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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白
0 引言1989年应用分子生物学技术发现了丙型肝炎病毒(hepatitisC virus,HCV),并证实可导致肝脏慢性疾病[1,2],是输血后肝炎的主要病因.全世界有1.7亿人感染HCV,面临肝硬化和肝细胞癌的威胁[3-6].随着基因组测序工作的完成,随后就是研究基因的功能,其中基因表达蛋白质的功能的研究尤为重要,因为基因是通过蛋白质起作用的.蛋白质与蛋白质之间的相互作用揭示了蛋白质功能的物理基础之一,即蛋白质起作用是通过与另一蛋白质进行物理接触而完成.大家知道HCV对人体有着广泛的作用,如引起人体免疫紊乱、慢性肝炎、肝硬化、肝肿瘤发生等,但是他们是如何作用的目前不是很清楚,但是可以肯定其中具有蛋白质-蛋白质之间的相互作用.目前鉴定的与HCV核心蛋白相互作用的蛋白有多种,为阐明HCV感染的发病机制,奠定了坚实的基础.
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TATA盒结合蛋白与肝炎病毒的关系
0引言病毒性肝炎流行范围非常广泛,就我国而言,其发病率之高,危害性之大,堪称传染病之魁首.以乙型肝炎为例,全球约有3.5亿慢性病毒携带者,其中至少20-30%患有不同程度的肝脏损害.我国人群中乙型肝炎病毒(HBV)的感染率高达60%,其中约1.2亿为HBsAg携带者.此外,慢性HBV和丙型肝炎病毒(HCV)也是引起肝硬化和肝细胞癌(HCC)的重要原因,对人类健康造成极大危害,至今缺乏有效的控制.肝炎病毒在肝细胞中的长期存在、复制、扩散是肝炎病毒慢性感染的关键,这两种病毒在体内感染的分子生物学机制一直是研究者们关注的重点,许多研究越来越显示TATA盒结合蛋白(T.BP,TATA box binding protein)与其关系密切,本文简要介绍近年来在这方面的研究进展.
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丙型肝炎病毒调节基因结合蛋白的研究
0 引言丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒,其基因组的长度约10千碱基对(kb),其中含有唯一的开放读码框架(ORF)1-4].在其基因组RNA翻译起始点的上游,有一段341个核苷酸(nt),称为5'非翻译区(5'-NTR),控制着HCV基因组的翻译过程[5-7].HCV的3'-非翻译区(3'-NTR)的核苷酸序列自身能够相互结合以形成复杂的二级结构,与一系列蛋白质因子结合,形成病毒复制过程所必须的复制酶(replicase)复合物[8-10].HCV 3'-NTR结合的蛋白质因子除了其自身编码的RNA依赖性RNA聚合酶(NS5B)以外,还能够与感染宿主细胞的某些蛋白进行结合,以决定HCV的复制过程.HCV还必须借助病毒感染的靶细胞的一些蛋白质分子[11-13].
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乙型肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究
0 引言随着基因组测序工作的完成,后面就是研究基因的功能,其中基因表达蛋白质的功能的研究尤为重要,因为基因是通过蛋白质起作用的.蛋白质与蛋白质之间的相互作用揭示了蛋白质功能的物理基础之一,即蛋白质起作用是通过与另一蛋白质进行物理接触而完成.大家知道乙型肝炎病毒(HBV),对人体有着广泛的作用,如引起人免疫紊乱、慢性肝炎、肝硬化、肝肿瘤发生,治疗效果不佳[1-9 ],但是他们是如何作用的目前不是太清楚,但是可以肯定其中具有蛋白质-蛋白质之间的相互作用.1990年代以来一系列遗传、生化方法特别是酵母双杂交技术等进展,为研究HBV与人体蛋白质之间的相互作用打下了基础.HBV有四个结构蛋白开放读码框架,S、C、P、X编码前-S1、前-S2、HBsAg、HBcAg、HBeAg、病毒多聚酶、和HBxAg,其中HBxAg作用复杂有反式激活作用[10].但是其结构中没有DNA结合域,推测可能和蛋白质之间的相互作用有关,研究比较多.其次是前-S1等.目前鉴定的与HBV相互作用的蛋白质有十几种
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多嘧啶序列结合蛋白与丙型肝炎病毒的关系
0 引言多嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract bindingprotein,PTB),在大多数哺乳动物细胞及人类原始肝细胞的胞核及胞质中均可检测到,其分子量约为57kD,故也有人称之为p57.PTB在稳态时定位于核内[1],且可通过能量依赖机制快速穿梭于细胞的胞质及胞核.
