情况下效果佳,对心肌梗死具有协同治疗作用.冠心Ⅱ号可促进骨髓间充质干细胞移植后的血管新生,增加移植细胞区域的血供,可能与其促进血管内皮生长因子分泌和上调血管内皮生长因子基因的表达有关.
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脐血CD133+移植改善转基因痴呆小鼠认知和存活能力水
背景:脐血中富含早期干细胞的一个亚群CD133+细胞,该亚群是具有广泛的增生和分化潜能的原始细胞,被认为具有向神经细胞分化的潜能.目的:假设脐血CD133+细胞对改善痴呆小鼠的认知功能和存活有使用价值,检测脐血CD133+细胞移植后痴呆鼠的认知和存活功能的变化,拟予验证.设计、时间和单位:完全随机区组设计的动物实验,于2005-09/2007-01在天津血液学研究所完成.材料:选用48只雄性APP695转基因小鼠,随机分为3组:对照组(n=8)、CD133+细胞移植组(n=20)和CD133细胞移植组(n=20).方法:对照组小鼠经脑室注射10μ L磷酸缓冲液(PBS),CD133+细胞移植组和CD133细胞移植组分别经脑室注射10 μ LCD133+(5×104/μ L)和CD133(5×104/μL)脐血细胞移植.主要观察指标:以水迷宫实验评价转基因小鼠在细胞移植后的认知功能,并记录移植后小鼠的存活时间.以Dil荧光标记法和免疫组化检测移植细胞的分化类型.结果:在移植后30 d,CD133+细胞移植组小鼠的认知功能明显好于CD133细胞移植组和对照组,差异有显著性意义(P＜0.05),这种改善效果在移植后180 d仍然存在(P＜0.05).CD133+细胞移植组小鼠平均存活时间比CD133细胞移植组和对照组明显延长,差异有显著性意义(P＜0.05).标记有Dil的脐血细胞在移植后30 d已经迁移到多个脑区,其中主要在双侧顶叶皮质和海马区,并且能够表达神经细胞标志Ⅲ型β微管蛋白、神经微丝、神经烯醇化酶和胶质酸性蛋白.CD133细胞移植组脑切片内,Dil标记的脐血源细胞主要分布在侧脑室及其周围,很少能检测到阳性胶质酸性蛋白,Ⅲ型β微管蛋白,或神经烯醇化酶的脐血细胞.移植后30 d,CD133+细胞移植组Dil标记的脐血细胞表达Ⅲ型β微管蛋白的百分率明显高于180 d,表达神经烯醇化酶的脐血细胞百分率明显低于180 d,差异均有显著性意义(P＜0.01).结论:实验结果提示,移植CD133+细胞后出现的对认知功能改善和对存活时间延长的作用,可能主要归功于移植细胞对功能不良细胞的替代或者对神经环路的改善.
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人脐血源性间充质干细胞向心肌细胞的诱导分化
背景:与骨髓间充质干细胞相比,脐带血中的细胞被视为"非常年轻"的细胞,其增殖和分化能力不会随着捐助者的年龄增加而减低,可能是一个极好的骨髓间充质干细胞的替代来源.目的:观察体外诱导脐血间充质干细胞分化成心肌细胞的特点.设计、时间及地点:观察性实验,于2005-03/2007-02在北京世纪坛医院完成.材料:收集获知情同意健康产妇脐血细胞.方法:分离单个核细胞,从中进一步分离间充质干细胞,传代培养至第3代,应用免疫荧光流式细胞仪标记间充质干细胞特异性抗原CD34,CD44和CD90.5-氮胞苷诱导分化4周后,免疫组织化学染色和反转录-聚合酶链反应分别检测心肌细胞标志物肌钙蛋白Ⅰ,GATA4和β-肌球蚩白重链的表达.主要观察指标:心肌细胞标志物肌钙蛋白Ⅰ,GATA4和β-肌球蛋白重链的表达.结果:脐血源性间充质干细胞经5-氮胞苷诱导分化后,呈现成纤维细胞样形态和克隆增殖特点.免疫分型与骨髓来源间质干细胞一致,且免疫组织化学染色和反转录-聚合酶链反可检测到肌钙蛋白Ⅰ,GATA4和β-肌球蛋白重链的表达.结论:脐血源性间充质干细胞能够被诱导分化成心肌样细胞,并显示为心肌细胞的表观特征.
