中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
-
差速贴壁技术对大鼠脑皮质星形胶质细胞纯化率的影响
目的:观察差速贴壁技术对星形胶质细胞纯化率的影响,旨在建立一套可靠的大鼠脑皮质星形胶质细胞的取材分离、纯化培养技术.方法:实验于2006-06/08在泰山医学院生命科学研究所完成.实验材料:出生2～3 d的Wistar大鼠,雌雄不拘,由泰山医学院生命科学研究所实验动物中心提供.实验方法:选用出生二三天的Wistar大鼠进行脑皮质星形胶质细胞原代培养.实验分两组殚培养:常规培养组和差速贴壁培养组.差速贴壁培养组分别于15,30 min取出,轻轻翻转培养瓶,将上清液移至另一培养瓶中,放入培养箱中继续培养.7～10 d后传代,待细胞分层生长后,置于37 ℃摇床中250r/min振荡18 h,倒掉上清液,D-Hank's液洗3次后,加入0.25%胰酶消化,倒置显微镜下观察,待细胞突起回缩后加入含血清的培养基终止消化,用吸管反复吹打使细胞从瓶壁上脱落,细胞悬液1 000 r/min离心5 min后,弃上清液,加入含体积分数为0.2血清的DMEM培养基混悬沉淀,接种人预先涂有L-多聚赖氨酸的培养瓶中继续培养.采用双重免疫荧光法鉴定星形胶质细胞纯度,测定积分吸光度值判断星形胶质细胞的生长状况.结果:①应用差速贴壁技术培养星形胶质细胞可明显提高星形胶质细胞纯度[常规培养组:(82±3)%,差速贴壁培养组15 min:(94±2)%,差速贴壁培养组30 min:(95±2)%,P＜0.01].差速贴壁需要充分的时间,15 min组和30 min组在提高星形胶质细胞纯度方面无明显差别.②差速贴壁培养组星形胶质细胞积分吸光度值高于常规培养组(常规培养组:528±25,差速贴壁培养组15 min:972±17,差速贴壁培养组30 min:996±35,P＜0.05).结论:①差速贴壁技术可明显提高星形胶质细胞纯化度,并且星形胶质细胞生长状态明显优于常规培养方法.②佳差速贴壁时间为15 min,过长差速贴壁时间对提高星形胶质细胞纯度无明显影响.
-
昆明小鼠胚胎干细胞囊胚孵出前不同培养方法的效果比较
目的:胚胎干细胞的获得、克隆与传代对实验条件及操作技术水平要求较高.分别将单纯胚胎干细胞培养液法与KSOM-胚胎干细胞培养液法应用于昆明小鼠胚胎干细胞囊胚孵出前阶段,对体外培养的胚胎干细胞进行鉴定,并比较其增殖与克隆形成情况.方法:实验于2006-03/10在哈尔滨医科大学组织胚胎学教研室暨组织工程中心完成.①冲胚液配制:含体积分数为0.05胎牛血清的磷酸盐缓冲液,4℃冰箱保存.②KSOM胚培养液配制:将配制好的贮存液放入-20℃冰箱保存,用时加入1 g/L的胎牛血清白蛋白和1 mL/L的丙酮酸钠,过滤,调配至100 mL.③取6～8周龄雌性昆明小鼠35只腹腔内注射孕马血清绒毛膜促性腺激素7.5 IU/只,48 h后注射人绒毛膜促性腺激素7.5 IU/只,然后与10周龄雄性昆明小鼠15只合笼,次日晨雌鼠见栓者记为妊娠0.5 d.④于妊娠3.5 d冲胚,将冲出的囊胚分别应用于单纯胚胎干细胞培养系统、KSOM-胚胎干细胞培养系统.前者直接利用胚胎干细胞培养液在饲养层上培养并孵出囊胚;后者先应用KSOM液滴培养囊胚至孵出,再改用胚胎干细胞培养液于饲养层上培养孵出的囊胚.⑤将孵出的囊胚置于预先制备好的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养,酶-机械法分离囊胚内细胞团,观察可传代的囊胚内细胞团数与原代胚胎干细胞的克隆形成率.⑥对培养的胚胎干细胞进行Oct-4染色和碱性磷酸酶染色鉴定,并检测其体外分化能力.结果:①不同培养系统对孵出囊胚状态的影响:KSOM-胚胎干细胞培养系统:KSOM液滴中处于囊胚内细胞团状态的囊胚腔逐渐增大,待取出时胚胎扩展更加充分,一侧突出一个大泡但未突破透明带,此为正在孵出的囊胚.孵出后仍维持有腔的囊胚状态,表明胚胎的质量良好.移入饲养层后即贴壁,囊胚内细胞团开始增殖.单纯胚胎干细胞培养系统:囊胚培养24 h后开始孵出并贴壁,囊胚内细胞团逐渐增大,后将囊胚腔充满.②不同培养系统对原代胚胎干细胞克隆形成率的影响:KSOM-胚胎干细胞培养系统、单纯胚胎干细胞培养系统的囊胚总数分别为154只和131只,差异无显著性意义(P＞0.05);两种培养系统的囊胚内细胞团可传代数量分别为89只和80只,增殖到能够离散的程度基本相似(57.8%,20.1%,P＞0.05);原代胚胎干细胞囊胚内细胞团离散后出现集落数分别为31个和38个,克隆形成率差异无显著性意义(20.1%,29.0%,P＞0.05).③胚胎干细胞鉴定结果:第5代胚胎干细胞Oct-4染色和碱性磷酸酶染色均呈阳性.④胚胎干细胞体外分化能力检测结果:胚胎干细胞团块悬浮培养4 d时,形成由上百个细胞组成的球状拟胚体.结论:①单纯胚胎干细胞培养液一步法与KSOM-胚胎干细胞培养液两步法孵出囊胚所获得的胚胎干细胞集落形态类似,均具有胚胎干细胞的形态学特征,但后者在KSOM液培养阶段有利于囊胚孵出前的早期胚胎发育同步化.②两种培养方法得到的胚胎干细胞其增殖及克隆形成能力基本相似.
-
以骨髓基质细胞为饲养层培养小鼠精原干细胞
目的:建立精原干细胞与骨髓基质细胞共培养细胞模型,探讨骨髓基质细胞层支持精原干细胞扩增的可能机制.方法:实验于2004-03/2005-04在泸州医学院医学分子生物学实验室完成.以6～8 d龄小鼠为材料,脱颈处死后经体积分数为0.75的乙醇浸泡消毒,打开腹腔分离双侧睾丸,采用0.25%胰酶消化离心后培养睾丸细胞,采用差速贴壁法分离支持细胞与生精细胞.同时取小鼠胫骨骨髓,分离后用IMDM培养基培养,待细胞生长至单层时,以10 mg/L丝裂霉素C处理的原代培养骨髓基质细胞作为饲养层,并将分离后的生精细胞接种至饲养层上,以含体积分数为0.1的小牛血清的IMDM为培养基,37℃下共培养,在倒置相差显微镜下观察细胞的生长特点,并对培养15 d的细胞进行苏木精-伊红染色、碱性磷酸酶染色及C-Kit受体检测.结果:①支持细胞在培养后4～6 h就开始贴附变形,此时生精细胞仍呈圆形,且悬浮于培养基中,将悬浮的圆形生精细胞吸出后接种于骨髓基质饲养层上共培养.培养8 h后,见体积较小的原形细胞开始贴附增殖,继续培养三四天后见体积相对较大的圆形细胞开始死亡,推测增殖较小的细胞为精原干细胞.增殖细胞的生长特点及形态学特征与文献报道精原干细胞的特征相符合.②苏木精-伊红染色显示培养的生殖细胞大小均匀,核大而圆着色深、胞质浅染、核质比高;碱性磷酸酶染色见胞质和细胞膜为阳性,C-Kit受体显示细胞膜呈强阳性,背景基质细胞为阴性.这些均符合精原干细胞的生物学特征.结论:精原干细胞在未加入细胞因子、原代培养的骨髓基质细胞饲养层中能较长时间生长并分裂增殖,推测骨髓基质细胞通过分泌生物活性物质和细胞黏附分子支持精原干细胞的扩增.
-
脐血间充质干细胞体外培养方法的改良及其成骨分化能力
目的:采用两种改良方法体外分离培养脐血间充质干细胞,并观察其成骨分化能力.方法:实验于2006-05/09在上海交通大学医学院附属第九人民医院骨与关节中心细胞实验室完成.①所用28份脐血标本由复旦大学医学院附属妇产科医院提供,取自足月健康顺产新生儿,产妇和家属均书面同意,实验经医学伦理委员会批准.②采集28份脐血标本,50～90 mL/份,枸橼酸抗凝.采集后12 h内密度梯度离心法分离出单个核细胞,接种于100 mm×20 mm培养皿中,细胞浓度为1×1010 L-1,置于含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养液中原代培养,5～7 d后半量换液,后每隔3～4 d全量换液一次.③细胞贴壁后,分两组予以改良培养.改良1组10份,当培养皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的培养皿中培养;改良2组18份,待培养皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基更换为含体积分数为0.15小牛血清的α-MEM,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养基.成纤维样细胞融合至80%～90%时胰酶消化,按1∶2或1∶3传代培养.④显微镜下观察脐血间充质干细胞的形态.取第5代脐血间充质干细胞,采用流式细胞仪测定细胞免疫表型,以碱性磷酸酶法检测成骨分化能力.结果:①28份脐血间充质干细胞中,共20份原代培养中出现贴壁细胞(改良1组6份,改良2组14份),其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞(改良1组4份,改良2组9份),成功率46.4%.②原代培养5～7 d后贴壁细胞呈梭形成纤维样细胞和圆形巨核细胞.改良1组与2组于原代培养5周可见成纤维样细胞集落,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,传至22代形态无明显变化.③可强烈表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志,而不表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志.④成骨诱导1周,脐血间充质干细胞可分化为成骨细胞,碱性磷酸酶染色呈阳性.结论:脐血中存在的单个核细胞经过改良培养后,可提高脐血间充质干细胞的培养成功率.脐血间充质干细胞具有与其他来源的单个核细胞类似的表型及成骨分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定.
-
长期培养人急性髓系白血病骨髓基质上清液对早幼粒白血病细胞的影响
目的:通过观察长期培养的白血病骨髓基质上清液对早幼粒白血病细胞体外的作用,寻求一种体外净化辅助方法.方法:实验于2002-04/2003-12在大连医科大学附属第二医院血液内科实验室完成.20例急性髓细胞白血病为初诊或复发病例.男11例,女9例,19～55岁,平均36.8岁,由大连医科大学附属第二医院血液内科、大连市友谊医院血液内科、铁路医院血液科、大连大学附属医院血液科提供.患者知情同意并签署知情同意书.诊断均符合张之南主编的"血液病诊断及疗效标准",其中M12例,M2 8例,M34例,M42例,M54例.常规分离培养人骨髓基质细胞,收集14,28,35 d的上清分别与早幼粒白血病细胞共孵育,以不加入急性髓细胞白血病基质上清液的早幼粒白血病细胞的培养体系作为阴性对照,通过形态、流式细胞术、DNA电泳来观察早幼粒白血病细胞有无分化及凋亡表现.结果:20例患者均进入结果分析.①急性髓细胞白血病骨髓基质细胞是由网状细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞组成.②Wright-Giemsa染色可见阴性对照早幼粒白血病细胞为悬浮生长,胞体内含颗粒,增殖旺盛,镜下常见核分裂、增殖状态的早幼粒白血病细胞;14 d及28 d培养的急性髓细胞白血病基质上清液作用的早幼粒白血病细胞,形态未见明显变化,35 d培养的急性髓细胞白血病基质上清液作用的早幼粒白血病细胞出现细胞变形,细胞核出现改变,部分细胞核仁减少或消失.NBT还原实验发现部分早幼粒白血病细胞胞奖内出现紫蓝色颗粒,并见到核碎解成染色质小体(凋亡小体).③35 d时相上清液孵育的早幼粒白血病细胞部分出现分化现象,部分出现凋亡小体,DNA电泳见梯形带,流式细胞术检测出凋亡峰.④培养35 d的急性髓细胞白血病基质上清液对早幼粒白血病细胞的诱导分化及促凋亡作用明显强于培养14,28 d的急性髓细胞白血病基质上清液及阴性对照组[分化细胞数:1.5±1.8,2.1±1.5,17.3±3.0,41.0±11.1;凋亡细胞数:5.2±1.7,7.3±1.9,10.1±2.2,35.2±13.9,P＜0.05],其他组间差异不显著.结论:培养35 d的白血病骨髓基质上清液对早幼粒白血病细胞具有诱导分化、促进凋亡的作用.可能为白血病体外净化提供一种辅助方法.