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乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白
0 引言乙型肝炎病毒(HBV)感染是肝细胞癌发生主要的危险因子,慢性HBV携带者发展为肝细胞癌(HCC)的危险性可增加100倍,疫苗的使用降低了乙型肝炎的发病率,同时HCC的发病率也随之平行下降,支持了HBV可以致癌.HBV属嗜肝DNA病毒科,还包括土拨鼠病毒(WHV)、地松鼠病毒、苍鹭肝炎病毒以及亲缘关系较远的鸭肝病毒.这些肝炎病毒均可引起宿主的慢性感染,但鸭肝病毒由于缺少X开放读码框架,引发的症状轻微预后良好.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6上调新生多肽相关复合物α多肽基因的表达
目的:探讨HCV核心蛋白结合蛋白6对新生多肽相关复合物α多肽启动子的激活作用.方法:以基因表达谱芯片技术筛选HCBP6表达质粒转染HepG2细胞后的差异表达基因为基础,利用生物信息学技术确定NACA的启动子区域(NACA-p),聚合酶链反应(PCR)扩增NACA-p,克隆至真核表达载体pCAT3中,构建pCAT3-NACA-p表达载体;以该质粒转染COS-7、NIH3T3细胞系,用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;与pcDNA3.1(-)-HCBP6共转染NIH 3T3细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:质粒pCAT3-NACA-p在NIH 3T3、COS-7细胞中能够激活CAT的表达;共转染实验中pCAT3-NACA-p+pcDNA3.1(-)-HCBP6组CAT的表达活性是pCAT3-NACA-p的4倍.结论:pCAT3-NACA-p具有启动子活性;HCV核心蛋白结合蛋白6对NACA-p有激活作用.本研究为探讨HCV核心蛋白结合蛋白6的功能提供新的实验及理论基础.
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HBV前-S1蛋白结合蛋白大鼠同源基因的克隆化
目的:利用生物信息学(bioinformatics)技术克隆,鉴定人HBsAg前-S1蛋白结合蛋白(PSlBP)编码基因的同源基因.方法:人PSlBP由表达型cDNA文库的噬菌体展示技术筛选获得.以人的PSlBP的cDNA序列作为参照,对于美国国立卫生研究院(NIH)国立医学图书馆(NLM)生物工程信息学研究中心(NCBI)建立的核苷酸序列数据库GenBank,利用同源基因序列比对的在线分析软件BLASn进行同源基因序列的比对,发现新的来源于大鼠的同源基因.确定大鼠PSlBP的cDNA序列之后,对于大鼠PSlBP蛋白质一级结构序列与人和小鼠的PSlBP蛋白质一级结构序列的同源性进行分析.利用在线分析软件,对于大鼠PSlBP一级结构序列中潜在的修饰和功能位点进行初步的预测分析.结果:利用噬菌体展示技术获得了人的PSlBP的cDNA序列.以生物信息学技术确定了大鼠PSlBP的cDNA其编码产物的序列.大鼠PSlBP的cDNA由1 455 nt组成,编码产物由484aa组成.大鼠PS1BP蛋白质一级结构与人和小鼠PS1BP蛋白质一级结构的同源性分别为80.79%(391/484)和92.98%(450/484).利用在线分析软件,在大鼠PSlBP蛋白质一级结构中还发现了一系列潜在的蛋白质修饰结构位点.结论:大鼠PSlBP基因及其编码产物序列被确定.
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应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因
目的:我们在以往的研究中,应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因.为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能,应用酵母双杂交技术,筛选并克隆人白细胞中与NS5ATP9蛋白相互作用蛋白的基因,进一步阐明NS5ATP9的生物学功能及其作用途径.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP9基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS5ATP9基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基上生长,又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上变蓝的真阳性菌落46个,其中含人类免疫球蛋白轻链13个,核小体表面蛋白10个,铁蛋白重链2个,人类重组免疫球蛋白λ轻链11个,14-3-3家族蛋白1个,脑膜炎球菌PorA蛋白1个,RNA多聚酶Ⅲ 3个,烟草有丝分裂原激活蛋白激酶1个,细胞色素P450Ⅱ2个,SLIT2蛋白1个,DNA依赖蛋白激酶催化亚基1个.结论:成功克隆出丙型肝炎病毒NS5ATP9蛋白的结合蛋白,为进一步研究NS5ATP9的生物学作用提供了新的线索.