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人脐血单个核细胞移植对急性心肌梗死大鼠心功能及左室重构的影响
背景:以往心肌梗死后心肌修复实验多集中于骨髓干细胞,甚少报道涉及富含造血干细胞、间充质干细胞及内皮祖细胞的脐血干细胞,而以其作为种了细胞的可行性及安全性尚未确定.目的:探讨人脐血单个核细胞移植对急性心肌梗死大鼠心功能和左室重构的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-11/2007-09在中山大学动物试验中心完成.材料:脐血来源于足月分娩的健康产妇,由中山大学附属第一医院产科提供.Wistar雄性大鼠45只,随机分为假手术组、模型组、细胞移植组,15只/组.方法:采用羟乙基淀粉沉淀联合ficoll-paque密度梯度离心法体外分离培养人脐血单个核细胞.移植前细胞行BrdU标记.模型组、细胞移植组大鼠结扎冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死模型,造模成功后,细胞移植组在梗死区周边注射脐血单个核细胞悬液,模型组注射DMEM培养基,培养4周.假手术组仪开胸并在左前降支下过线.主要观察指标:通过超生心动图评价心脏结构,以左心导管检测血流动力学改变,采用苏木精-伊红染色、Masson染色和BrdU免疫组化染色观察心肌组织病理学变化、心肌胶原含量变化及移植细胞存活情况.结果:与模型组比较,细胞移植组左室壁厚度增加,室壁活动度明显改善,左室舒张末期内径缩小,球形指数增大,左室舒张未压显著下降,左室内压大上升/下降速率明显增快,差异均有显著性意义(P＜0.05).假手术组心肌细胞间仪见少量胶原纤维,呈条索状与心肌纤维平行排列:与模型组比较,细胞移植组心肌细胞肿胀程度及排列情况均有所改善,细胞移植组胶原容积分数明显降低(t=3.81,P=0.001).模型组梗死区及其周边和假手术组均未检测到BrdU阳性细胞,细胞移植组胞核呈BrdU阳性的细胞散在分布于梗死区,部分阳性细胞参与到血管壁的组成.结论:在未使用免疫抑制剂的条件下,人脐血单个核细胞可成功移植到大鼠心肌梗死区,且短期内具有改善心功能、抑制梗死后心肌重构的作用.
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外周血造血干细胞采集期间低钙血症的预防与治疗
背景:在造血干细胞采集过程中需以复方枸橼酸钠抗凝全血,枸橼酸盐可鳌合血液中的钙离子,形成不能离子化的枸橼酸钙而引起血液中钙离子下降,引起低钙血症.目的:探寻在外周血干细胞采集期间预防及治疗低钙血症的佳方法.设计、时间及地点:析因设计的观察对比实验,于1998-10/2007-12在华中科技大学附属协和医院血液科完成.对象:共纳入168例外周血造血干细胞采集患者,其中健康异基因外周血造血干细胞供者122例,自体外周血造血干细胞移植46例.方法:采集前皮下注射粒细胞集落刺激因子进行干细胞动员,至第5天应用Cobe Spectra血细胞分离机的自动外周血干细胞采集程序进行外周血造血干细胞采集,平均循环血量为8410 mL,分离过程中平均采血速度为42 mL/min.163例供者采集2次,5例采集3次,共341次.根据补钙方案分为2组,口服组102例供者(共209例次采集)口服匍萄糖酸钙;静脉组66例(共132例次采集)静脉持续滴注葡萄糖酸钙.主要观察指标:采集期问观察两组供者低钙血症相关症状的发生,采集完毕后从产品袋中留取标本计算有核细胞数和CD34+细胞计数.结果:①口服组209例次的供者采集中,43例次(20.6%)出现如口周、四肢麻木感、胃肠道反应、胸闷、头昏等的低钙血症表现,经加大口服葡萄糖酸钙剂量或静脉注射100 g/L葡萄糖酸钙症状均得到控制:静脉组132例次的供者采集中,5例次(3.8%)出现低钙血症表现,经加大静脉注射100 g/L葡萄糖酸钙症状亦得到控制.口服组供者低钙血症的发生率显著高于静脉组(P＜0.01).②口服组和静脉组采集物中的有核细胞数、CD34+细胞计数差异无显著性意义(P＞0.05).结论:应用血细胞分离机采集外周血造血干细胞时,采用静脉持续滴注葡萄糖酸钙补钙的方法明显优于口服葡萄糖酸钙,且不影响造血干细胞的采集效率.