-
昆明小鼠3.5 d囊胚分离培养胚胎干细胞并诱导分化为胰岛素前体细胞的实验
目的:自囊胚内细胞团分离培养患者自身的胚胎干细胞并将其诱导分化为目的细胞可用于特定疾病的治疗.实验采用昆明小鼠3.5 d囊胚分离培养胚胎干细胞,并将其诱导分化为胰岛素前体细胞.方法:实验于2005-09/2006-11在哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室完成.①选取妊娠3.5 d昆明雌性小鼠123只,至13.5 d时取11只用于胚胎成纤维细胞饲养层制备.剩余112只妊娠3.5 d小鼠冲胚后,挑取扩展充分、囊胚内细胞团明显的囊胚采用胰酶+乙二胺四乙酸机械法分离培养胚胎干细胞,进行碱性磷酸酶染色和Oct-4免疫荧光染色鉴定.②在细菌培养皿的盖上用不含人重组白血病抑制因子的胚胎干细胞培养液制备液滴,选取生长旺盛、形态典型的胚胎干细胞集落,采用胰酶+乙二胺四乙酸机械法悬浮培养4 d,形成拟胚体,行巢蛋白免疫荧光染色.③将胚胎干细胞诱导分化为胰岛素前体细胞,首先需要L-多聚赖氨酸和纤维粘连蛋白包被培养皿,然后用ITSFn筛选液(含5 mg/L胰岛素、50 mg/L转铁蛋白、30 nmol/L亚硒酸钠、5 mg/L纤维粘连蛋白的DMEM/F12培养液)筛选巢蛋白阳性细胞6 d,碱性成纤维细胞生长因子扩增及初步诱导6 d,再以烟碱诱导功能成熟的胰岛素前体细胞27 d.应用DTZ染色、Insulin免疫荧光染色对诱导的细胞进行鉴定.结果:①胚胎干细胞的分离培养:将扩展充分的囊胚放置在饲养层上4 d后,可见囊胚内细胞团自透明带中孵出,呈柱状生长,中央颜色深于周边,并将周边的饲养层细胞推开.胚胎干细胞传代后呈典型的克隆样生长,相差显微镜下折光性强.②胚胎干细胞碱性磷酸酶染色和Oct-4免疫荧光染色结果:两种染色均呈阳性表达.③拟胚体的形成及向巢蛋白阳性细胞的诱导:胚胎干细胞悬浮培养4 d可形成拟胚体,经ITSFn筛选6 d后可见90%巢蛋白阳性细胞.④巢蛋白阳性细胞向胰岛素前体细胞的分化:烟碱诱导6 d后,上皮样细胞增多,细胞逐渐密集形成类胰岛样组织.诱导10 d DTZ染色可见集落的边缘细胞被染成腥红色.诱导27 d Insulin免疫荧光染色可见染色阳性细胞团簇.结论:采用昆明小鼠3.5 d囊胚成功分离培养胚胎干细胞,并可以将胚胎干细胞诱导分化为胰岛素前体细胞.
-
贞芪扶正颗粒和复方阿胶浆干预再生障碍性贫血模型小鼠外周血及骨髓象的变化
目的:观察贞芪扶正颗粒和复方阿胶浆对苯油溶液致小鼠再生障碍性贫血模型的疗效.方法:实验于2005-06/09在河南中医学院药理实验室完成.①选用昆明种成年雄性小鼠90只.按随机数字表法将小鼠分为9组,每组10只:大、中、小剂量贞芪扶正颗粒组:按15,10,5 g/kg剂量灌服贞芪扶正颗粒混悬液(主要成分:黄芪、女贞子;甘肃扶正药业科技股份有限公司生产;批号040803,15 g/袋).大、中、小剂量复方阿胶浆组:分别按10,20,30 mL/kg剂量灌胃复方阿胶浆(主要成分:阿胶、熟地黄、党参、山楂、人参、蔗糖;山东东阿阿胶股份有限公司生产,批号050446,250 mL/瓶),司坦唑醇组:按4 mg/kg剂量灌胃司坦唑醇混悬液(司坦唑醇片,广西南宁百会药业集团有限公司生产,批号050306,30·mg/片).空白组和模型组:灌胃同体积的生理盐水(20 mL/kg).每天给药1次,连续给药14 d.除空白组外,其余组小鼠皮下注射体积分数0.25苯的玉米油溶液4 mL/kg复制苯油溶液致小鼠再生障碍性贫血模型,空白组皮下注射同体积玉米油.②各组小鼠分别于末次给药后24 h,进行血常规检测.取右侧股骨,冲出骨髓细胞,采用BI-2000医学图像分析仪计数骨髓有核细胞数.③计量资料符合正态分布、方差齐者用t检验;方差不齐者用t'检验.结果:小鼠90只均进入结果分析.①血细胞测定结果比较:模型组小鼠血红细胞、白细胞、血小板计数和血红蛋白水平明显低于空白组(t=3.39～11.89,P＜0.01).司坦唑醇组3项血细胞计数和血红蛋白水平明显高于模型组(t＝4.94～6.73,P＜0.01).大、中剂量贞芪扶正颗粒组和各剂量复方阿胶浆组血白细胞计数明显高于模型组(t=2.32～3.03,P＜0.05～0.01).中剂量贞芪扶正颗粒组和各剂量复方阿胶浆组小鼠血红细胞计数明显高于模型组(t=2.15～4.84,P＜0.05～0.01).大、中剂量贞芪扶正颗粒组和各剂量复方阿胶浆组血红蛋白水平明显高于模型组(t=2.33～4.45,P＜0.05～0.01).大、中剂量贞芪扶正颗粒组和各剂量复方阿胶浆组血小板计数明显高于模型组(t=4.06～6.24,P＜0.01).②骨髓有核细胞数:模型组明显低于空白组(t=8.99,P＜0.01).司坦唑醇组、中剂量贞芪扶正颗粒组和小剂量复方阿胶浆组明显高于模型组(t=2.39～2.82,P＜0.05).结论:贞芪扶正颗粒、复方阿胶浆对皮下注射苯所致小鼠再生障碍性贫血模型血细胞状况及骨髓象均有较好的改善作用,以贞芪扶正颗粒有较为明显的剂量依赖关系.
-
传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果的比较
目的:比较传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果,建立一种适合于人胎肝细胞冷冻保存的方法.方法:实验于2006-07/11在广州医学院进行.①人胎肝组织取自中期终止妊娠胎儿(20周,经胎儿亲属知情同意及医院伦理委员会批准).冷冻保护液包括A液(DMEM培养液含1.5 mol/L乙二醇+体积分数为0.2胎牛血清);B液(A液+0.1 mol/L蔗糖)两部分.②传统冻存法:用0.025%Ⅰ型胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞.胎肝细胞在A液、B液中分别渗透平衡20 min后,在冷冻保护B液中经液氮蒸汽冷平衡5 min后迅速入液氮冻存,1周后复苏培养观察.③改良冻存法:胎肝组织在A液、B液中分别渗透平衡20 min后,在冷冻保护液B液中经液氮蒸汽冷平衡5 min后迅速人液氮冻存,1周后复苏,入DMEM培养液37℃孵育1 h,胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞培养观察.④新鲜分离的胎肝细胞做为对照组.⑤复苏后分离所得胎肝细胞用锥虫兰染色评估细胞活率,并记录贴壁时间,观察集落生长情况.结果:①锥虫兰染色结果显示传统冻存法复温后的胎肝细胞活率为(73.8±2.2)%,明显低于新鲜分离的胎肝细胞活率(89.2±3.6)%及改良冻存法所得胎肝细胞活率(82.5±4.2)%(P＜0.01).②贴壁情况观察发现新鲜胎肝细胞与改良冻存法胎肝细胞于培养24 h开始贴壁,而传统冻存法胎肝细胞贴壁时间滞后48 h.③新鲜胎肝细胞及改良冻存法胎肝细胞于第3天出现生长集落(细胞数＞10为一个集落),传统冻存法胎肝细胞在第5天出现生长集落,集落的数量低于改良冻存法及对照组(P＜0.01).结论:改良冻存法可避免冻存前损伤,提高细胞对冷冻的耐受性和冻存复温后细胞的活率.
-
急性高黏滞血症模型大鼠血液流变学指标及红细胞生理特性对大蒜素干预的反应
背景:血栓性疾病多伴有血液流变性异常,大蒜素对其血液流变性及红细胞流变性等生理特性是否能产生相应影响?目的:观察大蒜素对急性高黏滞血症大鼠血液流变学指标及红细胞生理特性的影响.设计:单纯随机对照动物实验.单位:中国农业大学食品与营养工程学院.材料:选用50只Wistar大鼠,雌雄各半,体质量(200±20)g,鼠龄三四个月,购自北京海淀通利实验动物养殖中心.大蒜素注射液产自上海禾丰制药有限公司(大蒜素浓度15 g/L,批号20051001).主要仪器:NXE-1型锥板式黏度仪(成都仪器厂产品),DXC-300型核孔膜红细胞变形能力测定仪(上海医科大学仪器厂产品),650-60荧光偏振仪(日本日立公司).微量高速离心机(航空航天部华兴航空机轮公司产品).方法:实验于2006-02/04在中国农业大学食品与营养工程学院生物工程实验室完成.随机摸球法将大鼠分成5组:对照组、模型组、大蒜素低剂量组、大蒜索中剂量组、大蒜素高剂量组,每组10只.除对照组,其余组别每只大鼠灌胃自来水5 mL/d,连续7 d,第7天皮下注射浓度为0.1%的肾上腺素0.8 mL/kg,注射2 h后,浸入冰水中5 min,间隔4 h注射第2次,制作急性高黏滞大鼠模型.造模后2 d,对照组及模型组分别开始给予腹腔注射生理盐水2 mL/(kg·d),大蒜素高、中、低剂量组分别给予大蒜素5,10,20 mg/(kg·d),1次/d,连续用药7 d.通过黏度法测定全血黏度、血浆黏度、红细胞压积及红细胞聚集指数;核孔膜滤过法测定红细胞滤过指数;荧光偏振法测定红细胞膜流动性(红细胞膜荧光偏振度);进行红细胞渗透脆性试验(红细胞渗透脆性试验中开始溶血及完全溶血时的NaCl溶液浓度),比较各组间不同指标的差异.主要观察指标:①大蒜素对红细胞聚集性的影响(全血黏度、血浆黏度、红细胞压积、红细胞聚集指数);②大蒜素对红细胞变形性的影响(滤过指数);③大蒜素对红细胞渗透脆性的影响(试验中开始溶血及完全溶血时的NaCl溶液浓度).④大蒜索对红细胞膜流动性影响(红细胞膜荧光偏振度).结果:纳入大鼠50只,其中8只大鼠采血量不足或死亡,其余42只均进入结果分析.①大蒜素对红细胞聚集性的影响:与模型组比较,大蒜素高、中、低剂量组对血瘀症大鼠全血高切黏度分别降低14.43%、9.71%、4.15%(P＜0.05～0.01),全血低切黏度分别降低15.89%、14.27%、6.86%(P＜0.01),血浆黏度分别降低11.33%(P＜0.05)、9.78%(P＜0.05)、3.49%(P＞0.05),且上述作用呈现一定的量效关系.大蒜素高剂量组可明显降低红细胞压积(P＜0.05),降低程度为6.47%.②大蒜素对红细胞变形性的影响:模型组大鼠滤过指数高于对照组(0.228±0.025,0.175±0.043,P＜0.05),大蒜素高剂量组滤过指数为0.176±0.034,低于模型组(P＜0.05).③大蒜素对红细胞渗透脆性的影响:模型组开始溶血及完全溶血时的NaCl溶液浓度较对照组稍高,大蒜素各剂量组对红细胞渗透脆性的增大有改善作用,但均无统计学意义.④大蒜素对红细胞膜流动性影响:模型组红细胞膜荧光偏振度明显增高,表明膜流动性降低,大蒜素各剂量组对红细胞膜流动性的降低均有改善作用,但无统计学意义.结论:大蒜素可提高红细胞变形性和降低血液黏度,改善血液流变性,而用于血瘀症的防治.