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HBsAg结合蛋白C-12基因转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析
目的:为研究未知功能的乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)结合蛋白C-12的生物学功能,我们应用基因芯片技术对于C-12转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对细胞基因表达的影响.方法:应用酵母双杂交技术筛选并验证HBcAg的肝细胞结合蛋白基因.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增C-12蛋白编码基因片段,经测序鉴定后构建表达载体pcDNA3.1(-)-C-12.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:筛选出肝文库中HBcAg结合蛋白新基因C-12,构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1159个基因表达谱的筛选中,发现有16个基因表达水平显著下调,包括胰岛素受体、丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制剂、SUMO-1活化酶亚基1、肿瘤易感基因101、磷酸硒合成酶2(SPS2)、caspase 4凋亡相关半胱氨酸蛋白酶4、急性淋巴细胞性白血病易位子T、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、DEAD box蛋白多肽21、前折叠素5(Prefoldin 5)、丝氨酸棕榈酰转移酶、G蛋白通路抑制剂、肿瘤坏死因子受体相关蛋白、转化生长因子β1、ADP-核糖基转移酶及1个未知蛋白基因;1个未知功能蛋白编码基因的表达水平显著上调.结论:C-12基因的表达对于肝癌细胞基因表达谱有显著影响,基因表达谱芯片技术是探索基因功能的有效技术途径,实验结果为进一步阐明C-12与HBcAg结合后的肝细胞生物学变化提供了有力的依据.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因和蛋白的生物信息学分析
目的:克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合的肝细胞的蛋白基因,对新发现的基因及编码产物的结构与功能,及其基因表达的调节机制的结构基础进行生物信息学分析.方法:应用酵母双杂交技术,以HCV的核心蛋白作为"诱饵(bait)",筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因.应用生物信息学(bioinformatics)技术,对其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)全长基因及其编码产物的一级结构序列,进行生物信息学分析.获得该基因的基因组序列,并利用同源基因序列的比对,确定该基因在染色体上的定位,并确定人HCBP6基因的内含子序列.对其编码上游的基因组DNA序列进行分析,获得该基因启动子序列的一些信息.同时,根据同源基因序列的比较,确定了小鼠HCBP6的基因序列和氨基酸残基序列.通过对氨基酸残基序列的疏水性特点的分析,确定了HCBP6蛋白的潜在的抗原结构位点.通过蛋白质一级结构的在线计算机软件的分析,对人HCBP6蛋白质一级结构潜在的功能性结构位点进行了计算机辅助分析预测.结果:通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定,结合生物信息学分析,证实人HCBP6基因由456 nt组成,编码产物由152 aa组成.人HCBP6的基因组DNA是没有内含子序列的DNA结构.通过生物信息学技术分析,确定人HCBP6基因组DNA定位于人22号染色体上.在对人HCBP6基因启动子序列的生物信息学分析中发现了几段可能的启动子序列结构,以及可能的转录因子蛋白潜在的结合位点.利用同样的技术,确定了小鼠的HCBP6的基因序列和蛋白质一级结构序列.对人HCBP6的蛋白质一级结构序列进行分析,发现在其序列中第80-110氨基酸残基序列之间存在疏水性结构位点,提示抗原位点所在,对其进行免疫学分析提供了可能.利用在线软件,对人的HCBP6蛋白质结构中潜在的功能位点进行了初步的预测,为进一步研究HCBP6蛋白的生物学功能的实验研究,提供了丰富的信息.这些生物信息学分析的结果,虽然目前还只是初步的,有些还不能被实验所证实,但是,对新基因的结构与功能的研究来说,毕竟这种生物信息学分析,能够提供一些线索,对下一步结构与功能分析实验的设计,具有很大的帮助.结论:酵母双杂交技术结合生物信息学技术,是克隆、分析蛋白结合蛋白的基因,对于其功能结构域的预测的有效工具,在病毒性肝炎的致病机制研究中具有重要应用前景.
