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从p38MAPK通路探讨复方参鹿颗粒对较低危MDS骨髓患者CD34+细胞凋亡的影响
目的:从p38有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路研究复方参鹿颗粒(FSG)对较低危骨髓增生异常综合征(lower-risk MDS)骨髓CD34+细胞凋亡的影响.方法:将60例lower-risk MDS患者随机分为FSG组和安特尔治疗组,每组30例.干预3个月.观察治疗前后两组患者血常规、骨髓CD34+细胞凋亡率、骨髓单个核细胞(BMMNC)磷酸化p38(p-p38),p38,丝裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)3/6,磷酸化p53(p-p53),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2家族相关基因(Bcl-xl)蛋白以及p38 mRNA表达的变化.对照组7例为年龄匹配的非MDS引起的血细胞减少患者.结果:与治疗前比较,FSG组治疗后红细胞计数、血红蛋白量、血小板明显上升(P ＜0.05,P＜0.01);安特尔组治疗后血红蛋白量有上升趋势,白细胞、红细胞、血小板计数差异无统计学意义.与对照组比较,治疗前FSG组lower-risk MDS骨髓CD34+细胞凋亡率,p-p38,MKK3/6,p-p53蛋白表达增加,Bcl-xl蛋白表达降低(P＜0.05,P＜0.01),p38,Bcl-2蛋白和p38 mRNA表达无差异;FSG治疗后,CD34+细胞凋亡率,p-p38,MKK3/6,p-p53蛋白表达均降低(P＜0.05),但p-p38蛋白表达仍高于对照组(P＜0.05),Bcl-xl蛋白表达增高(P＜0.05).安特尔组治疗前后CD34+细胞凋亡率,p-p38,MKK3/6,p-p53,Bcl-xl蛋白表达差异均无统计学意义.对照组,lower-risk MDS患者治疗前骨髓p-p38蛋白表达和CD34+细胞凋亡率呈正相关(P＜0.01).FSG组治疗后骨髓CD34+细胞凋亡率下降与p-p38蛋白表达水平下降呈正相关(P＜0.01).结论:FSG通过调控p38MAPK通路抑制骨髓CD34+细胞凋亡,改善骨髓无效造血.
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前列回春对实验性大鼠前列腺组织PCNA表达的影响
前列回春是用于治疗慢性前列腺炎的中药复方制剂,在临床上已使用多年.据笔者临床观察,该药不仅对慢性前列腺炎有确切疗效,而且用于前列腺增生症(BPH)的治疗也有较好效果[1].迄今为止,对BPH的发病机理尚未完全阐明,而细胞凋亡在BPH的发生发展中的作用已为人们初步认识,并发现了很多相关的基因.同样,有的学者则在细胞增殖方面做了研究,如Kyprianou等[2]及邓方明等[3]研究都发现BPH的增殖活性较正常前列腺(NP)明显升高,而细胞凋亡率则较NP明显减少,认为细胞增殖增加和凋亡减少均参与了BPH的发生.增殖细胞核抗原(PCNA)作为DNA聚合酶的辅酶参与细胞增殖过程中DNA的合成[4,5],本研究用前列回春对实验性前列腺增生大鼠进行观察,通过检测大鼠前列腺组织中PCNA的表达,进而阐明其抗前列腺增生作用.现报道如下.
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G-CSF及与辛伐他汀联合应用对大鼠急性心肌梗死后细胞凋亡的影响
随着凋亡相关研究的进展,心肌细胞凋亡与心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的关系逐渐受到重视.本实验联合应用粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimu-lating factor,G-CSF)和辛伐他汀动员干细胞修复AMI后的梗死心肌,通过流式及免疫组化法检测细胞凋亡率和BCL-2/BAX比值,评价其干细胞动员作用对梗死后心肌细胞凋亡的影响.