-
STO转基因小鼠饲养层细胞的佳预处理条件
目的:为保持胚胎干细胞的高度未分化状态,饲养层细胞成为胚胎干细胞体外培养中不可缺少的条件.本实验分析STO转染白血病抑制因子小鼠饲养层细胞的佳预处理条件.方法:实验于2006-09/2006-11在中国医科大学病理生理学教研室完成.实验材料:DMEM、FBS、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青链霉素、β-巯基乙醇、丝裂霉素C均购于美国Sjgma公司;STO转染白血病抑制因子小鼠饲养层细胞和D3系小鼠胚胎干细胞由日本信州大学惠赠.实验方法:将STO转基因小鼠饲养层细胞和D3系小鼠胚胎干细胞分别培养于10%DMEM中,其中含体积分数为0.1 FBS、0.1 mol/L非必需氨基酸、2 mol/L L-谷氨酰胺、100 u/mL青链霉素、0.1 mol/L β-巯基乙醇.向10%DMEM中加入终浓度为100 u/mL的白血病抑制因子,保持D3系小鼠胚胎干细胞的未分化状态.用6,10,20,30 mg/L丝裂霉素C处理STO转基因细胞,同时设置未经丝裂霉素C处理的STO转基因细胞为对照.将经丝裂霉素C处理过的各组单细胞悬液分别以6×103,7×103,8×103,9×103,1×104,2×104,3×104,4×104,5×104,6×104/cm2细胞密度接种于12孔板内,培养过夜.次日取预处理效果佳组的STO转基因细胞作为饲养层细胞培养D3系小鼠胚胎干细胞,将D3系小鼠胚胎干细胞以1×104/cm2接种于上述经过丝裂霉素C处理过的STO转基因细胞上,观察D3系小鼠胚胎干细胞附壁、增殖情况及有无分化.结果:①丝裂霉素C对STO转基因细胞生长的影响:不同质量浓度丝裂霉素C均能抑制STO转基因细胞增殖,其中6mg/L处理组STO转基因细胞虽有增殖能力,但较对照组增殖速度明显减慢,10 mg/L以上处理组细胞数量不但没有增加,反而稍有下降.②丝裂霉素C对STO转基因细胞形态的影响:6 mg/L丝裂霉素C处理组STO转基因细胞形态未见明显变化;10 mg/L以上丝裂霉素C处理组STO转基因细胞,随着丝裂霉素C质量浓度的增加,形态变异逐渐明显,以星形细胞和裂解大泡居多.③饲养层细胞密度对胚胎干细胞培养的影响:本实验中10 mg/L丝裂霉素C处理组预处理效果佳,取该处理组作为饲养层培养D3系小鼠胚胎干细胞.次日于显微镜下观察,以不同细胞密度接种的饲养层培养的小鼠胚胎干细胞形态无明显差异,随着饲养层细胞接种密度的增加,形成的干细胞集落逐渐增多、增大,集落细胞排列逐渐紧密,以2×104/cm2密度饲养层组佳.随着饲养层细胞密度的继续增加,形成的干细胞集落相对减少,集落细胞排列渐疏散.结论:10 mg/L丝裂霉素C作用的STO转染白血病抑制因子细胞3 h即可达到较好的处理效果,适宜STO转基因小鼠饲养层细胞的接种密度为2×104 /cm2.
-
成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化实验
背景:嗅鞘细胞的纯化方法以及嗅鞘细胞纯度的不同被认为与嗅鞘细胞移植后的效果有关.因此,开发高效、便于统一的纯化方法对嗅鞘细胞移植研究的标准化非常重要.目的:为嗅鞘细胞移植研究的标准化提供一个高效、便于统一的纯化方法.设计:随机对照实验.单位:东南大学临床医学院附属中大医院骨科,东南大学临床医学院中心实验室,东南大学临床医学院实验动物中心.材料:实验于2006-02/08在东南大学临床医学院中心实验室完成.选用28只成年雌性SD大鼠,体质量200～250 g;DMEM/F-12(GIBCO);2.5 g/L胰蛋白酶(GIBCO);左旋多聚赖氨酸(SlGMA);牛垂体萃取液(SIGMA);胎牛血清(杭州四季青生物试剂公司);兔抗p75抗体(SIGMA);生物素化羊抗兔IgG(武汉博士德生物技术公司);MTT试剂盒(SlGMA).方法:将SD大鼠嗅球中分离出嗅鞘细胞的原代培养物,体外培养8 d,将培养物分为4组:差速贴壁组、免疫吸附组、改良方法组、对照组.①改良方法组细胞悬液接种到未经包被的培养瓶在37℃、体积分数为0.05CO2的环境中孵育1 h,将上清液接种到培养瓶中(底面用1 mg/L的兔抗p75抗体润湿后在37℃下烘干,再用DMEM/F-12洗涤1次).上清液在这种已包被兔抗p75抗体的培养瓶中37℃、体积分数为0.05 CO2下孵育45min,DMEM/F-12洗涤5遍以清除未贴壁的细胞,用细胞刮刀收获贴壁细胞、离心、重新悬浮在含20 mg/L牛垂体萃取液和10万U/L青链霉素的D/F-10S中;Nash差速贴壁组细胞按Nash的方法进行操作;抗p75抗体免疫吸附组细胞按照Ramo'n-Cueto的方法进行操作;上述纯化方法获得的3组细胞悬液分别接种到包被左旋多聚赖氨酸的24孔细胞培养板中,在37℃、体积分数为0.05 CO2的环境中培养14 d.对照组未经纯化的细胞悬液同样重新悬浮在含20 mg/L牛垂体萃取液和10万U/L青链霉素的D/F-10S中并接种到包被左旋多聚赖氨酸的24孔细胞培养板中,培养条件同其他组.②在各组处理结束后2,5,8,10,12,14 d进行嗅鞘细胞纯度比较,每组每个时间点都随机选择15个视野计算嗅鞘细胞比例,这15个数值的平均值代表嗅鞘细胞纯度,从而评估这种改良方法的纯化效率.③分别用MTT法检测处理后第14天各组细胞活力.主要观察指标:各组嗅鞘细胞纯度、处理后14 d细胞活力检测结果.结果:①改良方法组每个时间点的嗅鞘细胞纯度都高于其他3组(P＜0.05～0.01),各组嗅鞘细胞纯度都随培养时间延长而降低,但改良方法组的纯度变化小,改良方法组后1个时间点的纯度仍然很高(92.1±1.2)%,而其他组高只有(85.2±2.2)%.②处理结束后第14天,改良方法组嗅鞘细胞细胞活力与其他组细胞活力差异无显著性(P=0.895).结论:本组纯化成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的改良方法是高效的,而且对嗅鞘细胞的活力无额外损害,将有益于嗅鞘细胞研究的标准化.
-
大鼠羊膜上皮细胞植入损伤脊髓后的存活与迁移
背景:有研究表明羊膜上皮细胞能够表达神经系统细胞的几乎全部特异性抗原,且可以分泌多种神经营养因子及递质,如果羊膜上皮细胞用于代替神经细胞,其神经营养作用必将为治疗脊髓损伤和神经退行性病变带来广阔前景.目的:观察大鼠羊膜上皮细胞移植人损伤脊髓后的存活、迁移及分泌情况.设计:观察实验.单位:吉林大学基础医学院组织与胚胎学教研室.材料:选用1只孕12～14 d及18只成年雄性Wistar大鼠,体质量300～350 g,由吉林大学实验动物中心提供.免疫组织化学染涂色试剂:小鼠抗大鼠溴核苷脱氧嘧啶单克隆抗体购自Sigma公司;兔抗大鼠神经营养素-3多克隆抗体和兔抗大鼠BDNF多克隆抗体(博士德公司);SP免疫组织化学染色试剂盒购自迈新公司.方法:实验于2005-07/10在吉林大学基础医学院组织与胚胎学教研室完成.①大鼠脊髓损伤模型的建立:大鼠麻醉后,分离皮下组织肌肉,用咬骨钳咬除棘突及椎板,暴露脊髓,用止血钳以一扣力度钳夹脊髓全截面3 min,青霉素涂撒创口,缝合肌肉皮肤.术中根据需要吸入乙醚麻醉,1周后移植.②羊膜上皮细胞的获取和培养:取孕12～14 d的Wistar大鼠胎盘剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块,经消化培养后,机械吹打使其成为单细胞悬液接种于培养瓶中.③羊膜上皮细胞移植人损伤脊髓:切开原创口,暴露损伤脊髓,将5μL羊膜上皮细胞悬液以1×1012 /L的浓度用微量注射器在距损伤处上缘3 mm处注入,注入时间为3 min,停针5 min后缓慢拔出,缝合肌肉、皮肤.④取材及免疫组织化学分析:分别于羊膜上皮细胞移植人1,3周后取材,即室温下40 g/L多聚甲醛灌流固定后在PBS缓冲液中浸泡20 min,4℃下一抗孵育过夜,二抗生物素化抗小鼠或兔lgG 37℃孵育20 min,辣根过氧化物酶标记的三抗于37℃孵育20 min,0.2 g/L二甲基联苯氨显色或AEC显色.主要观察指标:羊膜上皮细胞移植入损伤脊髓1,3周后的存活、迁移及分泌情况.结果:羊膜上皮细胞移植1周后,羊膜上皮细胞仍多聚于软脊膜下,可见阳性细胞核;羊膜上皮细胞移植3周后,羊膜上皮细胞迁移更加广泛,中央管及周围灰质中有大量阳性细胞;同时可观察到在损伤脊髓中移植的羊膜上皮细胞能够表达神经营养素3,表现为显红色的阳性细胞和脑源性神经营养因子.结论:羊膜上皮细胞在大鼠损伤脊髓内能够至少存活3周并有广泛迁移,此外还能够分泌神经营养因子脑源性神经营养因子和神经营养素3.
-
外源性骨髓间充质干细胞在糖尿病模型大鼠体内向胰腺迁移并分化为胰岛细胞的趋势
目的:观察尾静脉注射骨髓间充质干细胞在糖尿病模型大鼠体内定向迁移至胰腺组织的规律.方法:实验于2004-08/2006-03在唐山工人医院中心实验室,华北煤炭医学院动物中心完成.实验材料:青年SD大鼠购自华北煤炭医学院动物中心(动物级别:SPF/VAF;许可证号:SCXK2002-0003).实验方法:①采用密度梯度离心结合贴壁培养方法分离、纯化雄性大鼠骨髓间充质干细胞,并采用免疫组织荧光法鉴定.②将30只雌性大鼠完全随机分为3组:生理盐水组、骨髓间充质干细胞组、糖尿病模型组,每组10只.骨髓间充质干细胞组大鼠经尾静脉注射1×106 L-1骨髓间充质干细胞0.2 mL;生理盐水组大鼠尾静脉注射0.2 mL生理盐水;糖尿病模型组检测大鼠各基础血糖值及体质量,按65 mg/kg计算所需链脲佐菌素剂量,将其溶于柠檬酸钠缓冲液中,立即腹腔注射.用血糖仪及血糖试纸监测大鼠血糖,当血糖≥16.7 mmol/L且稳定2 d后经尾静脉注射1×106 L-1骨髓间充质干细胞0.2 mL.③应用原位杂交法检测雌性大鼠胰腺组织内Y染色体标志物及放射免疫法测定C-肽值.结果:30只大鼠均进入结果分析.①雌性大鼠腹腔注射链脲佐菌素后血糖检测:注射后2 d血糖水平开始迅速升高,4d后血糖值大于16.7 mmol/L且稳定在21 mmol/L左右,30只大鼠均造模成功.②免疫荧光法检测骨髓间充质干细胞表型:呈抗Laminin染色阴性、抗CD44染色阳性.③放射免疫法检测雌性大鼠血清中C-肽值:与注射前比较,骨髓间充质干细胞组及糖尿病模型组注射骨髓间充质干细胞后,大鼠血清中C-肽值呈明显升高的趋势[注射前:(0.398±0.094),(0.263±0.011) μg/L;注射后:(0.443±0.109),(0.374±0.961)μg/L,P＜0.05或P＜0.01],生理盐水组无明显变化.④鼠胰腺组织石蜡切片中Y染色体标记物表达:生理盐水组大鼠胰腺组织中未见黄绿荧光Y染色体标记物存在,骨髓间充质干细胞组和糖尿病模型组大鼠胰腺组织中均可见黄绿荧光Y染色体标记物存在,糖尿病模型组大鼠胰腺组织中黄绿荧光强度较大、数量较多.结论:体外分离培养的骨髓间充质干细胞经尾静脉注射后,在糖尿病模型大鼠体内可迁移至胰腺组织中,并具有分化为胰岛素分泌细胞的可能性.
-
粒细胞集落刺激因子动员急性心肌梗死患者自体外周血CD34+细胞数量变化:老年组与非老年组不同时间点差异
目的:研究证实随着年龄的增长外周血干细胞动员效率呈下降趋势,急性心肌梗死老年患者是否存在这种下降趋势还不清楚.对比观察粒细胞集落刺激因子对老年与非老年急性心肌梗死患者外周血干细胞的动员效果.方法:①选择2004-03/2006-01辽宁省心血管病医院心血管内科收治的35例急性心肌梗死(≤30 d)住院患者,男29例,女6例.按年龄分为两组:≥60岁为老年组,16例;＜60岁为非老年组,19例.两组患者性别、体质量、急性心肌梗死发生时间等基线资料基本一致,对本实验均知情同意.②包涵体型粒细胞集落刺激因子,商品名:惠尔血,麒麟昆鹏生物制药有限公司生产,批号030551,300 μg/支.③实验前两组患者均查白细胞计数和分类,以除外潜在血液系统恶性疾病的可能.患者入选后给予包涵体型粒细胞集落刺激因子,300～600 μg/d一次性注射皮下注射,连续5 d.分别在动员前和动员后第3,4,5,6,7天进行外周血中白细胞记数,将CD34+细胞视为干细胞,采用FACS Calibur流式细胞仪测定外周血中CD34+数量.结果:35例急性心肌梗死患者均全部进入结果分析.①两组患者粒细胞集落刺激因子动员前后外周血中自细胞数量的变化:两组动员前及动员后3,4,5,6,7 d外周血中白细胞数量差异均无显著性意义(P=0.142,0.763,0.150,0.448,0.856,0.431),且动员高峰均出现在第5～6天.②两组患者粒细胞集落刺激因子动员后不同时间点外周血中CD34+细胞数量的变化:两组动员前及动员后3,4,5,6,7 d外周血中CD34+细胞数量差异均无显著性意义(P=0.122,0.093,0.075,0.056,0.244),且动员高峰均出现在第5～6天.③外周血中白细胞数量与CD34+细胞数量相关性分析:两组外周血中白细胞数量与CD34+细胞数量均呈正相关,老年组r=0.89,非老年组r＝0.69.结论:老年与非老年急性心肌梗死患者外周血干细胞经粒细胞集落刺激因子动员后,二者外周血中自细胞数量与CD34+数量均基本相似.白细胞数量与CD34+数量呈正相关,且变化曲线高峰出现在动员后第5天或第6天.
