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大鼠骨髓基质干细胞分化为胰岛样细胞
目的:探讨体外自体骨髓基质干细胞(MSC)定向诱导分化为胰岛样细胞的可能性,为进一步诱导分化胰岛细胞治疗糖尿病奠定实验和理论基础.方法:对Wistar大鼠骨髓基质干细胞(MSC)进行体外培养,通过不同的条件诱导MSC向胰岛样细胞分化:LN组,10 mmoL/L尼克酰胺+1 mmoL/L β-巯基乙醇的L-DMEM(含20 mL/L FBS)预先诱导24 h,10 mmoL/L尼克酰胺+1mmol/L β-巯基乙醇的无血清H-DMEM诱导10 h.HN组,含20 mmoL/L尼克酰胺的L-DMEM(20 mL/L FBS)预先诱导24 h,20 mmoL/L尼克酰胺的无血清H-DMEM诱导10 h.诱导细胞形态通过倒置显微镜观察,并通过免疫细胞化学检测分化细胞表达Insulin和Nestin.向3只Streptozotocin(STZ)诱导糖尿病大鼠皮下种植MSC分化胰岛细胞1×107,1 wk后观察大鼠血糖水平变化.结果:LN、HN组细胞均可见部分骨髓基质干细胞分化、增生,形成胰岛样细胞团,部分细胞向神经元样细胞分化,对照组细胞未见明显分化.免疫细胞化学显示Insulin在诱导细胞呈显著表达,Nestin在分化前细胞显著表达.皮下种植MSC分化胰岛细胞可有效降低STZ糖尿病大鼠的血糖水平.结论:体外诱导骨髓基质干细胞定向分化为胰岛样细胞存在可行性,本实验将可能为临床糖尿病干细胞治疗提供新的途径.
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原代培养大鼠肝细胞的基因转染
目的:研究原代培养大鼠肝细胞的基因转染的方法.方法:采用胶原酶灌注法获取原代培养大鼠肝细胞.利用脂质体转染法将含有绿色荧光蛋白(GFP)和Neo基因的真核细胞表达载体(pEGFP-N3)转染原代培养大鼠肝细胞.用荧光显微镜观察和Neo基因原位杂交染色方法检测肝细胞内基因表达情况.结果:获取的原代大鼠肝细胞活细胞率达95%.荧光显微镜下观察可见转染基因的细胞可发出绿色荧光,原位杂交显示有Neo基因的表达.结论:pEGFP-N3基因可转入大鼠肝细胞并获得表达,可用于标记原代培养的大鼠肝细胞,有利于研究肝细胞移植后移植的肝细胞在体内的分布及功能.
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腺病毒增强转铁蛋白受体介导的针对突变型P53的大酶转染可促进肝癌细胞凋亡
目的:通过腺病毒增强的转铁蛋白受体介导法(AVET)将针对突变型p53(mtp53)的大酶(Maxizyme)基因转入肝癌细胞后篌对肝癌细胞凋亡的影响,探索AVET用于肝癌基因治疗的可行性,为肝癌的基因治疗探索一条新途径.方法:以带有mtp53基因的人肝癌细胞株MHCC97细胞为模型,用腺病毒增强转铁蛋白受体介导法将针对mtp53的pEGFP-Maxizyme基因和空载体pEGFP分别导入MHCC97细胞,荧光显微镜观察细胞转染情况,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测mtp53 mRNA表达水平的变化,DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测转染后对细胞凋亡的影响.结果:转染后48h荧光显微镜下可见呈细胞形态的绿色荧光.收集细胞检测,实验组mtp53 mRNA表达水平与空载体组和空白对照组相比,基因扩增条带亮度明显减弱,mRNA表达水平下降(P<0.05);DNA琼脂糖凝胶电泳出现典型的凋亡梯带(DNA Ladder);流式细胞仪分析显示细胞凋亡水平增高,凋亡指数22.95%,显著高于对照组的2.37%(P<0.05).结论:腺病毒增强转铁蛋白受体介导的基因转移系统可将pEGFP-Maxizyme有效的转染到肝癌细胞株MHCC97中,Maxizyme在细胞内成功的切割了mtp53 mRNA,促进了肝癌细胞的凋亡,这为腺病毒增强转铁蛋白受体介导法在肝癌基因治疗中的应用提供了实验依据,也为肝癌的基因治疗提供了一条新途径.