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安多霖对电磁辐射致大鼠海马区域损伤的防治作用
目的：：电磁辐射污染近年来越来越受到人们的关注。它对人体的多个系统都能造成损害。人体如果长期暴露在不安全范围的辐射剂量下,就会出现头晕头痛、烦躁、食欲不振、学习记忆能力下降等症状。海马是与学习记忆功能密切相关的重要脑区,但同时也是易受电磁辐射攻击的靶部。安多霖胶囊是一种纯中药胶囊剂,为已上市的复方中草药,由一种强抗辐射植物的提取物,配以黄芪、鸡血藤等中药制成,是一种新型的抗电离辐射药物,无毒性不良反应。动物实验表明,它能明显增强机体免疫功能,提高机体的抗应激能力,与现有的肿瘤放、化疗合用能增强放、化疗的治疗效果,减轻放、化疗的毒副反应,提高机体免疫功能。方法：本实验以SD大鼠为实验对象,选择安多霖胶囊混悬液给大鼠灌胃的方式对大功率电磁辐射进行药物防护。观察安多霖对高功率电磁辐射中大鼠海马区血脑屏障保护前后的对比以及检测神经细胞粘附分子( NCAM)和三种蛋白Bcl-2、Bcl-2、c-fos,的表达,来检测辐射后细胞凋亡状况。结果：以Bcl-2为抑凋亡因子,Bax为促凋亡因子, Bcl-2/Bax 的比值变化能调节细胞增殖和凋亡的平衡。 Bc1-2/Bax 比值高,细胞存活率高；比值低,细胞凋亡率高。讨论和结论：通过高功率、大剂量、长时间连续照射,如果镧颗粒突破了血脑屏障,则说明此电磁辐射发射的功率能使大鼠血脑屏障的结构遭到破坏,通透性升高,证实海马区域受损。目前关于电磁辐射的危害已被全社会认知,对神经系统海马区域的损伤机制的研究虽然还处于探索阶段。但科研人员已经逐渐的把取得的成果应用于临床。可喜的是中医中药也加入到对电磁辐射污染的研究当中。本课题正是基于对电磁辐射损伤海马区域机制的研究需要和推广中药抗辐射预防的重要意义。通过切实可行的试验方法对辐射与抗辐射进行深入全面的研究,为海马区域的损伤机制总结精确的基础数据。为临床一线提供具有高效低毒的优质防辐射类中药,造福被电磁辐射污染困扰的人群。
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二氮嗪预处理对 H2 O2损伤 L6骨骼肌成肌细胞的作用及机制研究
目的：：研究二氮嗪( diazoxide, DZ)预处理对H2 O2损伤L6骨骼肌成肌细胞( skeletal myoblast, SKM)的保护作用,并探讨其与磷脂酰肌醇3激酶( phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K)/Akt信号通路的关系。方法：体外培养的L6 SkMs随机分为4组：对照组、H2O2损伤组(H2O2 group；0.40mmo1/L H2O2作用24 h),DZ预处理组(DZ group；200μmol/L DZ预处理30 min后,0.40mmo1/L H2O2作用24 h),LY294002抑制剂组(LY group；200μmol/L DZ和50μmol/L LY294002共同孵育30 min后,0.40mmo1/L H2O2作用24 h)。采用MTT比色法检测各组细胞存活率；Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测各组细胞凋亡率；Western blot-ting法检测各组细胞P-Akt、Caspase-3、Caspase-9的表达水平。结果：与对照组相比,H2 O2损伤可诱导细胞凋亡,显著降低细胞存活率,降低P-Akt蛋白表达而增加Caspase-3,9蛋白表达。与H2 O2组比较,DZ组的细胞存活率显著上升,凋亡率显著下降, P-Akt蛋白表达明显增加而Caspase-3,9表达明显降低。而PI3 K抑制剂LY294002能够显著抑制DZ预处理对细胞的保护和抗凋亡作用,同时使P-Akt蛋白表达显著降低, Caspase-3,9蛋白表达显著增加。结论：DZ预处理可激活PI3 K/Akt信号通路,下调凋亡蛋白caspase-3,9,从而抑制H2 O2引起的L6 SKMs的凋亡。