-
大鼠骨髓间充质干细胞体内造血分化过程中加入硝普钠的作用
背景:硝普钠作为血管扩张剂加入骨髓间充质干细胞培养过程中,对其分化潜能发生何种影响?目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞体内向造血细胞分化过程中加入硝普钠后的变化,并与单纯细胞移植的效果进行比较.设计:随机区组,对照观察.单位:广东医学院微生物免疫学教研室,广州医学院病理生理教研室.材料:实验于2006-08在广州医学院完成.选取清洁级出生七八周balb/c小鼠27只作为受体,随机数字表法分为3组:细胞移植组、硝普钠+细胞移植组、空白对照组,9只/组.另选取4周龄SD大鼠1只作为实验用骨髓间充质干细胞的供体来源.注射用硝普钠(50 mg/支,北京双鹤现代医药技术有限责任公司,国药准字H11020907).方法:①无菌条件下取出SD大鼠的股骨,进行骨髓间充质干细胞的分离培养.传至六七代作为供体细胞,消化离心,调整浓度为1×109 L-1.细胞悬液中加入荧光素标记的抗体,流式细胞术检测表型.②取50 mg/支的注射用硝普钠1支,加入2.5 mL生理盐水混匀,从中取出1.0 mL液体加入到100 mL的生理盐水中,配成终浓度为200 mg/L,配置后4 h内使用.③各组小鼠细胞移植前均经5.0 Gy X射线全身照射4 h,吸收剂量率为1.45 Gy/min.照射完毕后,细胞移植组直接经尾静脉输注0.3 mL骨髓间充质干细胞悬液(含1.5×106个细胞);硝普钠+细胞移植组先注射已配好的200 mg/L硝普钠液体0.15 mL,1 min后立即输注骨髓间充质干细胞悬液0.3 mL(含1.5×106个细胞);空白对照组输注等量无血清培养液.④移植后60 d,各组存活小鼠眼眶外周取血,处死后常规制备骨髓及脾脏单细胞悬液,流式细胞术检测大鼠源性造血细胞CD11a与CD45的植入水平.主要观察指标:①骨髓间充质干细胞培养扩增情况.②不同组织大鼠源性造血细胞的植入水平检测.结果:作为受体的27只balb/c小鼠均存活至实验结束.①骨髓间充质干细胞培养扩增情况:培养3 d后细胞贴壁,形态比较均一,长梭形,至第6天细胞90%融合,无重叠.传代后24 h内细胞完全贴壁,长梭形,增殖生长迅速,3 d即达到完全融合.②不同组织大鼠源性造血细胞的植入水平检测:细胞移植组、硝普钠+细胞移植组在外周血、骨髓、脾细胞悬液中均可检测到低表达的大鼠源性造血细胞CD11a与CD45,且硝普钠+细胞移植组明显强于细胞移植组(t=2.619,P＜0.05);空白对照组CD11a与CD45呈阴性表达.结论:大鼠骨髓间充质干细胞具有向造血细胞分化的潜能,硝普钠可促进其分化.
-
经静脉移植人脐血间充质干细胞在鼠损伤脊髓的表达及神经功能修复
目的:采用Brdu免疫组化标记技术观察经静脉移植人脐血间充质干细胞进入损伤脊髓组织的表达情况,探讨其促进损伤脊髓神经功能恢复的作用.方法:实验于2003-10/2005-03在苏州大学生物技术研究所干细胞实验室完成.①选取健康成年Wistar大鼠60只,随机数字表法分为假手术组、模型对照组、干细胞移植组,20只/组.脐血标本来自苏州大学附属第一医院产科,产妇及其家属均签署知情同意书.②自脐带抽取新鲜脐带血50～60 mL,分离培养人脐血间充质干细胞,调整细胞浓度为5×109 L-1待用.在细胞移植前48 h,体外进行Brdu标记.③模型对照组、干细胞移植组大鼠采用重物压迫法建立脊髓损伤模型.麻醉后取俯卧位,于T11节段处行背后方正中切口,剥离椎旁肌,咬除T11棘突及椎板,显露4 mm×5 mm硬脊膜,将55 g重砝码放置于硬脊膜表面1 min,然后逐层缝合伤口.假手术组仅显露硬脊膜,然后缝合伤口.④造模后5 d,干细胞移植组大鼠自后肢大隐静脉缓缓注人人脐血间充质干细胞悬液0.2 mL～0.3 mL(1×106个).模型对照组、假手术组给予等量生理盐水.⑤分别于细胞移植后1 d、1,2,3周,采用Basso Beatlie Bresnahan(BBB)评分法和斜板试验法测定各组神经功能情况.于细胞移植后1,3周制作冰冻切片,检测各组脊髓组织内脐血间充质干细胞的分布情况.结果:①神经功能检测结果:脊髓损伤细胞移植后3周内,模型对照组、干细胞移植组大鼠后肢运动功能均有所恢复,但干细胞移植组恢复较快,于术后1周BBB评分和斜板试验结果即明显优于模型对照组[(10.71±6.24),(5.13±3.36)分,t=2.39,P＜0.05;(51.67±5.22),(46.63±3.72)度,t=3.39,P＜0.01],并维持至术后3周[(17.29±4.03),(11.25±5.01)分,t=3.89,P＜0.01;(65.77±8.06),(57.05±4.61)度,t=4.07,P＜0.01].②脊髓组织中人脐血干细胞的鉴定:假手术组、模型对照组脊髓组织中未见Brdu阳性表达区.干细胞移植组于移植后1周脊髓损伤区可见大量棕褐色Brdu阳性表达的人脐血间充质干细胞存在,并持续至移植后3周,而非损伤区则始终无阳性表达.结论:Brdu对脐血间充质干细胞具有良好的标记作用,经静脉移植的人脐血间充质干细胞能够进入脊髓损伤区,并可以促进损伤脊髓神经功能的修复.
-
大鼠脂肪和骨髓来源间充质干细胞基本生物学特征的比较
目的:分离大鼠脂肪和骨髓来源的间充质干细胞,比较两种间充质干细胞的生物学特征.方法:实验于2003-09/2006-11在广州市第一人民医院、湘雅医院中心实验室完成.取SD大鼠的股骨、胫骨、肱骨及腹股沟处脂肪垫进行骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞的分离.将骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞在含10%血清,1%双抗的低糖DMEM培养基,37℃、体积分数为0.05的CO2条件下进行培养.在细胞达到80%～90%融合时,使用0.25%胰酶消化传代.传代至第3代使用倒置显微镜观察骨髓和脂肪两种不同来源细胞的传代后的形态、贴壁、生长增殖、集落等情况.取消化传3代的两种细胞分别制成单细胞悬液进行细胞贴壁率的检测,贴壁率=贴壁细胞总数/接种细胞总数×100%.取第2代和第5代骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞以1×107 L-1密度培养.每天同一时间,随机抽取5孔细胞,加入5%噻唑兰20 μL/孔,培养4～6 h,吸出孔内液体,每孔加150 μL二甲基亚砜震荡10 min,酶联免疫测定仪测定波长490 nm处的吸光度,取5孔吸光度的均值,以时间为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制生长曲线.采用流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD34、CD44标记,免疫化学检测细胞CD29、CD34、CD44.结果:①在单位质量骨髓和脂肪组织中获得的间充质干细胞数量相当.两种细胞形态均为条索样,呈成纤维细胞形态.②应用直线相关分析,考察骨髓贴壁率与脂肪贴壁率之间的关系,相关系数r=0.999,决定系数r2=0.997(F=5 862.949,P＜0.001),两贴壁率之间有直线相关关系,不同的时间点两种细胞的贴壁率相似,并且有同向变化的趋势.③脂肪间充质干细胞的增殖能力与骨髓间充质干细胞相当.④脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞表面表达CD29、CD44,不表达CD34.结论:自大鼠脂肪中可提取出与骨髓间充质干细胞生物学特征类似的脂肪间充质干细胞.
-
多巴胺D1受体调控大脑神经前体细胞增殖的机制
目的:哺乳动物脑皮质中的多数神经细胞都产生于大脑发生期短暂存在的皮质增殖区,位于增殖区的细胞高水平表达多巴胺D1受体,实验探讨D1受体的相关功能作用.方法:实验于2002-06/2003-09在美国马里兰州立大学生物医学系完成.①选取孕14 d的CD1雌鼠8只,麻醉后解剖取出胎鼠大脑,以含20 mg/L表皮生长因子的无血清培养液培养脑皮质区的细胞作为实验模型.②细胞培养96 h后,离心粉碎.取40 μg样本于梯度SDS凝胶电泳,分离开的蛋白转移到纤维素膜,封闭后与细胞表型特异抗原(β-Ⅲ tubulin,Vimentin,Nestin)或多巴胺D1A或D1B的抗体4℃反应过夜,进行Westem Blot检测.③细胞培养72 h后,加入0,6.4,12.5,25,50,75,100 μmol/L多巴胺D1受体激动剂SKF38393和25·g/L BrdU处理6 h,与FITC-标记的抗BrdU抗体4℃反应过夜,固定后加入5 mg/L Pl和1 g/L Rnase,检测BrdU摄人情况.④在确定细胞周期基础特征的试验中,培养细胞不做药物处理,于培养后8,21,34,48,72,96 h分别采集.在监测多巴胺D1受体激动剂SKF38393对细胞周期影响的试验中,0～100 μmol/LSKF38393在培养后48 h被加入到培养皿中,孵育至96 h.在SKF38393的药理特异性试验中,同时加入75 μmol/LSKF38393和10μmol/L D1受体特异性拮抗剂SCH23390或NNC010756连续孵育48 h.离心固定后加入5 mg/L PI和1 g/L RNase.PI染色细胞可以显示分布于G0-1,S,G2-M期以及细胞凋亡情况.结果:①细胞表面不同抗原亚型的定量分布和动态变化:约60%细胞vimentin染色阳性,β-Ⅲ tubulin染色阳性细胞占35%,nestin染色阳性细胞占25%.Western blot蛋白定量分析结果显示,vimentin和nestin的表达呈增加趋势,且nestin尤为明显,相反β-Ⅲ tubulin的表达呈降低趋势.②细胞多巴胺D1受体表达的定量分析和动态变化:(95±4)%的细胞D1A受体表达阳性,(94±6)%的细胞D1B受体表达阳性.D1A、D1B受体在任何一个抗原亚型的细胞群中均有高比例表达.③多巴胺D1受体抑制表皮生长因子依赖性神经干细胞的BrdU摄入:0,6.4,12.5,25,50,75,100 μmol/L SKF38393呈浓度依赖性的抑制表皮生长因子支持的大脑前体细胞对BrdU的摄入比例,50 μmol/L时产生显著性差异(P＜0.05),细胞对BrdU的摄人比例降低至17%左右.④多巴胺D1受体抑制表皮生长因子依赖性神经干细胞的周期进展:SKF38393可以浓度依赖性地增加表皮生长因子支持的神经干细胞G0-1/S比值,无药物时G0-1/S值为3,加入SKF38393后升高至14(P＜0.05);当同时加入SKF38393和D1受体特异性拮抗剂SCH23390或NNC010756后,SKF38393对Go-1/S的升高作用被阻断,G0-1/S降低至无药物水平3(P＜0.05).此外SKF38393并不增加相应培养细胞中的凋亡细胞数.结论:多巴胺D1受体能够抑制表皮生长因子支持的神经干细胞增殖,主要是通过可逆性地受体特异性的抑制G1期的细胞进入S期,同时并不引起细胞凋亡的增加及分化来实现的.