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酵母双杂交技术筛选Hcbp6结合的肝细胞蛋白编码基因
目的:Hcbp6是与核心蛋白相结合的未知功能蛋白基因,为了初步提示他的生物学功能和在细胞中的存在形式,采用酵母双杂交体系寻找与他相互作用的肝细胞蛋白,探讨Hcbp6的生物功能.方法:应用酵母双杂交系统3,构建Hcbp6诱饵质粒并转化酵母AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,在涂有x-α-gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒,转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析.结果:筛选出4种与Hcbp6特异性相互作用的蛋白,包括Paralemmin(PALM)、Ran结合蛋白2(Ranbp2)、跨膜运输蛋白21(Tmp21)和血清白蛋白.结论:推测该蛋白可能为一分泌性蛋白,或与分泌蛋白的形成有关,进一步的生物学功能的研究需要更多的实验加以探讨.
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乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1的基因克隆化研究
目的:发现了与乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ(HBVSP Ⅰ)结合的未知功能蛋白,并克隆了他的全长基因.方法:以SP Ⅰ核心序列为"诱饵",应用酵母单杂交技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选,得到了一个未知基因,命名为乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1(SBP1).结合生物信息学技术,应用分子生物学技术,克隆了SBP 1的基因编码序列.结果:经酶切和测序鉴定,结果正确,成功克隆了SBP 1的基因编码序列.结论:SBP 1具有完整的开放读码框,可能通过与SP Ⅰ的结合发挥生物学作用.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A结合蛋白37小鼠同源基因的克隆化及结构分析
目的:克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)结合蛋白37(NS5ABP37)的小鼠同源基因,为阐明小鼠NS5ABP37基因的生物学功能奠定基础,探索HCV NS5A蛋白与NS5ABP37蛋白之间的结合在慢性丙型肝炎的发病机制中可能的作用.方法:利用酵母双杂交系统3,以HCV NS5A蛋白作为诱饵,筛选肝细胞cDNA文库,首先获得HCV NS5A结合的人肝细胞蛋白的新的编码基因.利用生物信息学(bioinformatics)技术确定NS5ABP37的小鼠同源基因序列.利用GenBank在线分析软件,对小鼠NS5ABP37蛋白一级结构特点进行分析.结果:通过酵母双杂交技术获得了人NS5ABP37的编码基因.利用生物信息学技术确定了小鼠NS5ABP37的基因序列.利用分子生物学技术获得了小鼠的NS5ABP37的基因克隆,小鼠NS5ABP37基因开放读码框架(ORF)为l 488 nt,编码产物由495 aa组成.计算分子量为54 583.67道尔顿,预测等电点(pI)为4.70.小鼠NS5ABP37与白细胞抗原相关(leukocyte antigen related,LAR)蛋白前体蛋白(LAR protein precursor)同源.小鼠HCV NS5ABP37基因序列被美国核苷酸数据库GenBank收录,收录号为AY234860.结论:成功确定、克隆了小鼠的NS5ABP37基因序列,并证实与白细胞抗原相关蛋白前体蛋白具有一定的同源性.这一结果,为进一步阐明小鼠的NS5ABP37基因的功能,阐明HCV感染的发病机制奠定了坚实的基础.
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敲除心脏肌球蛋白结合蛋白C加速小鼠蜕膜心肌细胞的牵张激活
心脏肌球蛋白结合蛋白C(cMyBP-C)是与肌球蛋白紧密结合的粗肌丝元件蛋白,尽管有证据显示cMyBP-C基因突变常常导致肥厚型心肌病,但cMyBP-c在心肌中的作用相对所知甚少.早期研究表明,牵张激活在心脏收缩中可能有重要作用,基于此,我们在野生型小鼠和我实验室培育的cMyBP-C基因敲除小鼠纯合子(cMyBP-C-/-)的蜕膜心室中,检测了cMyBP-C在牵张激活反应中的作用.在大或次于大的Ca2+活性期对蜕膜心肌细胞的突然牵张,导致收缩力的瞬时升高,该力迅速降为小,延迟后,力量回复(牵张活化)到大于牵张前力量水平.敲除cMyBP-C显著改变了牵张激活反应,例如,与野生型小鼠心肌相比,力衰减和延迟性力瞬变速率加快.这些结果提示,cMyBP-C正常抑制了肌球蛋白横桥的空间位置,并轮流限制了横桥与肌动蛋白间的相互作用速率和范围.我们假设敲除cMyBP-C移除了这些约束,增加了横桥与肌动蛋白结合的可能性,提高了牵张后延迟性力回复的速率.不考虑特殊的机制,cMyBP-C-/-心肌细胞中横桥周期的加快可以将这种小鼠中收缩射血的减少解释为心室心肌不成熟牵张激活的一个直接结果.