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反义VEGF寡核苷酸与碘油混合肝动脉注入转染鼠肝癌的可行性
目的:探讨反义VEGF寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)转染Walker-256瘤细胞及其与碘油混合后肝动脉注入转染鼠肝癌及在鼠肝、肺、肾组织的分布情况.方法:将异硫氰酸荧光素(5'-FITC)标记的VEGF ASODN加入培养的Walker-256瘤细胞培养液中,不同时间用荧光显微镜观察细胞内ASODN的分布.12只Walker-256移植性大鼠肝癌模型,一组肝动脉内注入荧光标记的VEGFASODN(TAI组,n=6),另一组肝动脉内注入荧光标记的VEGF ASODN与超液态碘油的混合液(混合组,n=6),两组分别于术后1 d、3d、6d取动物的肝、肺、肾组织行冰冻切片,荧光显微镜观察各组织内ASODN的分布情况.结果:荧光标记的ASODN与Walker-256瘤细胞共同培养后2 h时可见瘤细胞胞质内有点状荧光染色,6 h胞核内有荧光染色,12 h荧光染色强,胞核及胞质中均可见荧光染色,24h荧光物质减少,48h完全消失.1 d和3 d时混合组肝癌组织及肝组织内荧光染色强于TAI组,而肺、肾组织荧光染色弱于TAI组;6 d时TAI组肝、肺、肾组织内荧光染色基本消失,而混合组肝、肺、肾组织仍有少许荧光染色.ASODN可以进入肝癌细胞及瘤周肝细胞.结论:VEGF ASODN可以转染Walker-256细胞,其与碘油混合后可以延长ASODN在肝内的停留时间,增加对肝癌组织的转染率,减少其在肝外组织的分布.与碘油混合后肝动脉注入是VEGF ASODN反义基因治疗肝癌的理想给药方法.
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酒石酸锑钾诱导人胃癌细胞凋亡
目的:用于治疗寄生虫病的酒石酸锑钾能抑制白血病细胞及淋巴瘤细胞生长,并诱导其凋亡.本文探讨其对人胃癌SGC-7901细胞株的作用及可能的机制.方法:采用MTT法检测不同浓度酒石酸锑钾对胃癌SGC-7901细胞的生长抑制作用;经Hoechst 33 258染色后用荧光显微镜观察细胞核的形态变化;DNA末端原位标记染色法、双染法(annexin-V/PI)和流式细胞术检测细胞凋亡.结果:酒石酸锑钾能明显抑制胃癌细胞生长,抑制作用呈时间和剂量依赖性(方差分析,P<0.01);Hoechst 33 258染色后荧光显微镜观察细胞核固缩,呈致密的强荧光;DNA末端原位标记染色法、流式细胞仪检测均检测到凋亡细胞.结论:酒石酸锑钾能诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡.有望作为一种新的凋亡诱导剂用于胃癌的治疗.