-
骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死大鼠血管新生和内皮功能的影响
目的:通过检测血特异的内皮细胞标记物管性假血友病因子,观察骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死后大鼠局部新生血管情况,并探讨内皮血管功能指标E-选择素与新生血管的关系.方法:实验于2005-09/2006-06在唐山工人医院中心实验室完成.①选用清洁级健康近交系SD大鼠40只,随机数字表法分为假手术组、模型对照组、干细胞移植组、细胞培养基组,10只/组.②另取1只大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取.大鼠处死后无菌条件下分离股骨和胫骨,应用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞.待细胞80%贴满培养瓶底时,用乙二胺四乙酸和胰蛋白酶混合消化传代.将50 mg/L 4,6-二脒-2～苯基吲哚加入第3代细胞培养基中,制成细胞悬液备用.③术前各组大鼠均行气管插管,建立急性心肌梗死模型,以远端供血区心肌组织颜色苍白、心电图检测Ⅱ导联ST段持续抬高为模型建立成功的标志.假手术组仅开胸予以前降支穿线但不结扎.④造模成功后1～3 h,干细胞移植组用微量注射器吸取4,6-二脒-2-苯基吲哚标记好的第3代骨髓间充质干细胞悬液50 μL,直接注入梗死区边缘心肌组织.细胞培养基组按干细胞移植组的方法于相同部位注射等量无血清DMEM低糖培养基(pH值为6.9),模型对照组仅制作心肌梗死模型不作其他处理,假手术组亦不作其他处理.⑤造模后2,4周各组处死半数大鼠,切取心脏组织,于梗死边缘区心肌组织制作切片,荧光显微镜下观察4,6-二脒-2-苯基吲哚标记的供体细胞.链霉亲和素免疫组化法检测心肌细胞中血管性假血友病因子评估新生血管情况,酶联免疫吸附法测定血清E-选择素含量,评估内皮功能.结果:40只大鼠均进入结果分析.①各组大鼠心脏标本4,6-二脒-2-苯基吲哚标记移植细胞存活状况:骨髓干细胞移植治疗后,荧光显微镜下可见成团和散在的DAPI阳性细胞,其余3组大鼠心脏标本中均未见荧光细胞.②各组大鼠血清E-选择素的检测:心肌梗死后2,4周模型对照组及细胞培养基组E-选择素明显增高,与假手术组比较差异显著[2周:(36.04±4.47),(34.10±2.04),(13.37±3.01) μg/L;4周:(33.02±4.78),(33.96±5.18),(13.94±2.87)μg/L,P＜0.01],干细胞组移植组E-选择素较模型对照组明显降低[2周:(24.29±3.51),(36.04±4.47)μg/L;4周:(17.45±3.22),(33.02±4.78)μg/L,P＜0.05].③各组大鼠心肌组织血管性假血友病因子表达情况:链霉亲和素免疫组化法显示,造模后2周干细胞移植组心肌细胞血管性假血友病因子呈强阳性表达,模型对照组和细胞培养基组血管性假血友病因子表达减弱.造模后4周干细胞移植组心肌细胞血管性假血友病因子表达仍呈强阳性,模型对照组和细胞培养基组血管性假血友病因子表达有减弱趋势.结论:①移入的骨髓间充质干细胞存活.②骨髓干细胞移植治疗实验性大鼠心肌梗死模型后,可提高心肌细胞血管性假血友病因子水平,促进局部血管新生.③移植后心肌梗死大鼠血清中E-选择素的降低,可能与其参与血管新生有关,同时也提示骨髓干细胞移植不会诱发E-选择素增高而加重动脉硬化.
-
骨髓间质干细胞分泌胶质源性神经生长因子及对1-甲基4-苯基吡啶离子诱导PC12细胞凋亡的干预
目的:收集体外培养、纯化的骨髓间质干细胞条件培养液,检测其对多巴胺能神经元有保护作用的胶质源性神经生长因子分泌情况,并观察对1-甲基4-苯基吡啶离子诱导的PC12细胞凋亡的保护作用.方法:实验于2005-05/2006-10在中国医科大学附属一院神经内科实验室完成.①PC12细胞由协和医科大学细胞培养中心提供.1-甲基4-苯基吡啶离子(Sigma,USA,批号3707312).②选取清洁级SD大鼠20只,麻醉后取股骨和胫骨,去净肌肉取骨髓,按1010 L-1接种于含体积分数为0.2胎牛血清的低糖型DMEM培养基中,通过弃悬浮细胞及换液后可得到较纯的骨髓间质干细胞.培养第10天胰蛋白酶消化传代,当第2代细胞扩增至铺满瓶底80%时,改用含体积分数为0.05胎牛血清的低糖型DMEM条件培养液,48 h后收集培养液,经超滤浓缩系统(截留分子量为10 000)浓缩10倍后过滤除菌.③骨髓间充质干细胞接种于24孔板内,贴壁后多聚甲醛固定,磷酸盐缓冲液漂洗,免疫荧光法鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原的表达.骨髓间充质干细胞消化后进行细胞计数,按1×108 L-1接种于75 cm培养瓶,加入含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM培养液20 mL,于培养第5,10天采用ELISA法测定细胞培养上清液中的胶质源性神经生长因子含量.④PC12细胞置于RPMI1640培养液中,内含体积分数为0.1的马血清和0.05的胎牛血清,汇集至80%时进行传代接种,液氮罐中贮存备用.实验前首先置换培养液,使血清浓度降至为仅含0.01马血清和0.01胎牛血清,24 h后将培养的细胞分为4组:空白对照组,在细胞培养体系中不加入任何药物;骨髓间充质干细胞上清液组,接种后24 h在细胞培养体系中分别加入骨髓间充质干细胞上清液30,60,120 μL;1-甲基4-苯基吡啶离子组,接种后24 h分别加入1-甲基4-苯基吡啶离子,使终浓度分别为100,200,400 μmol/L;联合组,接种后24 h加入200 μmol/L 1-甲基4-苯基吡啶离子,24 h后再分别给予骨髓间充质干细胞上清液30,60,120 μL.⑤各组细胞于给药后24,48 h,流式细胞术检测PC12细胞的凋亡率;通过免疫细胞化学法和RT-PCR法检测PC12细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白和mRNA的表达.结果:①骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定:骨髓间充质干细胞可在体外分离扩增,其表面抗原CD45呈阴性,而CD44表达阳性.②骨髓间充质干细胞培养上清液中胶质源性神经生长因子水平检测:第5,10天培养上清液中的胶质源性神经生长因子浓度为(44.57±5.96)ng/L和(45.41±6.33)ng/L,差异无显著性意义(P＞0.05).(③PC12细胞凋亡情况:联合组200 μmol/L 1-甲基4-苯基吡啶离子作用PC12细胞24 h后,细胞凋亡率为(42.34±3.21)%;加入30,60,120 μL骨髓间充质干细胞上清液处理24 h后,细胞凋亡率分别降为(31.96±2.89)%,(17.89±1.78)%,(10.08±0.91)%,差异有显著性意义(P＜0.05).联合组药物作用48 h与24 h情况相似.④给药后各组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白及mRNA的表达:联合组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白和mRNA水平均明显低于1-甲基4-苯基吡啶离子组(t=0.05～0.32,P均＜0.05).结论:骨髓间充质干细胞能够分泌胶质源性神经生长因子,对1-甲基4-苯基吡啶离子诱导的PC12细胞凋亡产生保护作用.这种保护作用的强弱与其浓度有关,具体作用机制可能是通过抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白和mRNA水平实现的.
-
延迟植入嗅鞘细胞修复成鼠的胸髓损伤
背景:脊髓损伤后在一定的微环境中有再生的能力.嗅鞘细胞兼具星形胶质细胞和许旺细胞的特性,具有促进脊髓轴突再生的能力.目的:制作成鼠胸髓损伤模型,观察嗅鞘细胞对损伤脊髓轴突再生的作用.设计:观察性实验.单位:中山大学附属第二医院.材料:实验于2001-01/2002-11在中山大学附属第二医院完成.20只成年SD雄性大鼠,体质量(380±20)g,由中山大学实验动物中心提供(机构许可证号:SYXK(粤)2004-0020).低糖的DMEM培养液(L-DMEM,GibcoBRL公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、MBP(髓磷脂碱性蛋白,Sigma公司)、抗神经生长因子受体抗体(Sigma公司).应用随机数字表完全随机化分为细胞移植组和对照组,每组10只.方法:将成年SD大鼠麻醉断颈处死,无菌条件下取出完整嗅球分嗅神经.采用改良Allen法打击脊髓建立胸髓损伤模型.细胞移植组于损伤脊髓处注入10 μL嗅鞘细胞悬液(2.5×1010 L-1),对照组仅注入相同剂量DMEM/F12(1∶1)培养液.移植后6周通过组织学和免疫组织化学方法观察嗅鞘细胞对脊髓轴突再生的影响.主要观察指标;①抗神经生长因子受体抗体染色鉴定嗅鞘细胞.②髓磷脂碱性蛋白染色观察髓鞘的修复.③嗜银染色观察神经轴突再生.结果:细胞移植组有2只动物死亡,对照组有3只死亡,共15只大鼠进入结果分析.①细胞移植组可见损伤脊膜完整,较正常脊髓稍变细.苏木精-伊红染色见损伤区有多极细胞,且与脊髓组织有移行过度现象,说明存活的嗅鞘细胞与宿主融合良好.新生的轴突多呈束状,周围有小圆淋巴细胞浸润.嗜银染色可见再生轴突长入损伤区组织中,多与束状排列的多极细胞伴行;对照组脊髓损伤处明显变细,脊膜尚完整.苏木精-伊红染色见脊髓损伤区未见新生轴突.嗜银染色未见再生轴突.②细胞移植组可见多极细胞,多呈束状排列,胞浆内有大量抗神经生长因子受体抗体阳性颗粒存在,进一步证明嗅鞘细胞移植6周后仍然存活,且与宿主融合良好.髓磷脂碱性蛋白染色见损伤区有呈线状髓磷脂碱性蛋白阳性纤维,提示损伤区两端均有髓鞘样物质产生,且互相靠拢.同时多极细胞中也发现有髓磷脂碱性蛋白阳性物质存在,说明移植的嗅鞘细胞有产生髓鞘样物质的作用.对照组未见轴突再生.结论:嗅鞘细胞延迟植入成鼠打击伤后脊髓后,可存活并产生髓鞘样物质,促进宿主脊髓轴突再生.
-
海马区星形胶质细胞培养上清液体外诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞的分化
目的:观察海马区星形胶质细胞培养上清液能否在体外诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞分化.方法:实验于2004-10/2005-06在华北煤炭医学院中心实验室完成.在无菌条件下从Wistar乳鼠分离出海马组织,从分离的海马组织中获得星形胶质细胞,并收集其培养上清液.取外科手术获得的人腹部皮下脂肪组织进行人脂肪基质细胞的原代培养.30例患者均知情同意.取第3代人脂肪基质细胞接种到培养孔中,预先放置无菌盖玻片的24孔培养板,制备细胞爬片或者接种到培养瓶中,细胞生长达50%～60%融合时,去除培养液,换为海马区星形胶质细胞培养上清诱导液进行诱导,对照组培养液为无血清培养基.倒置相差显微镜下连续观察细胞生长情况和形态变化,应用免疫细胞化学、鉴定神经前体细胞的特异性标志神经巢蛋白、神经细胞的特异性标志神经元特异性烯醇化酶、微管联合蛋白2和神经胶质细胞的特异性标志胶质纤维酸性蛋白的表达.结果:①诱导培养第3天,部分人脂肪基质细胞开始变形,从原先的细长梭状细胞变成神经元样细胞,可见细胞伸出突起,多为双极或多极细胞.②刚分离接种的人脂肪基质细胞镜下呈圆形,悬浮状态,接种后24 h内贴壁,并开始伸展,多呈梭形.1周后细胞融合成单层,排列出现方向性,但有少量圆形及卵圆形细胞混杂生长.③第4,5代人脂肪基质细胞在诱导48 h后形态即开始发生变化,扁平的胞体较预诱导后逐渐回缩,向外伸出突起,72 h后扁平的胞浆向胞核收缩,突起继续延长,以后随时间进展,具有典型神经细胞形态特点的细胞数量逐渐增多,形成双极或多极细胞.④免疫细胞化学检测人脂肪基质细胞诱导5 d后发现有(10.5±3.7)%神经巢蛋白、(38.4±5.2)%胶质纤维酸性蛋白、(15.7±2.3)%神经元特异性烯醇化酶表达,未见微管联合蛋白2的表达.结论:海马区星形胶质细胞培养上清液可以在体外诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞方向分化.
-
胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1联合诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化特点
目的:观察胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1体外联合诱导对脊髓源性神经干细胞分化的影响,为了解神经干细胞在体内多因素环境下的分化表现提供实验依据.方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成.①碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白多抗,神经丝蛋白单抗(Sigma).②选用清洁级孕16 d的SD大鼠10只,无菌条件下取出胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养.基础培养基组成:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02 B27添加液的DMEM/F12.③原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆,在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清作为对照.同时设立碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1组、胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组,换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2 μg/L转化生长因子β1、10 μg/L胶质细胞源性神经营养因子+2 μg/L转化生长因子β1.观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化行为,免疫细胞化学染色标记神经元与星状胶质细胞的表达.④通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率.结果:①细胞分化的形态学观察:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程.在细胞密度较低区域可辨认出3种神经细胞类型:神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞.②神经干细胞免疫组织化学检测:血清对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组、胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性.③流式细胞荧光分选计数:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组神经元分化比例高,明显高于碱性成纤维细胞生长因子组(x2=19.56,P＜0.05),而与血清对照组、转化生长因子β1组比较差异有极其显著性意义(x2=24.15,25.32,P均＜0.01).碱性成纤维细胞生长因子组星状胶质细胞分化比例低,胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组组与其相近(x2=17.23,P＞0.05),而血清对照组、转化生长因子β1组则显著升高(x2=24.45,23.79,P均＜0.01).结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,为脊髓原位神经干细胞分化及神经干细胞移植体内后的分化表现提供了实验数据.
