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1-01 c-Ha-rasV12G基因转染细胞系促癌剂检测模型
目的建立促癌剂检测模型.方法采用电穿孔的方法,将突变的c-Ha-rasV12G基因转入人胚肺成纤维细胞WI-38及人支气管上皮细胞BEAS-2B中,将获得的G418抗性(G418r)单克隆细胞株进行DNA-DOT-Bloting及RT-PCR分析后,进一步用促癌剂佛波醇酯(PMA)处理,并选用克隆形成率(CFE)、锚着独立性生长(AIG)、血清抗性及裸鼠成瘤性等表型改变对受试细胞进行了恶性程度检测.结果 c-Ha-rasV12G基因使细胞对促癌剂的促癌敏感性增强,其中,对于WI-38G418r细胞,当PMA剂量分别为0、3.125×10-5、6.25×10-5、1.25 × 10-4、2.5×10-4及0.5×10-3mol/L时,其在含体积分数为1%FBS的1640培养基中的克隆形成率分别为7、8、11、12、15及14/200 cells,在含体积分数为10%FBS的培养基中分别为76、92、106、109、127及173/200 cells,在质量浓度为0.33%的琼脂中为47、61、70、69、80及97/1 000 cells.选取0.5×10-3 mol/L剂量组处理的G418r细胞进行裸鼠成瘤性实验,结果阳性.对照非基因转染细胞,用0.5×10-3 mol/LPMA处理后,在3种培养基中相应的克隆形成情况为3、33/200 cells,0/1 000 cells,裸鼠皮下注射部位无肿瘤生长.PMA以0、2.0×10-5、1.0×10-4、5.0×10-4、1.0×10-3及1.6×10-3 mol/L分别作用24 h,结果1.0×10-4 mol/L剂量作用使BEAS-2B G418r细胞获得了高的血清抗性及CEF,表现为在含体积分数为0.8%、0%FBS的LHC-8培养基及软琼脂中的CEF分别为190%、150%及75%(对照非基因转染细胞在不含PMA及FBS的LHC-8中CEF计为100%),对照细胞在含体积分数为0.8%FBS的培养基及软琼脂中不能生长,随着PMA处理剂量的增加,其CFE逐渐降低.结论 c-Ha-rasV12G基因可使上皮细胞BEAS-2B获得对PMA的促癌作用敏感性,其中当PMA剂量≤1.0×10-4mol/L时,可发挥促癌作用,大于该剂量则有促分化作用;上皮细胞发生恶性转化的标志之一是细胞对FBS、PMA等促分化剂的促细胞分化抗性增强.
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内源性TNF-α对HBV转染细胞HLAⅠ表达的诱导作用
HLAⅠ分子组成性表达于各种有核细胞表面,细胞因子可通过旁分泌或自分泌效应诱导其表达增强.Zhou等[1]实验表明HBV能增强HepG2细胞的HLAⅠ表面表达,排除细胞内IFN-β的产生和介导作用.为进一步研究其它内源性细胞因子的介导作用,我们构建HBV基因组野生株(WT)及核壳蛋白变异株L97稳定表达载体,探讨TNF-α对HBV转染细胞HLAⅠ表达的调节作用.
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中枢神经系统对腺病毒载体的免疫应答
腺病毒载体(adenoviral vector,AdV)在介导体内基因转染方面所表现出的多方面的优势,使得这一载体系统正在成为神经再生、神经示踪研究以及神经肌肉疾病基因治疗的实验研究中具魅力的载体之一[1-3].虽然神经系统被认为是免疫豁免(immunological privilege)器官,然而AdV转染神经系统后所激发的对该载体的免疫应答常导致其携带的目的基因不能在体内长时间高水平表达,甚至引起转染细胞的破坏,致使这一载体系统的应用在很大程度上受到限制[4,5].为探索AdV在神经系统高效和安全给予方法以及使转染基因获得治疗水平的长期表达,很有必要详细分析研究神经系统对AdV的免疫应答机制以及探索新的免疫调控策略.