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MNNG诱导大鼠胃癌中亚硒酸钠和胃黏膜内分泌细胞的作用
目的:探讨N甲基-N-硝基-N亚硝胍(MNNG)诱导Wistar 大鼠胃癌形成过程中亚硒酸钠和胃黏膜内分泌细胞的作用.方法:用MNNG(20 mg/kg)诱导大鼠胃癌形成.用HE染色、显微镜观察和AB-PAS方法比较了硒在MNNG诱导大鼠胃癌形成过程中的作用,用免疫组织化学SP法研究在此过程中胃黏膜内P物质(SP)、胃泌素(GAS)和生长抑素(SOM)阳性细胞的免疫组织化学变化,并对以上结果进行定性、定位、图像分析和统计学处理.结果:饮水中加入2 mg/L和4 mg/L的亚硒酸钠加重胃黏膜糜烂、出血,促进胃黏膜肠上皮化生(45.5%,66.7%,92.9%;92.9%vs 45.5%,P<0.05),在MNNG诱癌过程中发生了浆膜下平滑肌瘤,亚硒酸钠可以增加平滑肌瘤的发生率.胃黏膜内P物质阳性细胞的面数密度(NA)低硒组比正常对照组显著升高(9.909±5.665vs 4.455±2.583,P<0.05);GAS阳性细胞的吸光度(Amean)实验对照组和低硒组显著低于正常对照组(0.187±0.033,0.119±0.024 vs 0.306±0.011,P<0.01),低硒组显著低于实验对照组(0.119±0.024 vs0.187±0.033,P<0.01);SOM阳性细胞的NA和Amean各组之间无显著性差异.结论:在MNNG所致胃癌形成过程中亚硒酸钠并不能降低大鼠胃癌的发生率;其机制可能与硒促进SP阳性细胞的增生和抑制G细胞的分泌功能有关.
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奥曲肽对人胃癌细胞株SGC-7901生长和凋亡的影响
目的:研究生长抑素类似物奥曲肽对人胃癌细胞株SGC-7901生长和凋亡的作用.方法:取人胃癌细胞株SGC-7901,体外培养后以处于对数生长的细胞制成单细胞悬液,加入不同浓度的奥曲肽,以MTT法进行细胞增生试验,并以不含药物的培养液为阴性对照;通过HE染色和电子显微镜观察细胞形态,通过流式细胞仪测定SGC-7901细胞周期和凋亡率.结果:奥曲肽在一定浓度范围内(160-480 mg/L)对sGC-7901细胞的生长具有抑制作用(与对照组比较,均P<0.001),并存在量效关系和饱和性,大抑制率为25.4%(奥曲肽浓度400 mg/L).奥曲肽可诱导SGC-7901细胞凋亡,HE染色见奥曲肽作用48 h,细胞开始出现凋亡的形态学改变,72 h凋亡细胞明显增多,电镜下见有典型的凋亡小体出现.流式细胞仪分析可见Gl峰前出现亚二倍体峰,凋亡率为9.42±5.29%(P<0.05).结论:奥曲肽在体外能抑制人胃癌细胞株SGC-7901细胞的生长,其作用与诱导肿瘤细胞凋亡有关.
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评价高血压病人毛细血管替补
目的:评价高血压病人毛细血管替补。
方法:对高血压病人15例(高血压治疗达标组8例、高血压治疗未达标组7例)和正常血压对照组8例,在室温(22-25℃)下通过显微镜观察指背皮肤甲襞毛细血管,并记录反应性充血(压闭手指血管4分钟)前后单位面积视野内毛细血管开放数量( mm-2),计算毛细血管替补(%),毛细血管替补=增加值/静息值×100%。 -
低频聚焦超声联合sonovue靶向开放小鼠血脑屏障的实验研究
目的:评价低频聚焦超声联合声诺维(sonovue)靶向开放小鼠血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的可行性及安全性。
方法:利用脑立体定位仪固定小鼠及探头,经小鼠尾静脉连续推注sonovue,随即推注伊文斯兰,采用低频聚焦超声探头经颅骨辐照小鼠一侧大脑半球,规律间歇使用高机械指数靶向破坏微泡。荧光显微镜观察脑组织中的伊文斯兰,荧光定量分析血脑屏障的开放范围及程度。 -
Rad基因重组腺病毒在培养乳鼠心肌细胞中的表达
