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应用强斯氧化还原扫描仪探测小鼠体内组织代谢状态空间分布
氧化还原状态能为癌症等多种疾病提供组织内与能量相关的生物过程和信号活动等方面的重要信息.强斯氧化还原扫描仪根据还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和氧化型黄素蛋白(Fp,包括黄素腺嘌呤二核苷酸即FAD)的荧光信号建立组织内线粒体氧化还原三维高清图像.本文阐述了强斯氧化还原扫描仪的基本原理和方法,分析了对正常和肿瘤组织的扫描结果,显示组织内氧化还原态空间分布的异质性,并对强斯氧化还原扫描仪在医学中的应用潜力进行初步的探讨.
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精子特异性乳酸脱氢酶研究进展
特异性乳酸脱氢酶( sperm-specific lactatedehydrogenase,LDH-C4)特异地存在于鸟类和哺乳类动物的睾丸和精子中,与体细胞乳酸脱氢酶A4(LDH-A4)和B4(LDH-B4)同属于乳酸脱氢酶家族,它们都以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为辅酶催化丙酮酸和乳酸的转化,在能量代谢中发挥重要作用,但LDH-C4 与体细胞LDH 相比又具有一些独特性质.近来,在研制新型避孕药的过程中,免疫避孕疫苗逐渐引起人们的重视[1],免疫法控制生育具有无药物的毒副作用、管理使用方便、低价、作用相对持久且可逆等优势,但找到理想的精子特异性抗原是制备免疫避孕疫苗的关键[2].用不育患者血清中提取的抗精子抗体(AsAb)来寻找睾丸cDNA 文库表达的抗原候选对象,结果发现特征性强且免疫效果可靠的免疫原为LDH-C4[3].本文主要针对近年来LDH-C4 的研究进展及其应用做一综述.
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致病真菌抵抗宿主氧化杀伤的机制
真菌人侵人体后,首先面临的是机体天然免疫系统的清除,其中很重要的是中性粒细胞、巨噬细胞等吞噬细胞的吞噬作用.通过吞噬小体复杂的生化信号传导系统,激活了和膜相连的NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)依赖的氧化酶复合物,吞噬了真菌的中性粒细胞和巨噬细胞发生呼吸暴发,产生大量毒性的反应活性氧(reactive oxygen species,ROS)杀伤其吞噬的真菌,这是吞噬细胞处理侵入机体真菌的主要方式之一[1].
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Sirtuins抗衰老相关的心血管疾病的研究进展
沉默信息调节因子2（silent information regulator 2，Sir2）是在研究酵母转录沉默时被发现的。脊椎动物Sirtuins（Sirts）是Sir2同源家族蛋白成员的总称，其包括Sirt1～Sirt7。主要分布于肝脏、肌肉、胰腺、睾丸、卵巢、脂肪组织及心脏。 Sirt1、Sirt6定位于细胞核，Sirt2定位于细胞质，Sirt3定位于细胞质、细胞核及线粒体，Sirt4、Sirt5定位于线粒体，而Sirt7定位于核仁。 Sirtuins在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ NAD＋）的辅助下具有核组蛋白去乙酰基酶活性和二磷酸腺苷（ ADP）核糖基转移酶活性，另外研究还发现其具有去丙二酰酶活性和去琥珀酰酶活性，可调控基因转录，修复断裂损伤的双链DNA，稳定染色质，促进细胞增殖分化，抗细胞凋亡，延长细胞寿命，促进糖脂氧化还原反应，调节能量代谢。目前，研究发现Sirtuins 能延长机体寿命，抗衰老、痴呆，可阻滞代谢综合征、2型糖尿病、动脉粥样硬化、冠心病、心衰等衰老相关的心血管疾病的发生发展［1］。本文就Sirtuins抗衰老相关性心血管疾病作用的研究进展作一综述。
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球型脂联素对高糖诱导胰岛β细胞株NIT-1活性氧簇产生的影响
β细胞功能障碍是2型糖尿病发病机制的一个重要环节;但长期高血糖如何损害β细胞功能的分子机制仍未完全清楚.研究表明氧化应激参与β细胞的"葡萄糖毒性"[1].球型脂联素(globular adiponectin,gAd)与机体氧化应激水平有关,可能是通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NAD(P)H]氧化酶相关机制[2],而NAD(P)H氧化酶途径是β细胞中活性氧簇(ROS)产生增加的重要途径之一[3].本实验探讨gAd对高糖诱导胰岛β细胞株NIT-1ROS的产生是否有影响,及其可能的相关机制.