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叶酸对胚胎大鼠心脏细胞凋亡及 Bax、Bcl-2蛋白表达的影响
目的：：观察叶酸对妊娠大鼠心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响,在细胞水平探讨叶酸预防先天性心脏畸形的作用及机制,为临床应用叶酸预防出生缺陷性疾病提供理论和实验依据。方法：成年雌性SD大鼠40只,随机分为对照组、大、中、小剂量叶酸组。叶酸组受孕后灌胃给予2、1、0.5 mg/kg/d等不同剂量叶酸,自受孕日开始持续10天。 ED13.5天处死大鼠并取胎鼠心脏,常规制备组织切片,免疫组化检测Bax、Bcl-2的表达情况,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果：与对照组比较,叶酸干预组的细胞凋亡率、Bax表达均明显降低(P<0.01),Bcl-2的表达显著增高(P<0.05)；叶酸不同剂量组间比较,Bax和Bcl-2蛋白表达、细胞凋亡率在大、中剂量组与小剂量组差异显著(P<0.05),大剂量组与中剂量组比较差异无统计学意义( P>0.05)。结论：叶酸干预可降低胎鼠心肌细胞的凋亡率和Bax的表达,提高Bcl-2的表达。一定范围内,叶酸对Bax、Bcl-2表达及细胞凋亡率的影响与剂量有关联。叶酸抑制心脏细胞凋亡的作用可能与预防畸形的作用机制有关。
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叶酸对胃癌前细胞凋亡的影响
目的:研究叶酸对胃癌前细胞凋亡的影响.方法:胃镜下活检,病理证实癌前病变患者38例(结肠型肠上皮化生18例和轻、中度非典型增生20例),癌前病变组织经胃蛋白酶消化液消化成单个细胞后,采用PI单染法和Annexin V FITC/PI双参数染色法用流式细胞仪检测细胞凋亡率.将癌前病变患者随机分为治疗组19例,对照组19例(每组包括结肠型肠上皮化生9例和轻、中度非典型增生10例),治疗组给予叶酸10 mg,3次/d,治疗3 mo,对照组给予硫糖铝1.0 g,3次/d,治疗3 mo,治疗结束后复查组织细胞凋亡率.结果:治疗组治疗后细胞凋亡率增高(P＜0.05),对照组治疗后细胞凋亡率无明显变化(P＞0.05).结论:叶酸具有诱导胃癌前病变细胞凋亡的作用.
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慢性乙型肝炎病毒清除自杀基因平衡制约载体系统的构建
目的:建立清除乙型肝炎病毒(HBV)自杀基因平衡制约载体系统,靶向清除HBV感染的肝细胞,抑制慢性乙型肝炎和肝硬化患者免疫再活动.方法:逆转录PCR(RT-PCR)扩增丙型肝炎病毒(HCV)基因组中核糖体插入位点(IRES),以pcDNA3载体为基础,构建双顺反子表达载体.同时在IRES位点的上游克隆HBV表面基因的部分反义序列和HCV全长核心基因,在IRES位点下游克隆胸腺苷激酶基因,PCR、酶切和测序鉴定.构建的清除乙型肝炎病毒(HBV)自杀基因平衡制约载体系统分别转染培养基含有更昔洛韦的HepG2细胞和2.2.15细胞.结果:构建的清除乙型肝炎病毒(HBV)自杀基因平衡制约载体系统可以选择性促使2.215细胞凋亡(实验组细胞凋亡率为15%,而对照组仅为6%);抑制2.2.15细胞在培养基中分泌乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg),统计学分析表明,HBsAg在培养基中检测滴度,在两组之间有显著性差异(P＜0.05).结论:构建以HBV表面基因为靶基因,自杀基因为效应基因的自杀基因制约平衡系统,可能为下一步慢性乙型肝炎的基因治疗提供理想的基因治疗载体.