目的:研究外源性Rad基因重组腺病毒在体外转染乳鼠心肌细胞后的转染效率及Rad基因的表达情况。
方法:构建Rad腺病毒载体,以不同的MOI值转染体外培养的原代乳鼠心肌细胞,通过荧光显微镜观察转染后荧光强度及转染效果,流式细胞仪检测转染率,采用RT-PCR、Western blot检测Rad基因表达情况。 -
沉默唯BH3蛋白Bim的表达对缺氧致大鼠心肌细胞凋亡的影响
目的:探讨唯BH3蛋白Bim在缺氧致大鼠心肌细胞凋亡中的作用。
方法:在体外原代培养出生1~3天的大鼠心肌细胞,并用抗ɑ-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。用脂质体法将Bim-siRNA瞬时转染细胞,制作缺血缺氧损伤模型(转染48 h后给予缺氧12 h处理)。实验分组:①正常对照组;②缺氧组;③缺氧+阴性对照siRNA组;④缺氧+脂质体组;⑤缺氧+Bim-siRNA组。用倒置显微镜观察并记录心肌细胞搏动频率与节律;用全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)释放量,以判断细胞损伤情况;用MTT法检测细胞存活率;用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;用Western blot检测Bim、Bax、Bcl-2和p-P38MAPK在心肌细胞中的表达情况。 -
槐耳清膏诱导人肺腺癌细胞A549凋亡的实验研究
槐耳清膏是药用真菌槐耳菌质的热水提取物,临床上证实有一定的抗癌效果。为进一步探讨其抗癌机制,我们研究了槐耳清膏在体外诱导人肺腺癌细胞系A549凋亡的作用。 材料与方法引进并培养人肺腺癌细胞系A549细胞株。制备不同浓度的槐耳清膏PRMI-1640含药培养液与接种成功、呈对数生长的A549细胞共同培养24 h后,每6 h进行以下观察及测定(设阳性对照组羟基喜树碱100 μg/ml,共同孵育10~12 h后进行测定)[1]。(1)荧光染色:收集培养细胞,清洗并均匀涂片自然风干24 h,置于0.05 mg/L的Hoechst33258及0.1 mg/L的硫柳汞的无钙、镁的磷酸缓冲染色液中作用40 min,封片后荧光显微镜下观察、拍照、计数;(2)电子显微镜观察:同上收集细胞6×106,磷酸缓冲液(PBS)清洗,戊二醛固定,再经锇酸染色、缩水包埋、切片后透射电子显微镜观察照相记录;(3)流式细胞仪分析:同法收集、清洗、固定细胞2×106,离心后加入100 μl磷酸二氢钠/柠檬酸缓冲液室温震荡30 min,在离心的细胞中加入含100 mg/L 核糖核酸酶A(Rnase A)和25 mg/L 碘化丙啶(PI)的染色液1 ml在暗处4℃染色3 h,用FACSort流式细胞仪分析细胞周期。实验数据通过SPSS For Windows软件进行统计学分析。
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用显微镜观察药物敏感性方法快速检测结核分枝杆菌耐药性
背景和目的:结核病的早期快速诊断是阻断结核病传播,尤其是耐药结核病传播的关键.显微镜观察药物敏感性(microscopic-observation drug-susceptibility,MODS)方法是一种通过痰液标本的液体培养,在镜下检测细菌生长特性的方法.
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血管紧张素Ⅱ及氯沙坦对肾系膜细胞蛋白激酶C亚型表达及转位的影响
血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS) 中重要的生物活性肽,可经Ang Ⅱ受体激活细胞内信号传递的关键酶--蛋白激酶C (PKC) 介导各种细胞效应,在肾脏疾病的发生发展中起重要作用[1]. 目前已知PKC 共有12种亚型,不同PKC亚型在Ang Ⅱ信号传递中的作用尚不十分清楚.为此,我们将肾系膜细胞进行体外培养,采用多光子共聚焦显微镜观察Ang Ⅱ、Ang Ⅱ受体1(AT1)拮抗剂--氯沙坦对三种PKC亚型α、β、ε表达和转位的影响,探讨这三种PKC亚型在肾脏疾病中的作用.