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大肠癌细胞因子基因治疗的研究现状
大肠癌的免疫基因治疗作为手术和放化疗的辅助治疗手段有重要的意义.选择编码细胞因子或其受体为目的基因导入肿瘤细胞或免疫效应细胞,在肿瘤局部产生高分泌量的细胞因子,激活抗肿瘤免疫反应,使肿瘤的生长受到抑制或坏死消退,克服了直接给药的严重毒副作用.将肿瘤特异性转录调控序列(如启动子或增强子)与细胞因子基因连接并转染细胞,驱动的目的基因,增强基因治疗的靶向性,做到有的放矢,可达到特异性治疗的目的.常见用于大肠癌基因治疗的细胞因子基因有IFN(干扰素)基因、TNF(肿瘤坏死因子)基因、IL(白介素)基因家族、CSF(集落刺激因子)基因家族、IGFR(胰岛素样生长因子受体)基因等.将多种基因联合应用,或细胞因子基因与其他治疗手段相联合可以提高抗肿瘤效应,减少毒性
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应用基因表达谱芯片技术筛选NS3TP1转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活基因1(NS3TP1)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步NS3TPl蛋白可能的分子生物学功能.方法:设计并合成NS3TPl基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3TP1蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-NS3TPl.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有26个基因表达水平显著上调,14个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS3TPl转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS3TPl蛋白可能的生物学功能及HCV的致病机制提供理论依据.
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反义IGF-Ⅰ寡核苷酸转染对人肝癌细胞生长的抑制作用
目的:利用反义核酸技术,研究体外胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)反义寡核苷酸转染对肝癌细胞增生、分化及凋亡的影响,探讨寡核苷酸转染治疗肝癌的可行性.方法:合成针对IGF-Ⅰ的寡核苷酸片段,利用脂质体包裹反义IGF-Ⅰ寡核苷酸片段瞬时转染人肝癌细胞系BEL-7402细胞,MTT法检测细胞增生;放免法检测培养细胞上清中AFP,CEA的分泌量;免疫组化法检测转染细胞AFP,PCNA表达的变化;采用末端标记(Tunel)法检测细胞凋亡的变化.结果:MTF法检测转染反义IGF-Ⅰ寡核苷酸的人肝癌细胞系BEL-7402A值由0.44±0.09下降为0.30±0.07(P＜0.01),上清液AFP和CEA水平分别由12.5±2.2 μg/L和6.8±2.3μg/L下降为2.5±0.3μg/L和2.2±1.5μg/L(P＜0.01,P＜0.05),凋亡阳性细胞数由16.4±2.3%增加至23.1±3.7%(P＜0.05).结论:反义IGF-Ⅰ寡核苷酸转染人肝癌细胞系BEL-7402细胞可以降低细胞增生,减少细胞去分化并诱导肝癌细胞凋亡.
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基因表达谱芯片技术筛选NS5ATP11反式调节基因
目的:应用基因芯片技术研究未知功能基因NS5ATP11的表达对于肝细胞基因表达谱的影响.方法:从HepG2细胞RNA中用反转录聚合酶链反应法(RTPCR)扩增出NS5ATP11编码区DNA,常规分子生物学技术构建NS5ATP11的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP11,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,NS5ATP11的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:证实构建pcDNA3.1(-)-NS5ATP11在HepG2细胞中表达正确.NS5ATP11重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达改变进行分析.结果表明,8种基因的表达水平上调,10种基因的表达水平下调.结论:NS5ATP11对于肝细胞基因表达谱存在一定影响;基因芯片技术是分析蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径,有助于了解NS5ATP11对肝细胞和其他生物学功能的调节作用.
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基因表达谱芯片技术筛选TAHCCP1转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TAHCCP1在肝细胞中上调或下调的基因,探索其可能的调节功能.方法:设计并合成TAHCCP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TAHCCP1基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的TAHCCP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP1,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA,逆转录为cDNA,应用基因表达谱芯片技术对两组间差异表达mRNA进行检测和分析.结果:在筛选的1 152点cDNA芯片中,有110种基因的表达水平上调(占9.55%),98种基因的表达水平下调(8.51%),包括一些与体内免疫调节、脂类代谢、蛋白质的翻译合成、氧化反应、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的基因.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了TAHCCP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TAHCCP1蛋白可能的生物学功能提供依据.
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双功能融合基因在肝癌细胞中的表达与作用
目的:构建含有融合基因FCUl的自杀基因系统,观察其对体外培养肝癌细胞的杀伤效应.方法:将FCUl基因亚克隆于pEGFP-C1载体,转化大肠杆菌DH5α,阳性重组子转染肝癌细胞HepG2,绿色荧光蛋白检测FCUl的表达,用G418筛选出阳性细胞克隆后,进行体外药物敏感实验,观察旁观者效应.结果:FCUl基因正确插入到pEGFP-C1中,pEGFP-FCUl转染成功的细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光,在5-FC作用下细胞的生长抑制率明显高于未转染细胞,且旁观者效应显著.结论:本基因治疗体系具有很好的体外杀肿瘤效果,为肝癌的基因治疗提供了一个新的选择.