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烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1对多巴胺能细胞系帕金森病细胞模型的保护作用
帕金森病又称震颤麻痹，主要病理改变为中脑黑质致密部多巴胺能神经元选择性死亡［1］，从而导致基底神经节功能紊乱。该病好发于中老年人，65岁以上人群帕金森病患病率为1％～2％［2］。轴索损伤和细胞凋亡是帕金森病患者重要的病理生理学特征。现在越来越多的研究表明轴索变性在神经退行性疾病中起着重要作用，一项通过对慢华勒变性（Wlds）基因变异小鼠进行的研究［3］结果提示，轴索损伤是一个主动过程，而其早于神经元细胞的凋亡［4］，这将有可能成为治疗帕金森病的一个重要突破口。 Wlds蛋白是一种嵌合蛋白，它由N-端泛素化因子E4 b在内的70个氨基酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ NAD）合成酶烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1（ NMNAT1）的全部序列组成［5］，现已证明后者单独存在即可很大程度地延缓轴索损伤［6］，但目前针对帕金森病细胞模型是否有保护作用所进行的研究甚少，其具体机制也尚不明确。因此，我们利用质粒转染技术调节NMNAT1的表达，观察细胞轴索长度、超氧化物歧化酶1（ SOD1）及天冬氨酸特异性蛋白酶3（caspase3）表达的变化，探讨NMNAT1对帕金森病细胞模型的保护作用，从而为帕金森病的神经保护治疗提供理论依据。
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豚鼠鼻粘膜一氧化氮合酶表达
一氧化氮（nitric oxide, NO）是新近发现的一种具有多种而复杂生物学活性的小分子物质，是生物体内重要的信使分子和效应分子，参与体内众多的生理病理过程。NO具有松弛血管平滑肌、调节血液循环、抑制血小板聚集等作用，并被认为是一种重要的神经递质［1］。催化NO的生物合成酶称一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS），本检测旨在探索NOS在鼻粘膜上的分布及其生理学意义。 一、材料和方法 1.豚鼠12只，发育营养正常，雌雄不论，体重350 g左右（本校动物实验中心提供）。 2.制片：豚鼠灌注固定处死后，迅速取下双侧鼻甲粘膜，分别置入10%中性甲醛固定，1侧鼻粘膜6 h后移入15%蔗糖过夜，鼻粘膜包埋在OCT水溶性包埋剂中，做5 μm厚的冰冻切片；另1侧硅烷化载玻片行4 μm石蜡切片。 3.酶组织化学染色：冰冻切片过0.01 mol/L 的磷酸缓冲溶液（pH 7.4）后，待其干燥，加入含有0.8 g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠（nicotinamide dinucleotide phosphate-Na4,NADPH-Na4, 美国Sigma公司）、0.6 g/L的硝基四氮醋蓝和0.3% Triton-X100的孵育液，置于37℃恒温箱内孵育1.5 h，显色后0.01 mol/L磷酸缓冲溶液冲洗3次，终止反应，常规酒精脱水、透明、封片。阴性对照：孵育液内不含NADPH-Na4。 4．内皮型NOS(endothelial NOS, eNOS)原位杂交检测步骤：采用eNOS原位杂交检测试剂盒（武汉博士德公司）。石蜡切片脱腊至水，蛋白酶K消化5 min，暴露mRNA核酸片段，cDNA双链探针变性后，每张切片加10 μL含地高辛标记探针的eNOS原位杂交液，湿盒中37℃杂交18 h，充分洗涤后，用免疫组化ABC法显示探针与鼻粘膜靶核酸形成的杂交体。阴性对照为省去滴加eNOS探针杂交液，其余方法和步骤不变。
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去乙酰化酶1介导衰老相关疾病的发病机制及其与运动的关系
体育运动能延缓衰老,包括预防并延缓多种衰老相关性疾病,如2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)、阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)、骨骼肌肌减少症(Sarcopenia)的发生.体育运动抗衰老效应及其相关机制是当前研究的一个热点话题.Noakes等[1]将其归因于脑源神经营养因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF).这里讨论更为基本的依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD+)的去乙酰化酶(Sirtuins,SIRTs)家族.去乙酰化酶1(Sirtuin1,SIRT1)是SIRTs家族中与酵母沉默调控基因2(Silent Information Regulator 2,Sir2)同源性高的,是当前研究的热点.研究发现衰老会引起SIRT1水平下降[2].