-
人羊膜负载猪骨髓间充质干细胞体外生长的形态特点
背景:人羊膜含胶原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板层体等多种成分,表达多种生长因子及其mRNA的相关蛋白,能为细胞的增殖、分化提供丰富的营养成分,有利于细胞的生长繁殖,其能否负载培养猪骨髓间充质干细胞良好生长值得研究.目的:建立人羊膜负载培养猪骨髓间充质干细胞生长的组织工程方法,观察骨髓间充质干细胞生长增殖的形态特点.设计:随机对照观察.单位:创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室,解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所.材料:实验于2003-01/11在解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.选用3只出生二三个月的贵州小香猪,雌雄不拘,体质量6～8 kg,由解放军第三军医大学实验动物中心提供.主要试剂:IMDM培养基(Hyclone,USA);优质胎牛血清PAA(Germany);Eosin B(Sigma,USA);OCT包埋剂(USA).主要仪器:BX51立式荧光显微镜(Olympus,Japan);IX70型倒置荧光显微镜(Olympus,Japan);恒冷切片机(2700-Frigcut,德国);骨髓穿刺针(江苏);超净工作台(苏净集团安泰公司);CO2恒温培养箱(QUEUE,USA).方法:按文献所述方法准备人羊膜,将按文献所述方法分离、培养的贵州小香猪骨髓间充质干细胞贵州小香猪的骨髓间充质干细胞原代培养、传代扩增后,以不同密度(0.84×105 /cm2,1.54×105 /cm2,2.75×105 /cm2)接种于人羊膜基质面,倒置显微镜及扫描电镜下观察不同培养密度骨髓间充质干细胞的生长增殖变化情况;将第2、3代骨髓间充质干细胞以1.54×105 /cm2的密度作为合适种植密度接种到由聚酯环支撑的人羊膜的基质面,长培养至18 d,逐日经卷膜、切片、苏木精-伊红染色光镜下观察人羊膜负载骨髓间充质干细胞生长情况,同时给予扫描及透射电镜.主要观察指标:不同培养密度及不同时间点骨髓间充质干细胞在人羊膜上的生长情况.结果:①不同种植密度人羊膜促进骨髓间充质干细胞生长比较:倒置显微镜下,以0.84×105 /cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞排列不规则、稀疏,间距大;以1.54×105 /cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞生长排列规则,密度适中,24 h前细胞轮廓清楚,细胞活性好;以2.75×105 /cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞拥挤生长,12 h后不见细胞轮廓,多见非贴附细胞,随时间的推移,细胞老化快,细胞碎屑多见.扫描电镜下,以0.84×105 /cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,胞体肥大,呈不规则的长多边形扁平状,见粗细突起,细胞间距大;以1.54×105 /cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞密度适中,胞体肥大,呈不规则的长多边形扁平状,粗细突起较多,突起相互连接交织.细胞边缘有重叠现象;以2.75×105 /cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞拥挤重叠生长,周围突起不明显,边缘卷折,细胞碎屑多见.②不同时间点人羊膜负载骨髓间充质干细胞生长情况:倒置显微镜下,骨髓间充质干细胞接种在人羊膜的基质面后很快贴附生长,30 min 内就可见到骨髓间充质干细胞在人羊膜基质面上的贴附生长象.24 h后可见几乎全部骨髓间充质干细胞贴附生长,细胞活力好,折光度强,48 h后融合为单层,第4～18天可见骨髓间充质干细胞在人羊膜的基质面密集生长.苏木精-伊红染色可见骨髓间充质干细胞在人羊膜的基质面呈放射状、漩涡状或平行生长,胞体较大,呈梭形,胞核居中、深染、大而清晰,细胞形态较为一致;扫描电镜下,骨髓间充质干细胞在人羊膜的基质面生长4 d,排列密度适中,胞体肥大呈不规则的长多边形扁平状,粗细突起丰富,部分突起相互连接交织成网,胞膜形成突起牢固粘附于人羊膜基质上;透射电镜下,骨髓间充质干细胞在人羊膜的基质面生长4 d切面,骨髓间充质干细胞在人羊膜上大多呈双层生长,细胞呈纺锤状,胞核两端胞浆突起较长,互相重叠,染色质以常染色质为主,核仁明显,可见丰富细胞器,如粗面内质网,线粒体.结论:人羊膜对骨髓间充质干细胞有明显的促增殖作用,骨髓间充质干细胞可以人羊膜为载体在体外进行培养,人羊膜是骨髓间充质干细胞的良好载体.
-
血管内皮生长因子联合骨髓单个核细胞自体移植治疗大鼠肢体缺血
目的:将血管内皮生长因子应用于骨髓单个核细胞自体移植治疗肢体缺血,探索一种简单、安全有效治疗肢体缺血的方法,同时初步分析血管内皮生长因子促进血管新生的机制和疗效.方法:实验于2005-03/2006-07在上海交通大学附属第六人民医院动物实验中心完成.将48只雄性Wistar大鼠采用随机单位组设计分为4组:缺血对照组、血管内皮生长因子治疗组、骨髓单个核细胞治疗组、转染血管内皮生长因子基因的骨髓单个核细胞治疗组,每组12只.结扎所有动物左后肢股动脉及分支,制备后肢缺血模型.以微量加样器自结扎处以下2 cm开始,间隔0.2 cm为一注射点,共注射于内收肌和腓肠肌5点,每注射点各注射60 μL,缺血对照组大鼠注射300 μL培养液,血管内皮生长因子治疗组大鼠注射含5 pg基因pcDNA3.1-hVEGF165的DNA-脂质体复合物,骨髓单个核细胞治疗组大鼠注射3×106个骨髓单个核细胞,转染血管内皮生长因子基因的骨髓单个核细胞治疗组大鼠注射含3×106个血管内皮生长因子的骨髓单个核细胞.于移植后4周行动脉造影,采用RT-PCR检测血管内皮生长因子基因的体内表达,采用免疫组化法检测缺血区新生血管密度,评价血管新生情况.结果:48只大鼠均造模成功,并进入结果分析.①移植后4周动脉造影显示,缺血对照组大鼠股动脉及其分支均未显影,血管内皮生长因子治疗组和骨髓单个核细胞治疗组可见中等量新生血管,两组效果相似,转染血管内皮生长因子基因的骨髓单个核细胞治疗组可见有大量新生血管新生,丰富的侧枝循环建立.②大鼠毛细血管密度测定结果显示,血管内皮生长因子治疗组和骨髓单个核细胞治疗组均较缺血对照组新生血管数量增加,转染血管内皮生长因子基因的骨髓单个核细胞治疗组可进一步增强疗效[(10.0±0.8),(21.7±1.9),(20.4±3.3),(42.1±3.5)个/HP,P＜0.05],血管内皮生长因子治疗组和骨髓单个核细胞治疗组两组之间差异无明显统计学意义(P＞0.05).③RT-PCR检测大鼠血管内皮生长因子基因的体内表达,转染血管内皮生长因子基因的骨髓单个核细胞治疗组和血管内皮生长因子治疗组均有扩增,转染血管内皮生长因子基因的骨髓单个核细胞治疗组人血管内皮生长因子mRNA相对含量表达高于血管内皮生长因子治疗组(0.191±0.044,0.094±0.032,P＜0.05).结论:本组实验结果说明采用骨髓单个核细胞作为基因载体细胞治疗大鼠肢体缺血,能使血管内皮生长因子获得稳定有效的表达,其效果优于直接基因注射.
-
骨髓源性神经样细胞体外存活、增殖的特性
目的:寻找骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样/星形胶质样细胞的有效方法,并评价其体外存活和增殖特性.方法:实验于2005-07/2006-08在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成.采用贴壁筛选法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.收集第5代骨髓间充质干细胞单细胞悬液,以1×109 L-1置人6孔培养板中,加入DMEM+20%胎牛血清生长培养基,24 h后更换生长培养基为DMEM/F12+2%B27+40 μg/L碱性成纤维生长因子+20 μg/L内皮生长因子诱导分化培养基,诱导10～20 d,即采用多因子分阶段逐步诱导方法定向诱导骨髓间充质干细胞分化为神经前体样细胞.更换诱导分化培养基为DMEM/5%胎牛血清生长培养基,分两组进行诱导:一组向神经元样诱导分化:全反式维甲酸连续加样,首次浓度0.5 μmol/L,以后每天全量加样;二组向星形胶质样细胞诱导分化:10 μg/L血小板衍生生长因子BB首次加样,以后每天半量加样,均连续诱导10～14 d,进而分化为神经元样/星形胶质样细胞.应用活细胞计数试剂盒CCK-8检测神经元样/星形胶质样细胞的增殖及存活情况,绘制生长曲线及细胞存活曲线.结果:①碱性成纤维生长因子+表皮生长因子连续诱导7 d后骨髓间充质干细胞分化为球团样的神经前体样细胞,巢蛋白表达阳性.②全反式维甲酸、血小板衍生生长因子BB分别连续诱导10 d后骨髓间充质干细胞逐步分化出神经元样、星形胶质样细胞,并分别表达纤维丝蛋白200及胶质纤维酸性阳性蛋白.③神经元样细胞早期生长较缓慢,具有一定的增殖能力,六七天后达到高峰,此后增殖能力明显下降,细胞存活率明显下降,十四五天之后细胞存活率下降到7.6%以下,难以传代培养.星形胶质样细胞初期生长慢,5 d后生长加速,进入对数生长期,七八天后进入平台期,仍保持较高的细胞存活率.结论:采用多因子分阶段诱导方法可成功诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样/星形胶质样细胞.神经元样细胞存活、增殖能力较差,难以传代,星形胶质样细胞存活、增殖能力较强,可建立传代的二倍体细胞系.
-
细胞间接触诱导大鼠骨髓间质干细胞向平滑肌细胞的分化
背景:干细胞能够分化为血管平滑肌细胞,参与动脉粥样硬化发生、发展,其机制尚不清楚."环境诱导分化学说"认为细胞-细胞接触、细胞因子可能在干细胞分化过程中起关键作用.骨髓间质干细胞具有向平滑肌细胞分化的潜能.目的:体外诱导骨髓间质干细胞分化为平滑肌细胞,观察已分化成熟平滑肌细胞及细胞因子对骨髓间质干细胞分化的影响.设计:以细胞为观察对象的重复观察测量,对照性体外实验.单位:西安交通大学第一医院心内实验室.材料:实验于2003-05/2004-05在西安交通大学第一医院心内实验室完成.SD大鼠60～80 g、90～110 g,雌雄不限,由本校动物中心提供.PE标记小鼠抗大鼠CD34(Santa Cruz),PE标记小鼠抗大鼠CD71(Oxford Biotechnology),FITC标记小鼠抗大鼠CD90(Oxford Biotechnology),小鼠抗人单克隆抗体SM-α-actin(NeoMarkers),小鼠抗人单克隆抗体Calponin(NeoMarkers),TRITC标记山羊抗小鼠IgG(SBA),pEGFP-N3(本实验室提供),Lipofectamine2000(Invitrogen).方法:采用密度梯度离心和细胞贴壁法与组织贴块法分离培养骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞.通过流式细胞仪检测,平滑肌细胞抗体免疫荧光染色,鉴定骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞.将骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白,以未转染的骨髓间质干细胞为对照.骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞分条件培养:①取3代骨髓间质干细胞传至12孔培养板,培养液为低糖DMEM加骨髓间质干细胞条件培养液各半,胎牛血清浓度为0%、5%、7.5%.细胞固定后,应用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果.②将半透膜小室置于6孔培养板每一孔内,使每孔隔成内外两室.将骨髓间质干细胞在外室培养,平滑肌细胞在内室培养.以单独培养的骨髓间质干细胞为对照,胎牛血清浓度为3%、7.5%.用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果.③骨髓间质于细胞与平滑肌细胞混合培养:于骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白后24 h,向每孔内加入等量的平滑肌细胞昆合培养,观察细胞形态变化.以单独培养的骨髓间质干细胞为对照.主要观察指标:①骨髓间充质干细胞流式细胞仪检测结果.②不同条件培养下平滑肌细胞抗体免疫荧光染色结果.结果:①免疫荧光染色示,平滑肌细胞抗SM-α-actin阳性,抗calponin阳性.骨髓间质干细胞抗SM-α-actin阳性,而抗calponin阴性.②流式细胞仪检测,骨髓间质干细胞不表达CD34,弱表达CD71,高表达CD90.③骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白持续表达约2周～3周.④加入平滑肌细胞培养液或不同浓度的胎牛血清,骨髓间充质干细胞生长良好.骨髓间充质干细胞与平滑肌细胞分层培养中,骨髓间充质干细胞生长对胎牛血清呈浓度依赖性.骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养7 d后免疫荧光染色,可见绿色荧光蛋白和抗SM-α-actin、Calponin的双标细胞存在.而加平滑肌细胞条件培养液与分层培养组中骨髓间质干细胞均不表达Calponin.结论:①平滑肌细胞培养液及细胞因子只能促进骨髓间充质干细胞生长,细胞胞浆颗粒增多,并不能诱导骨髓间充质干细胞分化为平滑肌细胞.②细胞间直接接触对诱导骨髓间质干细胞定向分化为平滑肌细胞起决定作用.