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基因表达谱芯片筛选NS5ATP3转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP3的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的分子生物学功能.方法:设计并合成NS5ATP3基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP3编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP3.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有6个基因表达水平显著上调,18个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP3转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的生物学功能提供依据.
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筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白4B转染细胞差异表达基因
目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达基因,进一步阐明NS4B蛋白在丙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成HCV NS4B基因序列特异性的引物,以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS4B蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HCV NS4B编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS4B.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有NS4B蛋白的表达,提取高质量的mRNA并逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有22个基因表达水平显著上调,34个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HCV NS4B转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS4B蛋白致病的分子生物学机制提供依据.
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乙型肝炎病毒HBsAg重组疫苗与表面抗原DNA疫苗诱导H-2b小鼠免疫应答的实验研究
目的:观察重组乙肝疫苗及乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原DNA疫苗接种后,C57BL/6(H2b)小鼠的免疫应答.方法:构建质粒pVR1012-L,pVR1012-M,pVR1012-S.转染COS7细胞系进行表达.将C57BL/6小鼠分为5组,分别接种质粒pVR1012-L,pVR1012-M,pVR1012-S,pVR1012 100μg及重组乙肝疫苗1μg.ELISA法检测小鼠血清抗-HBs.结果:DNA疫苗在转染细胞中可表达HBsAg.血清抗-HBs在第一次接种重组乙肝疫苗后即可检出,而在DNA疫苗组则未检出.此后重组疫苗组诱导的抗-HBs的滴度与DNA疫苗组相似.结论:HBV表面抗原DNA疫苗在H-2b小鼠试验中有体液免疫原性.
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人CD81真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达
目的:构建含人CD81基因的真核表达载体,探讨CD81在COS-7细胞的表达,为研究丙型肝炎病毒(HCV)与CD81相互作用奠定基础.方法:从我们构建的含人CD81全编码基因载体pMD18-T-CD81,应用双酶切回收基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAX1;通过脂质体介导的基因转染技术将pVAX1-CD81和空载体转入COS-7细胞;应用抗CD81单克隆抗体通过间接免疫荧光法检测COS-7细胞的表达产物.结果:重组的含CD81基因的真核表达载体pVAX1-CD81经酶切和PCR鉴定分析正确,并证明在COS-7细胞表面有效地表达CD81蛋白.结论:成功构建含CD81全编码基因的真核表达载体pVAX1-CD81,并在COS-7细胞表面有效表达CD81分子,该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供模型.
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乙型肝炎病毒E抗原肝细胞结合蛋白E-18调节基因的表达谱芯片研究
目的:应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-E-18分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,筛选能被E-18反式调节的靶基因,研究未知功能的HBeAg结合蛋白E-18的生物学功能.方法:应用酵母双杂交技术和体外免疫共沉淀技术筛选并验证HBeAg的肝细胞结合蛋白基因,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增E-18蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-E-18.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:筛选出肝文库中HBeAg结合蛋白E-18的编码基因,构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 159个基因表达谱的筛选中,发现有52个基因有差异表达,其中36种基因表达水平显著下调,16种基因表达水平显著上调.结论:成功地应用DNA芯片技术筛选出HBeAg结合蛋白新基因E-18的反式调节蛋白,证明E-18基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.
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乙型肝炎病毒核壳蛋白变异株在HepG2细胞的HLA-Ⅰ表达
目的:研究HBV adr亚型野生株和核壳蛋白变异株在HepG2细胞表面的HLA-Ⅰ/抗原肽复合物的表达.方法:通过定点突变技术将1.2拷贝HBV野生型质粒p3.8Ⅱ构建成核壳蛋白变异株V60和L97.经序列测定和生物学活性检测后,野生株和变异株重组质粒分别亚克隆入EB病毒表达载体EBO-plpp以稳定表达.重组载体EBO-野生株、EBO-V60和EBO-L97分别作内切酶双酶切和序列测定鉴定,再用脂质体介导转染HepG2细胞,ELISA(Abbott)试剂盒定量检测各株培养上清HBV抗原,转染细胞用FITC标记的鼠抗HLA-ABC单抗染色,流式细胞术分析细胞表面HLA-I表达.结果:3株重组载体经内切酶消化,电泳后显示2条区带,分别与1.2拷贝HBV基因组和EBO载体大小相同.测序结果证实EBO-V60和EBO-L97分别在nt2078 C→G和nt2189 A→C,保持原定点突变.EBO-野生株的培养上清HBeAg定量S/CO值明显高于变异株V60和L97,3株HBsAg定量S/N值接近,HBsAg表达相近表明实验的转染效率相当.EBO空载体转染的HepG2细胞HLA-I轻微表达,3株重组载体转染细胞HLA-I的荧光强度不同,野生株增强为18.2,L97明显升高至34.5,而V60降低至3.4.结论:HBV能增强HepG2细胞表面HLA-I/抗原肽复合物的表达,核壳蛋白热点变异V60和L97可使宿主细胞HLA-Ⅰ表达发生变化.