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聚腺苷二磷酸核糖聚合酶在酒精性脂肪肝中的研究进展
酒精性脂肪肝(AFLD)是长期饮酒导致的肝脏疾病,长期的酒精摄入导致肝脏脂肪合成代谢增加和脂解作用减少,肝脏脂肪沉积增加,进而发生脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化,其相关的病理机制尚未明确.聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)是细胞内重要的DNA修复酶,主要参与细胞的基因转录、DNA修复、基因组的稳定和细胞的凋亡、坏死.PARP是细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的消耗酶,PARP的活性改变对细胞内NAD冰平的调控发挥重要作用.长期的酒精摄入导致PARP蛋白活化,在AFLD的发生、发展中发挥重要作用.PARP蛋白的基因缺失或活性抑制,对改善长期饮酒导致的肝脏脂肪沉积、炎性反应、氧化应激和肝细胞的凋亡、坏死发挥重要作用,本文对PARP蛋白在AFLD中的研究进展进行综述.
关键词： 酒精性脂肪肝 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 肝脂肪沉积 -
SIRT1在缺血性脑血管病中的作用和机制
脑梗死后的继发性脑损伤是导致病情加重的重要原因，主要包括氧化应激［1-2］、炎症反应［3-4］、细胞凋亡及细胞内钙超载及兴奋性氨基酸毒性作用等，这几种因素之间相互作用、相互影响，构成复杂的调控网络，导致一系列病理性级联反应。
沉默信息调节因子2相关酶1（ sirtuin type 1， SIRT1）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ nicotinamide adenine dinucleotide ，NAD＋）依赖性蛋白脱乙酰酶，隶属于sirtuin家族，由于其在多种生命过程和疾病中的关键作用日益受到人们的关注。 sirtuin家族是从细菌到人类进化过程中高度保守的多效性蛋白质。沉默信息调节因子SIR2（ silence information regulator 2，SIR2）是早在酵母菌中发现的组蛋白脱乙酰基酶，后来在哺乳动物机体内发现了7种SIR2的同系物，分别命名为SIRT1～SIRT7，组成了sirtuin家族。其中SIRT1基因与酵母 SIR2同源性高，功能也颇相近。Kaeberlein等［5］首先证明了SIR2与抗衰老相关。热量控制（caloric restriction，CR）是除遗传操作以外强有力的延缓衰老的方法， CR可以提高从酵母到灵长类有机体的寿命，而这一过程需要SIR 2的参与［6-7］。因SIRT1与SIR2高度同源，故SIRT1是调节生物生命周期的调节因子。 SIRT1通过对组蛋白以及转录因子p53、核因子-κB及FOXO等脱乙酰基作用，在细胞分化、凋亡、衰老、代谢调控、转录调节、信号转导、生理节律及氧化应激等多种重要的生物学过程中发挥重要作用。随着对SIRT1的深入研究，发现SIRT1在多种中枢神经系统急性及慢性疾病发挥神经保护作用［6］，本文就其在缺血性脑血管病中的作用进行概述。 -
NAMPT在头颈部恶性肿瘤中的研究进展
头颈部恶性肿瘤是全球第五大肿瘤,每年新增病例约644000例[1,2].临床上,头颈部恶性肿瘤以手术治疗联合放化疗的综合治疗为主,然而常难以根治性治疗[3],因此寻找新的治疗策略至关重要.肿瘤细胞的异常能量代谢近年来被认为是新的肿瘤标记物,恶性肿瘤细胞的能量代谢途径失调,其中糖酵解作用明显上调,被称为“瓦博格效应”[4],在此过程中施加一定程度的干扰因素,可以影响肿瘤的能量代谢,为头颈部肿瘤的治疗提供了新的研究思路.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide,NAD+)是存在于活细胞中的辅酶,在糖代谢过程中,通过NAD++e-(=)NADH作为电子传递的载体,充当能量和信号传递过程中的重要分子.在哺乳动物细胞中,烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT)是NAD+补救合成途径中的关键限速酶,其表达的增加催化了NAD+源源不断的合成[5].本篇综述简要概括NAMPT的生理及病理生理功能,介绍近年来关于NAMPT在头颈部恶性肿瘤中的研究情况、NAMPT抑制剂在抗头颈部恶性肿瘤中的临床试验及应用情况.
