首页 > 文献资料
-
应用表达谱芯片技术对NS5ATP7反式调节基因的研究
目的:应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白7(human gene 7 transactivated bynonstructural protein 5A of hepadtis C virus,HCV NS5ATP7)的反式调节基因.方法:构建NS5ATP7基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP7,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5ATP7转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体pcDNA3.1(-)的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP7后,有12条差异基因表达,其中4条基因表达增强,8条基因表达降低.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP7的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP7的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
-
应用表达谱芯片技术对丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式调节基因的研究
目的:应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式调节基因.方法:构建NS5A基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5A转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5A后,有54条差异基因表达,其中28条基因表达增强,26条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式调节基因,为进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
-
丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因6的反式激活基因的筛选
目的:筛选与克隆NS5A反式激活的新型靶基因NS5ATP6的反式激活基因,探讨其可能存在的调节功能.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆NS5ATP6反式激活的新型靶基因.以NS5ATP6表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP6转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人NS5ATP6反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到33个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-2000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得26种编码基因,包括24种已知基因和2种未知基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了NS5ATP6可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
-
丙型肝炎病毒NS5A蛋白上调NS3TP6基因启动子表达活性的研究
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对NS3TP6启动子转录的激活作用.方法:以我实验室前期研究中得到的HCV NS5A/NS3的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定NS3TP6的启动子区域(NS3TP6-p),聚合酶链反应(PCR)扩增NS3TP6-p,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3-NS3TP6-p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫黏附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:限制性内切酶消化和序列分析结果表明,构建的NS3TP6-p指导的报告基因表达载体pCAT3-NS3TP6-p正确无误.pCAT3-NS3TP6-p在HepG2细胞中能够启动CAT的表达;共转染实验中pCAT3-NS3TP6-p+pcDNA3.1(-)-NS5A组CAT的表达活性是pCAT3-NS3TP6-p单独转染试验的1.87倍.结论:我室克隆的NS3TP6启动子有指导下游基因转录表达的活性;HCV的NS5A蛋白具有对NS3TP6基因启动子的转录具有反式激活作用.本实验进一步验证了我室利用基因表达谱技术研究HCV NS5A蛋白反式激活作用的结果,为进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
-
呼吸道合胞病毒感染及反义基因治疗的研究进展
一、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染及治疗现状1.RSV基因结构与蛋白功能:RSV属于副黏病毒科,肺炎病毒属,为非节段性单股负链RNA病毒,含有大约15 000个核苷酸,其基因顺序依次为:3'NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-(M2-1/M2-2)-L-5',共编码11个病毒蛋白[1,2],分别为:核衣壳蛋白N、磷蛋白P、多聚酶亚单位L、转录延长因子M2-1、黏附蛋白G、融合蛋白F、小疏水蛋白SH、非结构蛋白NS1和NS2、基质蛋白M和M2-2.
-
EV71非结构蛋白的结构和功能及其为靶点的药物研究进展
近年肠道病毒71型(EV71)等引起的手足口病在中国大陆呈现上升的流行趋势,其正链的RNA基因组翻译成一个多聚蛋白,进一步自剪切为结构蛋白和非结构蛋白;随着研究的深入,非结构蛋白在病毒生命周期中的功能逐一被鉴定,本文就EV71非结构蛋白的结构功能及针对这些靶点的抗病毒药物进行综述.
-
甲型流感病毒致病力相关因子PB1-F2研究进展
流感病毒是引起流行性感冒的病原体,不定期出现的流感大流行以及每年的季节性流感给人类社会带来严重危害.Chen等[1]在研究主要组织相容性复合物Ⅰ类分子递呈甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/34(PR8)抗原肽时,发现了一个全新的小分子蛋白,由87个氨基酸残基组成,分子量约为10.5kDa,称之为PB1-F2.PB1-F2的起始密码子开始于PB1基因编码区的第95位核苷酸,通过核糖体扫描机制,+1位移码形成第2阅读框架.PB1-F2属于非结构蛋白,对病毒复制并非必需,其在细胞内存在时间短,半衰期仅为30min,表达起始于感染后2h,5h后表达量大.近年来,诸多研究表明PB1-F2在流感病毒的致病力方面发挥重要作用,并在一定程度上具有毒株和宿主依赖性口[2].因此,深入认识PB1-F2有助于阐明流感病毒的致病机制,对流感的预防以及新型药物研发具有重要意义.