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HCV NS5A反式调节蛋白13研究进展
HCV NS5A反式调节蛋白13(HCV NS5A trans-regulated protein 13,NS5ATP13)又称核螺旋体磷酸化蛋白1(nucleolar and coiled-body phosphoprotein 1,NOLC 1)或核仁磷酸化蛋白140(nucleolar phosphoprotein 140,Nopp140),是Meier等在大鼠肝细胞核中发现并鉴定的一种核定位信号(nuclear localization signal,NLS)结合蛋白[1],作为蛋白伴侣具有细胞核与细胞质中穿梭的功能[2].本实验室在利用抑制性消减杂交的方法筛选HCV NS5A反式作用蛋白时,发现HCV NS5A可以上调该基因的表达[3].下面就NS5ATP13近年的研究进展作一综述.
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CaM激酶Ⅱ:一种与胰岛素胞泌密切相关的蛋白激酶
β细胞内Ca++浓度升高主要是启动生理情况下β细胞分泌胰岛素,葡萄糖刺激作用主要是依赖细胞外Ca++内流。钙调蛋白(Calmodulin)是β细胞中的一种主要的钙结合蛋白,自从被发现后,学者们就推测Ca++/钙调蛋白依赖的蛋白激酶(CaMkinase)是Ca++起作用的主要媒介。β细胞表达的CaM激酶为CaM激酶Ⅱ,是一种多功能C++/钙调蛋白依赖性蛋白激酶,在β细胞表达并被葡萄糖和其他促胰岛素分泌物所激活,具有磷酸化多种蛋白质的功能,可能对与胰岛素胞泌相关事件的协调方面起重要作用。一、CaM激酶Ⅱ的结构及其在胰岛β细胞的表达
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前纤维蛋白-1在正常血压人群、高血压患者和急性脑卒中患者外周血表达水平的比较研究
目的:前纤维蛋白-1(Profilin-1)是早发现的肌动蛋白结合蛋白之一,参与调控肌动蛋白的聚合-解聚动态平衡,促进高血压血管重塑性。其表达异常涉及高血压等多种心血管疾病的发病,本文拟探讨Profilin-1表达水平与高血压和急性脑卒中的关系。
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锚蛋白-B与心肌纤维化的相关性研究进展
心房颤动(房颤)是临床上一种常见的心律失常,2012年ESC指南提出,房颤在一般人群患病率为1%~2%,且患病率随年龄增长而逐渐增高。随着社会的老龄化,预计患病率在未来的50年至少增长2.5倍。房颤严重的危害是中风和死亡,在65岁以上的中风患者中,近30%因房颤引起。75岁以上人群房颤发病率可达10%以上。心肌纤维化是指胶原纤维在心肌细胞外基质的过量积聚[1]。目前研究显示心肌纤维化(MF)在房颤的发生发展中起到极其重要的作用。锚蛋白-B(Ankyrin-B)是膜结合蛋白家族成员之一,其广泛存在于人体细胞内,对维持机体的正常功能具有重要作用[2,3]。近年来研究发现,锚蛋白-B的表达缺失可导致多种类型的心律失常及心肌纤维化,但其具体分子机制尚不明确。锚蛋白-B含有死亡结构域,该结构域在其他蛋白中可激活核因子-κB(NF-κB),与细胞凋亡有关,但该结构域在锚蛋白-B中的功能尚不清楚。转化生长因子-β1(TGF-β1)的活化因子组织谷氨酰胺转胺酶基因的启动子中含有NF-κB的结合位点,因而NF-κB能促进TGF-β1表达[4],而TGF-β1为诸多因素所致心肌纤维化的共同通路,为公认的器官纤维化的优治疗靶目标[5,6]。本文旨在论述国内外关于锚蛋白-B与房颤心肌纤维化的相关进展,进而为房颤的防治提供一种新思路。
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抗核内不均一核糖核蛋白B1单克隆抗体结合131I对肺癌小鼠靶向治疗结果
核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)B1是存在于细胞核的一种RNA结合蛋白,在肺癌细胞株和手术切除的肺癌组织中表达,在临近的正常组织、正常的支气管上皮和肺泡上皮细胞的细胞核未见表达.我们推测抗hnRNP B1单克隆抗体(MAb)能特异性与肺癌组织高表达的hnRNP B1蛋白结合,是潜在的肺癌治疗靶点.