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沉默信息调节因子1在肾损害中的研究进展?
沉默信息调节因子1( silent mating type information regula-tion 1,Sirt 1)是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD+)的去乙酰化酶,是sirtuins家族中重要成员,其靶蛋白包括组蛋白和p53、FoxO、核因子及HIF2等转录因子,在调节核糖体DNA重组、基因沉默、DNA修复和染色体稳定性中起到重要作用。生理情况下,Sirt1在髓质肾小管上皮细胞高表达,并适度表达于皮质肾小管上皮细胞中,进一步研究表明肾脏Sirt1还可在肾小球系膜细胞、足细胞及肾髓间质细胞表达。当肾脏以上细胞过度表达Sirt1时,则提示肾处于氧化应激状态,故可作为保护和维持肾功能的一个指标。本文针对Sirt1的基本生物学功能及其激活剂、抑制剂,重点对Sirt1在肾脏内的生理作用及其病生理影响,以及在急性肾损伤、肾纤维化、肾衰老中的保护作用的新研究进展加以综述。
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组蛋白去乙酰化酶2联系着代谢与寿命
组蛋白去乙酰化酶2(silent information regulator 2,Sir2)是Sirtuins家族中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖的去乙酰化酶之一.Sirtuins家族是一种从细菌到复杂的真核生物都高度保守的蛋白质家族,此家族成员都含有一个约由250个氨基酸组成的中心区域,成员之间大约有25%～60%的序列同源性.
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衰老相关沉默信息调控子研究进展
沉默信息调控子2(the silent information regulator2,SIR2)是一种高度保守,具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotimide adenosine dinucleotide,NAD)依赖性的组蛋白去乙酰基转移酶,调控酵母、蠕虫和果蝇的生命周期,及哺乳动物的应激反应.SIR2参与转录和重组沉默,对于染色质沉默及细胞其他一些功能具有重要作用.
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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸对精子DNA碎片化指数的影响
目的 研究烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)对精子DNA碎片化的作用,并探讨此过程中的分子生物学机制.方法 在差异浓度NAD(0、1、10、100、1 000 μmol/L)孵育下,观察适宜的精子NAD孵育浓度;采用BioVsion公司生产的NAD/NADH定量试剂盒测定精子NAD水平;采用流式细胞仪观察精子DNA碎片率和染色质成熟度;采用实时定量PCR观察精子DNA单链修复酶PARP1和双链修复酶BRCA1的转录水平.结果 10 μmol/L NAD孵育即能显著增加精子NAD含量.在精子内NAD水平显著升高的同时,精子DNA碎片率明显降低,然而精子染色质成熟度不受精子NAD水平的影响.精子内NAD水平能显著影响精子内DNA单链修复酶PARP1和双链修复酶BRCA1的转录水平.结论 这些结果初步提示,精子内NAD水平可能通过调节DNA修复系统,参与精子DNA损伤修复.
关键词： 精子 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 DNA碎片指数 -
氧化应激、PARP-1和NAD+在缺血性脑损伤中的作用和机制
脑卒中是造成死亡和终生残疾的重要原因之一.尽管以往的研究已使我们对此疾病机制的理解有了很大进步,但仍有很多关键的病理机制尚不清楚,有效治疗方法仍十分匮乏.由于脑卒中对人民健康和社会经济发展造成了巨大的威胁,因此对其机制的研究及新治疗方法的探索有重大意义.组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)是目前美国食品药品管理局(FDA)唯一批准的治疗脑卒中药物,然而其不良反应以及必须在脑卒中后4.5 h内使用的时间窗限制了其临床应用[1].因此,有必要进一步了解缺血性脑损伤的机制及治疗脑缺血的新方法.