-
干细胞移植治疗急性心肌梗死
目的:介绍干细胞移植治疗急性心肌梗死的基础研究及临床应用进展.资料来源:应用计算机检索PUBMED 1996/2007与干细胞移植治疗急性心肌梗死相关的文章,检索词"acute myocardial infarction,stroke,stem cell",限定文献语种为"English";同时检索万方数据库2000/2007相关文章,检索词"干细胞,急性心肌梗死,移植",限定文献语种为中文.资料选择:共检索到相关文献200余条,选择与干细胞移植治疗急性心肌梗死的移植细胞来源、移植方法、移植时间和剂量以及临床应用尚存在问题相关的文章,无论观察对象为人或动物、无论是否有对照组均纳入,排除综述和重复文献.资料提炼:经筛选文题后进一步查找全文,纳入33篇进行综述.其中24篇与移植细胞来源来源有关,7篇介绍移植方法,2篇介绍移植时间和剂量选择以及存在的问题.资料综合:①目前用于治疗心肌缺血的干细胞分为两类,一是肌肉类细胞,主要指胚胎心肌细胞、胚胎干细胞和骨骼肌干细胞;另一类是非肌肉类细胞,主要指骨髓于细胞和周围血干细胞.②干细胞移植治疗急性心肌梗死的方法主要有直接心外膜、心内膜注射、静脉输注和经冠状动脉导管注射4种形式,其中经冠状动脉注射较为直接,创伤小,可能是有前途的移植途径.③已有的实验结果显示适宜干细胞移植的时机应是炎症反应过后,瘢痕扩展之前;移植骨髓单核细胞或间充质细胞的剂量为106或108,但确切的时间和剂量还有待探索.结论:干细胞移植在治疗急性心肌梗死方面已经表现出传统治疗方法无可比拟的优越性,可以在梗死的心肌中分化形成有功能活化的心肌、血管、内皮等组织,改善心脏的功能,但干细胞的移植是一个全新的领域,还有许多问题有待解决.
-
干细胞与肿瘤干细胞
目的:概述干细胞、肿瘤干细胞与肿瘤发生发展之间的关系,为肿瘤的研究及临床治疗提供参考.资料来源:检索PubMed 1997-01/2007-02与干细胞和肿瘤干细胞相关的文献,检索词"stem cell,cancer stem cell,cancer,development,self-renewal,tumorigenesis",并限定语言种类为英文.资料选择:对资料进行初审,纳入标准:①肿瘤干细胞目前研究的进展.②肿瘤干细胞在肿瘤治疗中的应用.排除标准:①文献中重复研究和综述文章.②肿瘤干细胞以外的文章.③Meta分析类文章.资料提炼:共收集到52篇关于干细胞治疗及研究现状的文章,通过查找全文重点引用30篇文章.资料综合:目前肿瘤的治疗方法主要是针对肿瘤组织内的大多数细胞,常有复发和转移,使治疗失败.随着白血病、乳腺癌及脑肿瘤的干细胞的分离纯化,肿瘤干细胞学说逐渐成熟起来.肿瘤细胞来源于肿瘤干细胞,是肿瘤复发和转移的根源,可靶向性杀伤肿瘤干细胞从而使根治肿瘤和防止肿瘤复发和转移成为可能.结论:只有小部分肿瘤干细胞才有成瘤及维持恶性显型的作用,因此肿瘤的治疗关键应是针对肿瘤干细胞的治疗,肿瘤干细胞的起源、研究方法及研究内容均需进一步研究探讨,而实际上如果肿瘤是源于肿瘤干细胞,先前诸多关于肿瘤发生发展的机制、细胞信号途径等的研究成果需要重新评价,对传统的肿瘤治疗方式提出了巨大的挑战.
-
脐血干细胞和胎盘间充质干细胞在妇产科应用中的前景
目的:介绍脐血干细胞和胎盘间充质干细胞的研究进展,以及干细胞在妇产科中的应用前景.资料来源:应用计算机检索Medline 1996-01/2006-12与脐血干细胞和胎盘间充质干细胞、以及干细胞在妇产科中的应用相关的文章,检索词为"human cord blood,mesenchymal stem cell,placenta,gene therapy in the uterus",限定文献语种为"English";同时检索万方数据库2000-01/2006-12相关文章,检索词为"脐血,间充质干细胞,胎盘,宫内治疗,卵巢癌,子宫癌",限定文献语种为中文.资料选择:共检索到相关文献500余条,进一步查找全文,优先选择与临床应用靠近的文章,无论观察对象是人还是动物均纳入,筛除干细胞的提取、分化或培养等基础类研究,明显重复和综述文献也排除,后纳入31条文献进行综述.资料提炼:31条文献中论述脐血干细胞和胎盘间充质干细胞的特点及应用文章有26篇,关于宫内移植干细胞治疗的文章有2篇,其他为研究干细胞在妇产科中应用的文章.资料综合:①大量实验证明脐血是骨髓、外周血后的第3种非常有潜力的造血干细胞资源.目前应用脐血移植治疗的疾病有急(慢)性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、再生障碍性贫血、严重免疫缺陷症等,而且已经有一定疗效.②胎盘作为胚胎发育中维系母体和胎儿氧气及营养物质交换的重要暂时性器官,无论从解剖结构还是在发育行为上,都包含了较为幼稚的胚胎及趋于成熟的成体干细胞成分,而且胎盘不会涉及伦理道德问题,目前已成为寻找人类间充质干细胞新来源及提高临床应用效果的研究热点.③干细胞宫内移植为先天性疾病治疗开辟了一条新途径.另外干细胞在器官再造、男性不育治疗和保存生育能力等生殖医学领域的研究也取得了重大进展,在妇科肿瘤方面,如以化疗保护为目标的基因治疗已逐步应用于l临床.结论:脐血和胎盘取材方便、安全,还能避免免疫排斥和伦理问题,已成为人类间充质干细胞新来源.干细胞在宫内治疗、生殖疾病和妇科肿瘤方面也有广泛的临床应用前景.
-
各国政府对干细胞研究的支持力度及其相关论文发表和专利申请
目的:韩国黄禹锡博士的干细胞论文造假事件发生之后,看似萎缩的干细胞研究在世界各国政府支持下出现更为活跃的迹象.文章以干细胞主要专利为中心,统计近几年各国政府支持情况、发表论文数量等,对干细胞的研究进展作一综述.资料来源:应用计算机检索PUBMED 1980-01/2006-12期间的相关文章,检索词为"stem cell,patent,policy",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库1995-01/2006-12期间的相关文章,检索词为"干细胞,专利,政策",并限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容应与干细胞专利、政府支持干细胞情况或干细胞论文数量相关.排除标准:重复研究或Meta分析类文章.资料提炼:共收集到49 822篇相关文献,选用其中的46篇作为本文佐证文献.分别涉及世界各国对干细胞的支持情况、干细胞论文发表情况、干细胞专利申请情况、不同技术类型的核心专利等内容.资料综合:至2006-12,录入在PUBMED数据库中涉及干细胞方面的研究论文数量已达到5万余篇,尤其是20世纪90年代中期以后增长幅度加快.进入2000年以后,干细胞专利数量出现急剧增长趋势,很多国家纷纷出台并发布了干细胞领域重大规划,在世界范围内迅速推进干细胞研究.胚胎干细胞方面的核心专利代表单位主要是美国威斯康星大学(US5843780)、约翰霍普金斯大学(US6090622)和英国的罗斯林研究所(US6252133).成体干细胞方面的核心专利代表单位主要是美国Systemix公司(US5061620)、奥西里斯公司(US5226914).其他干细胞的培养、保存、测定、转化技术以及与疾病有关的专利大部分属于美国的大学和生物工程公司.干细胞主要研究领域集中在受体、酶及蛋白质基因功能的确定;神经干细胞及异种干细胞分离、移植、治疗方法、增殖分化与调节因子功能的确定;新矢量开发及利用新矢量特征技术将基因转入动物细胞体内;与干细胞维持相关的新型核酸序列分析等.结论:国内外干细胞的相关论文和专利现状表明,美国、日本、英国、加拿大、韩国、中国等列入干细胞专利申请数量居多的国家,其中韩国和中国侧重于本国内专利申请.干细胞研究方面,呈现以美国、日本、欧盟为首的三强争霸格局.
-
人脂肪组织来源干细胞在心脏疾病治疗中的应用
目的:综述人脂肪组织来源干细胞的生物学特性及其在缺血性心脏病中的应用,分析不足,并在此基础上提出未来研究要解决的问题,以期为临床治疗提供依据.资料来源:应用计算机检索Blackwell、Elsevier、Pubmed数据库1980/2007期间脂肪源性于细胞与缺血性心脏病方面的文献,检索词为"bone mesenchymal stem cells,adipose derived stem cells,cardiomyocytes,ischemic heart disease"等.应用计算机检索中国期刊全文数据库1980/2007期间相关文献,检索词为"骨髓间充质干细胞,脂肪组织来源的干细胞,心肌细胞,缺血性心脏病"等.并手工查阅相关书籍.资料选择:对资料进行初步选择:①脂肪组织来源干细胞的生物学特性.②脂肪组织来源干细胞治疗缺血性心脏病.排除重复文献.资料提炼:共搜集到相关文章57篇,删除内容重复及与本文主题关系较远的文章,剩余41篇作为综述参考.资料综合:脂肪组织来源干细胞与同样起源于中胚层的骨髓基质细胞不仅具有非常相似的生物学特性,而且在细胞表面标志谱的表达方面也非常相近.并且脂肪组织来源广泛,取材方便,可获得的基质细胞数量大,易于培养扩增.有研究发现,脂肪组织来源干细胞体外培养不需要任何诱导便能分化成具有自律性的心肌细胞,使得脂肪组织来源干细胞治疗缺血性心脏病成为可能.结论:脂肪组织来源干细胞在取材和增殖方面较骨髓间充质干细胞有优势;脂肪组织来源干细胞能较好的诱导为心肌细胞,将为缺血性心脏病的治疗提供更广阔的前景.
-
神经干细胞移植技术在脑卒中和颅脑损伤治疗中的应用
目的:介绍神经干细胞移植治疗脑卒中和颅脑损伤的实验和临床效果,并探讨神经干细胞移植应用于临床存在的问题.资料来源:应用计算机检索PUBMED 2000/2007与神经干细胞移植治疗脑卒中和颅脑损伤相关的文章,检索词"neural stem cell,stroke,brain damage",限定文献语种为"English";同时检索万方数据库2000/2007相关文章,检索词"神经干细胞,脑卒中,脑损伤",限定文献语种为中文.资料选择:共检索到相关文献500余条,选择与以下内容相关文章:①神经干细胞在脑缺血模型大鼠脑内的存活、迁移、分化,以及对颅脑损伤模型大鼠运动功能的影响.②神经干细胞在临床上的应用效果,包括对脑卒中患者的日常生活活动能力、神经功能的影响.③神经干细胞移植在临床上应用尚存在的问题.资料提炼:将初步筛选的文章进一步查找全文,排除综述和重复文献,纳入43条进行综述.其中论述脑卒中和颅脑损伤后主要的功能障碍问题的有14条,神经干细胞移植治疗脑卒中和脑损伤的动物实验文章25条,临床应用文章4条.资料综合:神经干细胞移植后可在脑缺血模型大鼠脑内存活、迁移、分化,从而使受损的脑组织得到修复.同时神经干细胞移植可改善脑损伤动物的运动和感觉功能.在l临床方面,可改善大面积脑梗死患者的神经功能,以及脑卒中患者的日常生活活动能力.但目前神经干细胞移植治疗脑卒中和脑损伤尚主要处于动物实验阶段,且终神经干细胞移植主要是通过分泌神经营养因子,增加有利于受损的脑神经细胞恢复的蛋白表达起作用,还是以其替代作用起主要作用尚不肯定.结论:应用神经干细胞移植在动物实验和临床中取得了一定正性效果,但仍存在问题,有待进一步解决.