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小柴胡汤及药群配方含药血清对CCl4损伤肝细胞凋亡的影响
目的:探察小柴胡汤含药血清对体外CCl4诱导的肝细胞损伤模型的保护作用.方法:制备小柴胡汤及药群配方的大鼠含药血清,体外10 mmoL/L CCl4诱导肝细胞损伤模型,观察10%药物血清对损伤肝细胞增生率、ALT、细胞形态学以及凋亡率的影响.结果:与正常组比较,模型组肝细胞增生率显著降低(1.22±1.00,1.11±0.09,1.12±0.18,1.10±0.08,vs0.78±0.07,P＜0.01),细胞培养上清液中ALT含量显著升高(948±162,748±278,1 081±226,1 148±163,vs 2110±377,P＜0.01);与模型组比较,小柴胡汤及其药群配方组的肝细胞增生率显著增高(P＜0.01),细胞培养上清液中ALT含量显著降低(P＜0.01).倒置显微镜、Giemsa及TUNEL染色观察到,模型组肝细胞存在着明显的坏死和凋亡,小柴胡汤及药群配方的凋亡细胞明显减少.与正常组比较,CCl4模型组细胞凋亡显著增高(2.9 467±1.0 007 vs16.3 175±4.5 358,P＜0.01);与模型组比较,小柴胡汤及药群配方组的细胞凋亡率显著降低(4.2 117±2.3 733,6.4800±2.4052,5.6 200±2.0 573,4.6440±0.8825,vs 16.3 175±4.5 358,P＜0.01).结论:CCl4引起的肝损伤同时存在着明显的凋亡和坏死,小柴胡汤及药群配方含药血清对体外CCl4诱导的肝细胞损伤有保护作用.
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几种抗癌药物诱导胰腺癌细胞凋亡能力的比较
目的:比较抗癌药物诱导胰腺癌细胞凋亡的能力,以期找到一种疗效较好的化疗药物.方法:根据临床常用的高及低剂量,分别将羟基喜树碱、三氧化二砷、紫杉醇、全反式维甲酸、奥曲肽及5-Fu与胰腺腺泡癌细胞SW1990系共同培养6、12、24h,利用光镜及电镜下的形态学方法及脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)确定细胞凋亡,并利用AO-EB双重荧光染色法及PI和Annexin-V FITC双重标记下的流式细胞术定量测定细胞凋亡率.结果:上述药物均可诱导SW1990细胞凋亡,凋亡诱导能力由强到弱依次为紫杉醇、5-氟尿嘧啶、羟基喜树碱、三氧化二砷、全反式维甲酸和奥曲肽.各药物的凋亡诱导能力呈剂量和时间的依赖性,其中紫杉醇的作用强且快.结论:紫杉醇可能是一种疗效较好的胰腺癌化疗药物.
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HSP70在慢性情绪应激中对胃黏膜保护作用
目的:探讨HSP70对心理应激导致的胃黏膜细胞凋亡是否具有保护作用及其可能的作用机制.方法:野生型小鼠70只,随机分为对照组(n=16),热应激组(n=18),心理应激组(n=18),热应激加心理应激组(n=18),分别不给予任何实验应激,给予热应激,心理应激,以及热应激加心理应激.用免疫组化和TUNEL法分别在1,2,3 mo时段对胃黏膜细胞凋亡率和HSP70表达情况进行检测,比较同一时段不同组之间的差异,并探讨HSP70表达与胃黏膜细胞凋亡的关系.结果:1 mo时段,胃黏膜细胞凋亡发生率在各组没有显著性差异(对照组,热应激组,心理应激组,热应激加心理应激组分别为0.5±0.4%,0.5±0.8%,1.3±1.2%,0.9±1.3%,F=0.706,P=0.561＞0.05).在2 mo时段心理应激组胃黏膜细胞凋亡发生率显著高于对照组(3.7±1.9%vs1.3±1.4%,P=0.017＜0.05),热应激组(3.7±1.9%vs 1.2±1.6%,P=0.010＜0.05),热应激加心理应激组(3.7±1.9%vs1.3±1.1%,P=0.012＜0.05).3 mo时段心理应激组胃黏膜细胞凋亡发生率显著高于对照组(4.1±3.9%vs1.0±1.1%,P=0.025＜0.05),热应激组(4.1±3.9%vs0.4±0.7%,P=0.009＜0.05),热应激加心理应激组(4.1±3.9%ys 1.4±1.5%,P=0.046＜0.05).在1 mo时段,热应激组,热应激加心理应激组HSP70表达率均分别显著高于对照组(64±11%vs20±11%,P=0.00＜0.05,72±6%vs20±11%,P=0.00＜0.05)和心理应激组(64±11%vs 34±15%,P=0.00＜0.05,72±6%vs34±15%,P=0.00＜0.05).在2mo时段,热应激组,热应激加心理应激组HSP70表达率均分别显著高于对照组(84±13%vs25±15%,P=0.00＜0.05,87±7%vs25±15%,P=0.00＜0.05)和心理应激组(84±13%vs46±30%,P=0.02＜0.05,87±7%vs46±30%,P=0.01＜0.05).在3 mo时段,热应激组,热应激加心理应激组HSP70表达率均分别显著高于对照组(61±16%vs16±9%,P=0.02＜0.05,65±29%vs16±9%,P=0.01＜0.05)和心理应激组(61±16%vs33±29%,P=0.09＜0.05,65±29%vs33±29%,P=0.046＜0.05).HSP70表达率与胃黏膜细胞凋亡率呈负相关(r=-0.320,P=0.008).结论:慢性心理应激使胃黏膜细胞凋亡发生率增加,HSP70可以降低胃黏膜细胞凋亡发生率,在应激性溃疡的预防和治疗有重要的应用价值.