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免疫捕获乳酸脱氢酶活性测试在恶性疟诊断中的初步应用
近来发现,疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)与宿主红细胞LDH在理化、免疫学特性和酶学方面差异较大.在催化乳酸生成丙酮酸的反应中,疟原虫LDH能迅速利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)类似物3'-乙酰吡啶NAD(APAD)作辅酶,而红细胞LDH在存在时参与反应速率较慢[1,2].这一特性为利用疟原虫LDH活性检测疟原虫提供了依据.另外,基于疟原虫LDH为检测靶抗原的免疫层析试剂盒-OptiMAL法,其实验室和现场检测均作了评估,与传统镜检法相比,其诊断恶性疟的敏感性和特异性分别为88%和99%,对间日疟分别为94%和100%[3].因此,疟原虫LDH具有重要的诊断应用价值.本研究利用业已制备的抗恶性疟原虫LDH单抗[4],结合其酶学特性,建立检测恶性疟原虫的免疫捕获LDH活性测试法,评价其疟疾诊断应用价值.
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结核杆菌enoyl-酰基载体蛋白还原酶与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作用的测定
目的了解enoyl-酰基载体蛋白还原酶(inhA)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的作用,建立量化两者的作用强度方法.方法对结核杆菌H37Rv的inhA进行克隆、表达并以Nit-NTASuperflow亲和柱纯化表达产物,然后将0.8 mg/ml的inhA蛋白与1 mmol/L的NADH室温作用10min后,以分光光度法在200～400nm范围连续扫描作用前后inhA蛋白,比较其吸收光谱的变化;进一步将0.35 mg/ml的inhA分别与4μmol/L、10 μmol/L、20μmol/L、50 μmol/L和100μmol/L的NADH室温作用10 min,同样检测其吸收峰的变化,通过米氏方程的推导求出inhA与NADH复合物的解离常数.结果与NADH作用后inhA吸光峰的幅度显著减小,出现了新吸光峰;经米氏方程的推导求得的解离常数为14.6×10-6mol.结论结核杆菌H37Rv inhA与NADH具很强的结合力,成功建立了检测两者结合强度的方法.
关键词： 结核病 异烟肼 enoyl-酰基载体蛋白还原酶 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 -
熊果酸对肝星状细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的影响
近年来研究表明,肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)表达的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase,NOX)在肝纤维化发病中起关键作用[1].NOX产生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)介导了各种促肝纤维化因子在HSC内的信号转导,有望成为抗肝纤维化的新靶点[2].熊果酸(ursolic acid)是从中药植物(如丹参、女贞子等)中提取的单体成分,具有保护肝细胞的作用[3],但其抗肝纤维化作用研究甚少.申月明等[4]在体外研究发现熊果酸能抑制HSC增殖,诱导其凋亡;体内实验证实熊果酸有显著的抗肝纤维化作用[5],但熊果酸抗肝纤维化的作用靶点及机制尚不清楚.Steinkamp-fenske等[6] 报道熊果酸能下调人内皮细胞NOX4的表达并抑制ROS的产生.本实验旨在观察熊果酸对HSC中NOX的影响,以探索熊果酸抗肝纤维化的作用靶点及机制.
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组织血液灌注与微循环的病理生理(2)——氧化应激与疾病
哺乳动物的呼吸系统从大气摄入的氧气中80%～90%用于体内线粒体的能量代谢过程,在三羧酸循环中,以4次脱氢的方式为后续的氧化磷酸化提供还原当量(H+和e),脱下的氢3次由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)接受,1次由黄素腺苷二核苷酸(FAD+)接受,然后H+及e经呼吸链(电子传递链)和ATP合成酶进行氧化磷酸化,后氧接受H+和e还原成H2O,并产生ATP.