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烧伤后增生性瘢痕发生过程中工、Ⅲ型胶原变化的规律
编者按:本文用染色法显示不同个体、烧伤后不同时期瘢痕组织内Ⅰ型及Ⅲ型胶元的含量,除个体差异外,尚缺乏瘢痕组织成纤维细胞的培养,测定活细胞分泌胶原能力的资料.审稿专家有不同意见,本刊予以刊出,以活跃学术空气,促进这方面的进一步研究.创伤尤其是烧伤创面愈合后出现的瘢痕增生现象是一个十分复杂的继发病理生理过程,是皮肤损伤后组织过度修复的结果.增生性瘢痕(Hypertrophic scar,HS)的主要特征是成纤维细胞的过度增生及胶原的过度积聚和排列紊乱[1].对瘢痕组织中胶原类型的变化情况以往已有不少研究,但尚缺乏完整的烧伤后不同时期的胶原类型动态变化资料.我们通过对胶原进行特异性苦味酸天狼猩红染色,并采用偏光显微镜观察的方法直接了解在HS发展过程中胶原类型的变化,以进一步明确不同类型的胶原在HS发生中的作用.
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神经内镜在颅底中线区域手术中的应用
近年来采用内镜手术治疗脑积水和垂体瘤已逐渐发展成熟,利用它治疗的新病种也在不断增加,向前至前颅窝底脑膜瘤、垂体瘤,向后斜坡脊索瘤、枕大孔区肿瘤均有报道,甚至寰枢椎病变也有相应的报道[1,2].山于颅底的特殊结构,用显微镜观察常有一些“死角”,而使用内镜或辅助显微镜可直接显露从前颅底到鞍区、斜坡,甚至到枕骨大孔周围的病变.颅底中线手术区域越来越受到很多学者的关注,国内许多机构也相继开展了这方面的研究[3-5].本文从颅底中线水平的解剖学研究到内镜治疗某些病种的应用性研究进行综述.
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161 内镜辅助下的鼓膜成形术
内镜辅助下利用纤维蛋白胶的改良鼓膜成形术,在闭合鼓膜穿孔和听力改善方面获得了满意的效果。对22耳(20例)因弯曲外耳道妨碍手术显微镜观察鼓膜穿孔边缘者,使用0、30、70度角的直径为3mm的Hopkins镜和直径为1.6mm的0、30、90度角的针状镜观察穿孔及鼓室。……
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豚鼠耳蜗内淋巴囊免疫反应后可诱导一氧化氮合酶的表达
在豚鼠耳蜗内淋巴囊注入钥孔(虫戚)血蓝素(KLH)之后,对豚鼠耳蜗内可诱导性一氧化氮合酶(iNOS或NOSⅡ)进行了免疫组织化学研究。所选实验动物为体重约350~400克的豚鼠12只,均被证实耳廓反射阳性,并用显微镜观察排除了中耳炎疾患。将动物分成两组,实验组注射KLH,对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS)。实验组内淋巴囊内注射KLH后,每只动物耳……
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眼睑阴虱感染一例
患者女性,41岁.左眼睑阵发性瘙痒、异物感1个月,以夜间为甚.检查:左眼上下睑缘皮肤可见3~4只阴虱成虫,其头部嵌入眼睑皮肤中,裂隙灯下可见阴虱成虫紧伏皮肤表面,睫毛毛干部大量幼虫(图1).由于阴虱活动,可见睫毛上下摆动.拔除3根睫毛,5%福尔马林溶液固定后,将标本置于玻片上,滴氢氧化钾溶液一滴,于酒精灯上略加热,显微镜观察.见虫体长1~3mm,无翼;阴虱身体扁平,如小螃蟹,故又称蟹虱(Crablouse)(图2,3).诊断:眼睑阴虱感染.
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激光共聚焦显微镜观察眼部蠕形螨
检查睑缘炎患者是否感染蠕形螨,通常的方法是拔取睫毛,在光学显微镜下观察并计数(精粹图片1)。该方法的有创性、取样造成的疼痛感以及无法将取样部位蠕形螨全部带出等,往往限制了医师对感染整体情况的把握。激光共聚焦显微镜可直接观察蠕形螨感染部位以及睑板腺处的蠕形螨感染情况,清晰显示蠕形螨的数量、形态(精粹图片2),弥补了传统检查方法的欠缺,具有无创、便捷、全面等特点。