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丙型肝炎病毒结构基因转基因小鼠引起肝脏脂肪变
目的:建立持续表达和诱导表达型丙型肝炎病毒(HcV)结构基因(包括核心蛋白和包膜蛋白El、E2编码基因)的转基因小鼠动物模型,探讨HcV结构基因表达导致肝脏脂肪变的病理改变.方法:以含有近全长HcV cDNA的质粒为模板,通过多聚酶链反应(PcR)技术扩增HcV结构基因的DNA片段(约2.2kb),克隆到真核表达载体pcDNA4HisMas和pMT/BiP/V5-HisA中,分别构建成持续表达型表达载体pcDNA4HisMas-HcV core-E2和诱导表达型表达载体pMT/BiP/V5-HisA-HcV core-E2.以限制性内切酶分析和目的DNA片段的核苷酸序列分析,证实构建HcV结构基因的真核表达载体正确无误.以脂质体体外转染cos-7细胞系,利用抗-HcV E2的多克隆抗体进行westem blot杂交分析,证实转染细胞中有HcV E2蛋白的表达.利用小鼠受精卵细胞核微注射方法,导入线性化表达载体的DNA,利用假孕小鼠的受精卵植入方法,建立了表达HcV结构基因的转基因小鼠模型.对于持续表达型转基因小鼠的死胎、6月龄以及硫酸铜诱导表达型的转基因小鼠模型的肝脏组织,进行HE染色和病理学特征的分析.结果:构建了持续性表达和可诱导性表达型的HcV结构基因表达载体pcDNA4HisMas-HcV core-E2和pMT/BiP/V5-HisA-HcV core-E2,体外转染cos-7细胞证实转染细胞中有HcV E2抗原的表达.对于持续表达型转基因小鼠死胎肝脏病理学特征进行分析,发现肝组织尚未分化发育完成,肝内有大量造血细胞,肝细胞空泡变性,单个核细胞聚集现象.对于持续表达HcV结构基因的6月龄转基因小鼠的肝脏进行病理学分析,发现中央静脉区肝细胞小泡型脂肪变性,中央静脉周围细胞溶解坏死,中央静脉明显扩大,少数组织中亦见大泡型脂肪变性.对于可诱导型转基因小鼠的肝脏进行病理学分析,发现肝小叶内中央静脉周围坏死区累及5-10个小叶,周围无淋巴细胞浸润,交界区可见多数肝细胞核异常,或固化,或呈花环状,或溶解为淡蓝色无定形基质.泡浆内残留大量脂肪小泡,肝脏脂肪变与核异常有-移行过程.结论:建立了表达HCV结构基因的转基因小鼠,发现HCV结构基因的转基因小鼠肝脏有典型的脂肪变病理改变,为进一步研究HCV感染引起的慢性丙型肝炎合并脂肪变的特征和机制研究奠定了基础.
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HCVNS3蛋白对正常人源肝细胞生长及MAPK磷酸化的影响
目的:研究丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)蛋白对正常人源肝细胞的转化及MAPK磷酸化调节的作用.方法:利用脂质体介导转染技术和G418筛选得到稳定表达NS3蛋白的正常人源性肝细胞QSG7701,PCR和免疫组化S-P法检测细胞中NS3的表达;细胞记数和软琼脂实验鉴定其生物学性质;抗磷酸化MAPK抗体和抗MAPK抗体Westem blot检测转染细胞MAPK活性及表达.结果:HCV NS3转染的QSG7701肝细胞,其NS3蛋白过度表达于细胞质;真核表达质粒pRcHCNS3-5'转染细胞倍增时间为12 h,较pRcHCNS3-3'、pRcCMV转染细胞和未转染的QSG7701明显缩短(分别24 h,26 h和28 h).pRcHCNS3-5'、pRcHCNS3-3'和pRcCMV转染细胞及正常肝细胞在软琼脂中的克隆形成率分别为33%、1.33%、1.46%、1.11%,pRcHCNS3-5'形成的克隆明显高于其他三种细胞(P＜0.01).pRcHCNS3-5'转染细胞MAPK磷酸化程度明显高于其他三种细胞(分别为8 858±877,5 612±656,2 212±245和989±188).(P＜0.01),而MAPK的表达量没有差异(P＞0.05).结论:人源性正常肝细胞QSG7701是研究HCV NS3蛋白致病机制的较好的细胞系;HCV NS3蛋白N端多肽具有促进细胞增生和改变细胞表型的作用;HCV NS3蛋白N端多肽能上调MAPK活性,不影响MAPK的表达量.