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Survivin mRNA反义寡核苷酸诱导胰腺癌细胞凋亡
目的:用反义寡核苷酸(ASODN)封闭胰腺癌细胞中Survivin基因的表达,研究其诱导细胞凋亡的作用及其机制.方法:用脂质体介导SurvivinASODN转染人胰腺癌细胞株SW1990细胞,用Annexin V-FITC/PI复染、流式细胞术检测及电镜术观察凋亡,激酶活性检测法测定细胞内caspase-3活性变化,免疫沉淀法测定细胞内丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)活性的变化早期细胞变化情况.结果:脂质体介导SurvivinASODN转染胰腺癌细胞后细胞内p38MAPK及caspase-3活性较对照组明显升高(55.3% vs2.9%,3.2%,4.5%,4.8%respectively,P＜0.05).细胞出现典型的凋亡形态学特征,细胞凋亡率较对照组明显增加(8.81±1.33vs47.87±2.91,and 14.73±1.36 vs 23.47±3.61,P＜0.05).结论:脂质体介导转染Survivin ASODN可以诱导细胞激活,诱导活化进而诱导细胞发生凋亡.
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环氧合酶-2反义核酸对人胆管癌细胞增生的影响
目的:用反义环氧合酶-2(COX-2)重组载体转染COX-2高表达人胆管癌细胞QBC939,观察其对QBC939细胞的生长抑制作用,并探讨其作用机制.方法:通过脂质体介导将COX-2反义核酸质粒转入QBC939细胞,经G418筛选获得稳定表达COX-2反义核酸的胆管癌转染细胞模型.采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测转染前后QBC939细胞COX-2 mRNA表达的变化,应用免疫细胞化学链霉亲合素-生物素复合物(SABC)技术检测转染前后QBC939细胞COX-2蛋白表达水平的变化,应用四唑氮蓝(MTT)比色法检测COX-2反义核酸对QBC939细胞增生的影响,应用流式细胞仪测定细胞周期和细胞凋亡.结果:反义COX-2基因转染后胆管癌细胞中COX-2 mRNA表达水平明显下调,COX-2蛋白表达减弱.转染反义COX-2重组载体的QBC939细胞生长速率明显下降(P＜0.01),细胞周期分析转染后细胞比转染前细胞增生指数显著下降(P＜0.01),S期细胞比例为9.27±1.91%,比转染前(16.35±2.87%)明显降低(P＜0.05),G0/G1期细胞比例为75.16±4.13%,比转染前(57.31±10.16%)明显上升(P＜0.05),细胞被抑制在G0/G1期;COX-2反义核酸转染对QBC939细胞凋亡率无明显影响(P＞0.05).结论:COX-2反义核酸导入可抑制QBC939细胞增生.