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血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞
背景:骨髓间充质干细胞植入机体不同类犁组织后可以分化为相应组织的靶细胞,提示机体内局部微环境可诱导和决定干细胞的发育取向,但其诱导分化条件和具体作用机制尚不清楚.目的:检测血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子在体外诱导入骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-03/2007-01在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.材料:健康骨髓来源于南昌大学第一附属医院内科同期收治的临床骨髓穿刺检查正常的5例住院患者,无血液系统疾病和家族遗传病史.血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子为Cytolab公司产品.方法:无菌条件下取健康人骨髓,采用Ficoll密度梯度离心+贴壁法分离纯化培养骨髓间充干细胞.取传至第3代细胞,诱导组加入含10μg/L血管内皮细胞生长因子、5μg/L碱性成纤维细胞生长因子和10%胎牛血清的DMEM培养液,对照组仅加入含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养液,置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度恒温培养箱培养14d.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态学变化,免疫细胞化学染色检测CD34、Ⅷ因子的表达,透射电镜观察细胞超微结构.结果:诱导组细胞由长梭形变为短梭形和扁平形,呈内皮样细胞形态特征,CD34、Ⅷ因子均呈阳性表达,细胞胞浆内可见W-P小体.对照组细胞CD34、Ⅷ因子呈阴性.结论:血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子可成功诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞.
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体外诱导胚胎干细胞向甲状腺细胞的分化
背景:胚胎干细胞来源于发育早期囊胚的内细胞团,适当条件下能在体外维持未分化状态、正常二倍体核型及无限增殖能力,且具有多向分化潜能,能够发育分化成机体3个胚层的所有类型细胞.目的:观察体外定向诱导胚胎干细胞分化为甲状腺细胞的可行性及相关分子表达检测.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察实验,于2004-01/2006-12在中山大学附属第二医院脐血库完成.材料:孕12.5～14.5 d的Balb/c孕鼠用于胚成纤维细胞饲养层的制备.E14小鼠胚胎干细胞细胞株由美国哈佛大学DLXu教授惠赠.成年昆明种小鼠用于甲状腺细胞的提取.方法:将制备的鼠胚成纤维饲养层接种于E14小鼠胚胎干细胞进行扩增培养.将脱离饲养层细胞后呈稳定克隆生长的胚胎干细胞诱导发育为胚胎体,再逐步添加促甲状腺素、胰岛素、碘化钾等共培养.以培养的成年昆明种小鼠甲状腺细胞为阳性对照.主要观察指标:①观察分化过程中细胞形态的变化.②免疫荧光法检测分化细胞标记物TSHR,PAX8,TTF-2,TTF-1的表达.③RT-PCR法检测分化细胞相关基因TSHR、PAX8,NIS,TPO,Tg的表达.结果:分化细胞边界清晰,呈圆形、类圆形、梭形或多角形贴壁生长.诱导培养第6天分化细胞中有甲状腺细胞特有基因PAX8,NIS,TPO,Tg,TSHR的表达,第8天检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TSHR,TIF-1,PAX8,TIF-2的表达,阳性细胞形态类似对照甲状腺细胞.结论:胚眙干细胞经胚胎体发育阶段,在特定条件下可定向分化为甲状腺细胞.
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胚胎干细胞研究临床应用性的挑战
胚胎干细胞是存在于胚胎发育早期阶段,具有自我更新和多分化潜能的于细胞.是组成机体各种组织器官的起源细胞.在一定条件下,其在体外可以保持未分化状态,长期存活无限繁殖.有关胚胎干细胞在动物疾病模犁中治疗作用的研究,尤其是在小鼠胚胎千细胞的研究,已趋于成熟.在此基础上,人们开始尝试将人类胚胎干细胞用于临床治疗各种疾病,探讨其可行性和安全性等问题.目前胚胎千细胞已经应用在治疗糖尿病,帕金森及心血管损伤等各种疾病中,虽然有很多技术问题和社会伦理问题需要解决与克服,相信随着胚胎干细胞定向分化机制的逐渐完善,优化培养体系的建立,致瘤性的解决,该细胞疗法作为一种新的治疗方式,将适用于临床使用.
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骨髓间充质干细胞在特发性肺纤维化治疗中的潜在应用价值
特发性肺纤维化是一种弥漫性的肺纤维化病变.在目前,仍没有有效的治疗手段可以对该病进行干预,因此预后很差,5年生存率只有20%.骨髓间充质干细胞是来源于骨髓中的一种多能十细胞,具有多方向分化潜能,在临床上具有巨大的潜在应用价值.在近年周内外的相关研究中发现,骨髓间充质干细胞有可能参与肺损伤的修复,甚至能逆转肺纤维化的病理改变,但具体的作用机制仍不明确,需要进一步研究去阐明.