-
间充质干细胞的来源
目的:间充质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能,文章对其主要的来源途径予以综述.资料来源:应用计算机检索Medline 1991-01/2006-01期间的相关文章,检索词为"mesenchyma stem cells,origin,research progress",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库1998-01/2006-10期间的相关文章,检索词为"间充质干细胞,来源,研究进展",并限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:①间充质干细胞的起源.②间充质干细胞研究进展、干细胞的分离及鉴定.排除标准:重复研究、个案报告或Meta分析类文章.资料提炼:共收集到96篇相关文献,40篇文献符合纳人标准,排除的56篇文献为内容陈旧或重复.符合纳入标准的40篇文献中,分别涉及骨髓、肌肉、脐血、胎盘、外周血、脂肪组织、血管及其他来源的间充质干细胞.资料综合:间充质干细胞是属于中胚层的一类多能干细胞,具有强大的增殖能力和多向分化潜能,动物模型试验和临床应用研究也取得了一定的效果.间充质干细胞来源广泛,易于获得,临床上为神经损伤及其他系统的损伤修复提供了更为广泛的途径.结论:间充质干细胞主要来源于骨髓、肌肉、脐血、外周血、胎盘等组织,具有广阔的应用前景.
-
3T3-L1脂肪细胞分化不同阶段抵抗素表达的变化
目的:抵抗素具有直接对抗胰岛素作用,观察3T3-L1脂肪细胞分化不同阶段过程中抵抗素mRNA和蛋白表达的变化.方法:实验于2006-03/10在郑州大学第一附属医院完成.3T3-L1前脂肪细胞由武汉同济医院儿科馈赠.①将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养瓶,加入含体积分数为0.1小牛血清的高糖DMEM培养液,在37℃、体积分数为0.05的CO2条件下培养.待细胞融合2 d后,加入体积分数为0.1小牛血清的高糖DMEM培养液培养(含0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5 mg/L胰岛素、1 μmol/L地塞米松),诱导3T3-L1前脂肪细胞分化成熟.②分别于诱导分化的第2,4,6,8天采集细胞,采用反转录-聚合酶链反应检测脂肪细胞抵抗素mRNA的表达,以免疫印迹分析方法检测脂肪细胞抵抗素蛋白的表达.结果:①3T3-L1前脂肪细胞分化的形态学变化:诱导分化前细胞呈梭形,胞浆中无脂滴,表现为成纤维细胞样的前脂肪细胞形态,待完全汇合后处于生长停滞期;诱导分化第2天细胞变圆;第4天时细胞变大,变圆,胞浆有少量脂滴出现;第6天脂滴明显增多;至第8天更多的脂滴积累,形成典型的"戒环"样结构.②抵抗素mRNA在3T3-L1脂肪细胞分化不同阶段表达的变化:3T3-L1脂肪细胞抵抗素mRNA在分化的第2,4,6,8天吸光度值分别为0.16±0.03,0.37±0.07,0.63±0.11和0.96±0.17,相邻两时间点比较抵抗素mRNA的表达差异均有显著性意义(P均＜0.01).③抵抗素蛋白在3T3-L1脂肪细胞分化不同阶段表达的变化:3T3-L1脂肪细胞抵抗素蛋白在分化的第2,4,6,8天吸光度值分别为28 942.5±1 392.7,59 326.7±2 954.3,107 821.6±4 325.1和173 656.5±8 356.7,相邻两时间点比较抵抗素蛋白的表达差异均有显著性意义(P均＜0.01).结论:抵抗素mRNA及蛋白在脂肪细胞分化成熟过程中表达逐渐升高.
-
静脉注射骨髓基质细胞对局灶性脑缺血大鼠神经发生的影响
目的:观察经静脉移植骨髓基质细胞后局灶性脑缺血大鼠碱性成纤维细胞生长因子的表达,分析其对缺血性脑损伤神经发生的作用.方法:实验于2005-09/2006-05在中国医科大学实验动物中心完成.①取2月龄Wistar大鼠1只制备骨髓基质细胞,用第3～5代细胞制成单细胞悬液,浓度为3×109 L-1.②选取健康成年Wistar大鼠36只,随机数字表法分为假手术组、模型对照组、细胞移植组,12只/组.模型对照组、细胞移植组大鼠建立大脑中动脉闭塞模型,假手术组手术步骤相同,但不阻塞大脑中动脉.术后大鼠提尾右前肢屈曲内收、向右侧转圈或向右侧倾倒为造模成功,每只造模大鼠均符合标准.③造模24 h后,细胞移植组取3～5代骨髓基质细胞,消化离心后抽取1 mL骨髓基质细胞悬液(浓度为3×109 L-1)于鼠尾静脉输入.模型对照组、假手术组鼠尾静脉注射1 mL生理盐水.④造模后14 d,评估各组大鼠神经功能恢复情况.选择侧脑室室下区部位制作标本切片,免疫组化检测BrdU反应阳性细胞数及碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达.结果:各组大鼠全部进入结果分析.①术后各组大鼠神经功能损伤恢复评估:术后第14天,假手术组无神经功能缺损,细胞移植组神经功能损伤评分明显低于模型对照组[(3.2±0.84),(6.4±0.55)分,P＜0.05].②骨髓基质细胞BrdU免疫组化染色结果:细胞移植组大鼠侧脑室室下区BrdU免疫阳性细胞数明显高于模型对照组、假手术组[(43.1±12.7),(16.2±9.8),(15.6±9.1)个,P＜0.05],模型对照组与假手术组差异无显著性意义(P＞0.05).③碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达:细胞移植组碱性成纤维细胞生长因子蛋白阳性率明显高于模型对照组、假于术组[(10.44±3.57),(3.92±1.42),(3.86±1.39)%,P＜0.05],模型对照组与假手术组差异无显著性意义(P＞0.05).结论:静脉移植骨髓基质细胞可增强缺血性脑损伤神经发生,作用机制可能与上调脑内碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达水平有关.
-
荧光活性染料Dil标记人脂肪干细胞
目的:观察荧光活性染料Dil标记的人脂肪干细胞生长增殖情况,为脂肪干细胞研究寻找理想的细胞标记方法.方法:实验于2006-06/09在广州市创伤外科研究所完成.取人吸脂术中吸出的脂质部分,知情同意并签署知情同意书,用PBS缓冲液反复冲洗,剪刀剪碎.0.1%胶原酶37℃消化40min,使用等量体积含体积分数为0.1胎牛血清+DMEM+双抗完全培养基中和后,1 300 r/min离心5 min,去上清液,沉淀混悬后150 UM尼龙网过滤,按1×104-2×104接种于25 cm2培养瓶中,置入37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养,2～3 d换液.待细胞生长融合达80%即可传代,取第3～4代细胞供实验用.将收集细胞用PBS清洗离心2次,加入无血清DMEM制成细胞悬液,以1×109 L-1密度加入5μL Dil应用液,37 ℃下孵育20 min,1 500 r/min离心5 min,PBS清洗离心2次,加入含体积分数为0.1胎牛血清DMEM培养基,应用荧光显微镜观察24,48,72 h脂肪干细胞显色情况及形态变化.检测脂肪干细胞上清液乳酸脱氢酶含量及细胞XTT比色值,分析脂肪干细胞受损及增殖情况.结果:①Dil标记脂肪干细胞体外观察:台盼蓝染色见脂肪干细胞活力好,仅偶见蓝染细胞,荧光显微镜下观察,见全部细胞标记后均显红色荧光,标记的脂肪干细胞呈梭形,胞浆丰富,保持了良好的正常形态,Dil标记阳性率为100%.Dil标记后早期细胞形态呈荧光环状,48 h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光.②培养脂肪干细胞上清液中乳酸脱氢酶含量及XTT法检测脂肪干细胞受损及增殖情况:未标记Dil的脂肪干细胞与标记Dil的脂肪干细胞形态、细胞上清液乳酸脱氢酶含量及XTT值差异不明显(P＞0.05).结论:①Dil能有效标记体外脂肪干细胞,并在细胞内稳定表达.②Dil标记的脂肪干细胞形态良好,对活体细胞无毒性.
-
自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足17例
目的:观察自体骨髓干细胞下肢局部肌肉注射移植对糖尿病足的治疗效果.方法:①选择2004-03/2005-10郑州市中心医院内分泌内科住院确诊的糖尿病足患者17例(共17条患肢,左下肢10条,右下肢7条),男11例,女6例;年龄62～78岁,平均69岁;足部坏疽6例,静息痛或/和间歇性跛行11例.②纳人标准:不同程度的趾端坏疽、缺血性溃疡或静息痛;生活方式或职业必须解决的间歇性跛行;强烈要求缓解间歇性跛行者;血管造影证明存在周围动脉闭塞性病变,病变远端流出道差.排除标准:并发严重心、肺、肾、脑等脏器功能不全或不能耐受手术者.③分别采集患者自体骨髓,从双侧髂后上棘穿刺,每例约采集骨髓250～300 mL,Ficoll液分离,配制成干细胞混悬液50mL,细胞计数为4×108～9×108.静脉麻醉下进行小腿肌肉及足部局部注射,每个位点注射0.3～0.5 mL,两个位点间距约3 cm,进针深度1.5～2.0 cm/下肢,0.5～1.0 cm/足部.④分别于术前及术后12周对患者进行肢体疼痛、冷感、间歇跛行状况评估,并采用SDW数字点温仪检测患者足背第3趾根后2 cm皮肤温度,以多普勒血流探测仪及臂踝指数检查套件测量踝肱指数.观察溃疡的外观、范围、深度,有无异常症状或体症出现;血、尿、粪常规以及肝、肾功能和出、凝血时间的改变.结果:17例糖尿病足患者全部完成1年随访而进入结果分析.①基本体征指标的改变:骨髓干细胞移植后患者肢体疼痛、患肢冷感、间歇性跛行、皮肤温度及踝肱指数均得到明显缓解,与术前比较差异显著(t=-9.644～7.750,P均＜0.01).②术后足部坏疽病例创面愈合情况:5例糖尿病足患者于术后14～55 d足部坏疽创面感染被控制,局部有新鲜肉芽出现,创面明显缩小并基本愈合;1例患者在接受骨髓干细胞移植的同时对足部坏疽进行彻底清创,切除坏死的左足第2趾关节远端,术后14 d伤口完全愈合.③不良事件和副反应:17例糖尿病足患者骨髓干细胞移植后均未出现异常症状或体症,血、尿、粪常规及肝、肾功能和出、凝血时间均正常.随访1年,无不良反应发生.结论:自体骨髓干细胞下肢局部肌肉注射移植治疗糖尿病足患者,能够明显改善肢体疼痛、冷感、间歇跛行、踝肱指数等指标,安全有效.
-
自体骨髓单个核细胞经介入途径移植治疗股骨头坏死54例:12个月疗效随访
目的:观察经介入途径移植自体骨髓单个核细胞在股骨头坏死治疗中的应用,并评价其疗效.方法:选择2004-07/2005-11在解放军四六三院细胞治疗中心住院的,具有完整随访资料的股骨头坏死确诊患者共54例91髋.纳入确诊股骨头坏死,有关节疼痛、功能障碍等症状患者,性别、年龄不限;排除有严重心力衰竭、严重肾功能异常等不能耐受手术者.符合纳入标准54例,男45例,女9例,12～68岁.按ARCO分期Ⅱ期42髋,Ⅲ期47髋,Ⅳ期2髋.实验对象对治疗的相关内容知情同意并签知情同意.干预措施:抽取患者髂后上嵴骨髓进行单个核细胞悬液的制备.在DSA监视下将采集的单个核细胞混悬液经股动脉行Seldinger法穿刺,穿刺成功后,置入4F动脉鞘,经动脉鞘置入Cobra导管,将导管超选择至闭孔动脉及旋股内外侧动脉,平均注入单个核细胞悬液.术后定期随访症状变化情况,1年后复查X射线或CT,随访疼痛、关节活动度等情况.实验评估:①疼痛指数:无疼痛症状为3分,Harris髋关节评分疼痛分级A级;时有隐痛2分,Harris髋关节评分疼痛B级;轻度疼痛为1分,Harris髋关节评分疼痛C级;中度疼痛为0分,Harris髋关节评分疼痛D级.②功能指数:髋关节屈、伸、展、收、旋转度评分达Harris髋关节活动范围评分4～5分为3分;3～4分为2分;2～3分为1分;小于2分为0分.③X射线平片指数:股骨头形态无变化,应力骨小梁清晰,坏死区明显缩小为3分;坏死区略缩小为2分;治疗前后无明显变化为1分;坏死区扩大为0分.④血管指数:治疗后旋股内、外侧动脉及其分支增粗、增多,延长1cm以上者3分;1～0.5 cm者2分;小于0.5 cm者1分,无变化者0分.结果:54例患者均完成疼痛症状、关节功能及影像学随访1年.①术后12个月复查疼痛消失9髋,缓解61髋,无缓解21髋,缓解率为76.9%.②关节功能缓解33髋,无缓解58髋,缓解率为36.3%.③1年后X射线平片或CT、MRI示股骨头区可见不同程度的股骨头坏死区骨质密度改变,坏死区有吸收、缩小,股骨头形态变圆滑规整,改善28髋,无缓解或加重63髋,缓解率为30.1%.④12例24髋完成术后12个月复查股骨头供血动脉数字减影血管造影,好转18髋,好转率为72.2%.结论:经介入途径移植自体骨髓单个核细胞治疗股骨头坏死损伤小,可缓解临床相关症状.