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酸性成纤维细胞生长因子对缺血再灌注小肠绒毛细胞内bax和bcl-2表达的影响
目的:探讨外源性酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对大鼠肠缺血再灌注后小肠绒毛细胞凋亡以及凋亡相关基因bax和bcl-2表达的影响.方法:采用肠系膜上动脉(SMA)夹闭45 min后松夹造成缺血再灌注(I/R)损伤的动物模型,将108只Wistar大鼠随机分成假手术组(C)、肠缺血组(I)、肠缺血-再灌注组(R)和aFGF治疗组(A).根据缺血后再灌注时间的不同又将R组和A组又分成0.25,0.5,1,2,6,12,24和48 h共8组,每组6只动物.A组和R组在松开动脉夹的同时,分别经尾静脉注入20μg/kg aFGF和生理盐水0.15 mL.各时相点取小肠组织,通过末端脱氧核糖转移酶介导的生物素化脱氧尿嘧啶缺刻标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡率;利用免疫组织化学方法检测bax和bcl-2蛋白表达;用RT-PCR方法测定bax和bcl-2基因的表达水平.结果:缺血再灌注后2,6,和12 h,A组中大鼠小肠绒毛组织的细胞凋亡率分别为(41.17+3.49%),(42.83+5.23%)和(53.33+6.92%),显著低于C组中各对应时间点上的细胞凋亡率(P＜0.05).I/R后小肠绒毛细胞内bax基因表达逐渐增强,蛋白含量升高,而bcl-2基因转录迅速降低,蛋白含量减少.在再灌注2-12 h,A组中bcl-2基因转录水平和蛋白含量都较C组增加,而bax基因的mRNA含量和蛋白水平均较C组降低.结论:外源性aFGF能够减轻缺血再灌注对小肠绒毛的损伤,其机制可能与aFGF促进bcl-2基因转录、抑制bax基因表达相关.
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诱导HSP70减轻肠上皮细胞缺氧/再给氧的损伤
目的:观察热休克预处理诱导热休克蛋白70(HSP70)对肠上皮细胞(IEC-6)缺氧/再给氧损伤的影响,并探讨HSP70的细胞保护作用.方法:体外培养IEC-6细胞,随机分为正常对照(C)、单纯缺氧/再给氧(H/R)及热休克预处理组(HS+H/R),免疫组化检测缺氧/再给氧后各组细胞HSP70表达程度,MTT法分析细胞活力,并检测细胞LDH漏出,TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果:与C组及H/R组比较,热休克预处理可明显诱导HSP70的产生(0.93±0.07 vs 0.20±0.04,0.39±0.08,P＜0.01),热休克预处理可显著增加IEC-6细胞缺氧/再给氧处理后细胞活力(0.27±0.04 vs 0.24±0.02,P＜0.05),LDH漏出减少(1021.29±207.06 vs 1419.90±393.07,P＜0.05),细胞凋亡率也明显降低(7.8±1.6% vs 12.3±2.9%,P＜0.05).结论:通过热休克预处理诱导HSP70表达,可明显减轻肠上皮细胞缺氧/再给氧损伤.防止肠上皮细胞缺氧/再给氧后细胞凋亡可能是其保护作用机制之一.
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丁酸钠对结肠上皮细胞凋亡的影响
目的:探讨丁酸钠对正常及炎症结肠细胞凋亡的影响.方法:(1)杀死SD大鼠.分离其结肠黏膜,悬于Ussing槽中,维持温度为37.0±0.5℃,并通100%O2.黏膜面给予4%乙酸孵育,以Ringer液稀释,并给予大鼠自体血液,浆膜面用Ringer液孵育.(2)分离大鼠的正常及炎症结肠,给予或者不给予丁酸钠,使用TUNEL试剂盒来检测结肠表皮细胞的凋亡.结果:乙酸孵育无丁酸钠组,结肠上皮细胞的凋亡率为25.37±2.38;乙酸孵育给予丁酸钠组,结肠上皮细胞凋亡率为10.58±1.07,二者相比P＜0.05.正常结肠上皮细胞未给予丁酸钠组,凋亡率为10.35±1.07;乙酸孵育给予丁酸钠组,凋亡率为3.78±1.07,二者相比P＜0.05.结论:丁酸钠能抑制结肠上皮细胞的凋亡.