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靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响
目的:探讨转入靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响.方法:设计、合成一对survivin编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体PSilencer2.1,构建siRNA真核表达载体,经稳定转染HepG2细胞后对转基因后肿瘤细胞的生物学行为进行观察.结果:测序证实siRNA真核表达载体构建成功.通过RTPCR及流式细胞术检测,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin基因表达分别达73%和75%.转染细胞生长速度明显减慢,凋亡率增加15倍.裸鼠体内成瘤率下降75%,9-30 d肿瘤体积分别为0.10±0.01 cm3,0.30±0.03 cm3,0.39±0.11 cm3,0.45±0.13 cm3,0.49±0.07 cm3,0.58±0.01 cm3,0.60±0.10 cm3,0.65±0.07 cm3,与对照组相比差异显著(P＜0.01).结论:靶向survivin的siRNA能有效降低目的基因的表达并能在体内体外抑制肝癌细胞株HepG2的生长.为进一步逆转肿瘤细胞的耐药性提供了理论指导.
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TGIF反义寡核苷酸对胃癌细胞增生和凋亡的影响
目的:TGIF(TGinteractingfactor)是TGF-β和视黄醛信号传导通路的抑制分子,且MAPK通路的活化能延长其半衰期,但他在肿瘤发生中的作用尚不清楚,本研究旨在探讨TGIF反义寡核苷酸对胃癌细胞增生和凋亡的影响.方法:将TGIF反义寡核酸瞬时转染胃癌细胞株SGC-7901,RT-PCR检测转染效率,MTT法检测胃癌细胞的增生速度,流式细胞术分析转染细胞的细胞周期和凋亡率的变化.结果:SGC-7901细胞转染TGIF反义寡核苷酸后,细胞增生受到部分抑制,72h后,他的抑制率达20.4%,但细胞的凋亡和细胞周期分布无明显改变.TGF-β1处理后,与突变寡核苷酸转染组细胞和未转染组细胞相比,TGIF反义寡核苷酸转染的SGC-7901细胞的增生受到明显抑制(30%),G1期细胞含量增加更明显.结论:TGIF能抑制TGF-β1对细胞生长和细胞周期的负调控作用,多数肿瘤细胞和间质细胞能分泌TGF-β1,这些肿瘤细胞有可能利用TGIF甚至少量TGIF,抑制TGF-β对自身的生长抑制作用,从而促进肿瘤的发生、发展与转移.
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hTRT反义基因对胃癌细胞端粒酶及凋亡相关基因表达的影响
目的:探讨人端粒酶蛋白催化活性亚单位(human telomerasereversetranscriptase,hTRT)反义基因治疗对胃癌细胞端粒酶及凋亡相关基因表达的影响.方法:采用基因重组的方法,构建hTRT正、反义真核表达载体,并用脂质体导入SGC-7901胃癌细胞株,检测转染细胞增殖能力、细胞周期、端粒酶活性、端粒酶亚单位及bd-2,c-myc基因表达的变化.结果:成功构建hTRT正、反义真核表达载体,并导入胃癌细胞,筛选出稳定表达正、反义hTRT的阳性克隆7901-S,7901-AS1和7901-AS2.反义细胞增生能力明显减弱,凋亡细胞和G0/G1期细胞增多,增生指数下降,端粒酶活性下降,端粒酶亚单位hTRT的表达减少,而TP1,hTR无明显变化,进一步研究发现bd-2和c-myc基因的表达在转录和翻译水平均明显下调.结论:hTRT和c-myc,bcl-2基因的调节作用是相互的,反义hTRT基因可以通过下调胃癌细胞hTRT、c-myc、bcl-2基因的表达,一方面降低端粒酶活性,另一方面一定程度增加凋亡细胞的比率,从而抑制细胞的生长.