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NHE1基因调控细胞内酸碱平衡对胃癌细胞生物学行为的影响
目的:通过基因转染技术,研究NHE1反义基因对SGC-7901胃癌细胞生物学行为的影响,探讨通过酸化细胞内环境诱导肿瘤细胞凋亡从而治疗胃癌的新方法.方法:利用亚克隆技术构建人NHE1反义结构基因哺乳动物真核表达质粒,通过DOTAP脂质体介导的转染技术将反义真核表达质粒和空载体分别转入SGC-7901胃癌细胞中,经聚合酶链反应(PCR)对转染基因的整合鉴定后,观察基因转染对细胞形态学、细胞内pH值、体外生长状况、细胞周期以及双层软琼脂克隆形成能力和裸鼠成瘤力的影响.结果:光镜及透射电镜下细胞形态恶性程度降低.Anti-7901细胞胞内pH值显著低于Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901细胞内pH值(6.77±0.05 vs 7.24±0.03,7.26±0.03,P＜0.01).Anti-7901细胞生长速度明显减慢,出现接触抑制,呈单层生长,细胞凋亡率显著高于Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901凋亡率(26.1% vs 5.12%,4.48%,P＜0.01).Anti-7901细胞在双层软琼脂中集落形成率显著低于Zeo-7901和空白对照组SGC-7901细胞(9±3.54‰ vs 40±4.53‰,38.6±4.63‰,P＜0.01).接种Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901细胞裸鼠皮下长出肿瘤,成瘤率为100%,而接种Anti-7901细胞裸鼠皮下未长出肿瘤,成瘤率为0%.结论:反义技术干预可使NHE1基因表达下调,导致细胞内酸化,诱导细胞凋亡,达到了有效治疗胃癌的目的,为胃癌基因治疗提供了新的思路.
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TRAIL诱导肝癌细胞系SMMC-7721的凋亡作用
目的:观察TRAIL诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用.方法:采用MTT法检测细胞存活分数;TUNEL法检测细胞凋亡率;流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期;电镜观察凋亡细胞超微结构.结果:TRAIL对SMMC-7721细胞的存活分数和凋亡率的影响呈典型的量效关系,经TRAIL作用后的细胞,流式细胞仪检测呈标准的亚二倍峰,电镜观察发现经TRAIL作用的部分细胞具有凋亡细胞的典型形态特征.结论:TRAIL可诱导SMMC-7721细胞凋亡.
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CD95配体分子诱导人肝癌细胞凋亡的作用
目的:探讨CD95 L在肝癌细胞凋亡过程中的作用.方法:ELISA法对慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化与肝癌患者血清可溶性CD95 L(sCD95L)水平进行了初步检测,构建了人CD95 L的重组真核表达体pcDNA3.1hisB-CD95 L,将pcDNA3.1hisB-CD95 L转染至人肝癌细胞株HepG2细胞,采用Annexin V/PI双染后双变量流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:sCD95L在肝癌患者明显低于肝炎及肝硬患者,构建的表达重组体pcDNA3.1hisB-CD95 L经菌落PCR和限制性酶切消化有预期的目的片段出现,DNA序列分析证实CD95 L完整、正确插入,转染后的HepG2细胞细胞凋亡率为36.30%;未转染CD95L的对照组细胞凋亡率11.53%.结论:CD95L可使肝癌细胞凋亡.
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survivin反义寡核苷酸对肝癌细胞生长抑制作用的研究
目的:采用反义寡核苷酸封闭肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其对肝癌细胞生长的抑制作用.方法:针对survivin mRNA翻译起始位点设计并合成反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN);采用脂质体介导survivin ASODN转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,western-blot及原位杂交方法检测survivin蛋白及mRNA表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,检测转染前后细胞贴壁率及细胞生长抑制率变化,绘制细胞生长曲线.结果:脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染肝癌细胞后survivin蛋白及mRNA表达分别从69.59及75.61降低至10.71及22.94,细胞贴壁率从90.68%降低至33.16%,细胞凋亡率从0.7%增加至31.35%,均有显著差异.转染后对细胞生长的抑制作用可以维持大约1 wk,在转染后第3 d抑制率高可达71.8%.结论:脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以有效降低细胞内survivin基因的表达,诱导细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞生长.