-
汉坦病毒糖蛋白及其在细胞融合中作用的研究进展
汉坦病毒(Hantavirus,HV)属于布尼亚病毒科分节段负链RNA病毒,基因组根据大小将其分为L、M、S.分别编码病毒RNA依赖的RNA多聚酶、两种包膜糖蛋白Gn、Gc和一个非结构蛋白以及病毒的核衣壳蛋白.目前国内外至少有30个血清型/基因型,代表型别有汉滩病毒(Hantann virus,HTNV)、汉城病毒(Seoul virus,SEOV)、辛诺柏病毒(Sin Nombre virus,SNV)、普马拉病毒(Puumala virus,PUUV)、希望山病毒(Prospect Hill virus,PHV)、多布拉伐-贝尔格莱德病毒(Dobrava-Belgrade virus,DOBV)、泰山病毒(Thailand virus,THAIV)等[1,2].
-
轮状病毒蛋白的作用
轮状病毒属于呼肠孤病毒科,是引起婴幼儿和幼龄动物腹泻的重要病原,有的对成人也有致病作用.经流行病学调查,发现轮状病毒能感染90%的3岁龄儿童,每年在世界范围内引起近100万人的死亡[1,2].完整的轮状病毒有双层衣壳,从内向外呈放射状排列,无包膜.基因组为双股RNA,由11个基因片断组成[3],绝大多数基因为单顺反子结构.在11个基因片断中,6个编码结构蛋白(VP1~VP7),5个编码非结构蛋白(NSP1~NSP5)[4].结构蛋白组成病毒的衣壳蛋白,非结构蛋白和病毒的复制有关.
-
慢性病毒性肝炎抗病毒治疗的发展方向
慢性病毒性肝炎的抗病毒治疗是根本的治疗.慢性乙型肝炎的抗病毒治疗,常规干扰素、聚乙二醇化干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦等都已先后被批准上市,并得到了广泛的应用;慢性丙型肝炎的抗病毒治疗,常规干扰素、常规干扰素联合利巴韦林、聚乙二醇化干扰素联合利巴韦林等治疗的逐步发展,目前可以使得半数以上的患者取得持续性病毒学应答(SVR).慢性病毒性肝炎的抗病毒治疗,不同的药物和不同的治疗方案进展很快.在不远的将来,慢性乙型肝炎的抗病毒治疗主要集中在新型核苷类似物的研发上,而慢性丙型肝炎的抗病毒治疗则主要集中在非结构蛋白NS3、NS5B的抑制剂方向上.
-
流感病毒疫苗研究进展
流感是由流感病毒所引起的一种急性呼吸道传播疾病,可季节性地感染禽类、哺乳动物和人类。流感病毒又可分为A、B、C三种类型,其中以A型流感病毒的暴发为频繁。甲型流感病毒属于正黏病毒科[1],其基因组共由8个独立的单链RNA片段组成,编码10种蛋白:血凝素蛋白(HA);基质蛋白(M)分为M1和M2;神经氨酸酶(NA);核壳蛋白(NP);非结构蛋白(NS)包括NS1和NEP;PB1,PB2和PA三种聚合酶,每种多肽对于流感病毒都具有重要的生物学功能。甲型流感病毒根据其主要表面抗原HA和NA的抗原性的差异分为不同亚型,目前已发现了17种亚型的HA蛋白,和10种亚型的NA蛋白[2]。具有高度传染性,经常在短期内突然暴发并迅速蔓延,造成不同程度的流行。早在1580年,流感暴发就首次为人类所详尽记载,近年来流感病毒的暴发也越来越频繁,如2009年暴发于美洲的H1N1甲型流感和在香港引起恐慌的H3N2流感,以及2013年在我国长江流域暴发的H7N9禽流感。
-
丙型病毒性肝炎的诊断与治疗
1989年美国Choo等应用分子克隆技术,从受感染的黑猩猩血液标本中找到了一个与本病恢复期血清起阳性反应的克隆,命名丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV),由其引起的肝炎命名为丙型肝炎(hepatitis C,HC).初步研究表明在电镜下HCV为RNA病毒,其直径为55nm,呈球形颗粒,HCV基因组总长9 416个核苷酸,为单股正链,有一个大的开放读码框架,能编码3 014个氨基酸多肽,基因组的两侧分别为5'和3'端的非编码区,编码区从5'端依次为核蛋白(C)区,包膜蛋白(E)区和非结构(NS)区.后者又分为NS1、NS2、NS6、NS4、NS5、等区,NS1又称为E2/NS1.C区基因编码核壳蛋白,E1E2/NS1编码包膜糖蛋白,两者为病毒结构蛋白,NS2、NS6、NS4、NS5区各自编码不同功能的非结构蛋白,其中NS5编码HCV基因组螺旋酶,NS5编码HCV基因组的复制酶.传染源是急、慢性患者和亚临床感染者.传染播途径主要为输血及血液制品,也可通过血液透析、单采血浆、肾移植、性接触、静脉吸毒、母婴传播等.
-
乙型脑炎病毒NS1蛋白原核表达及其免疫原性分析
目的 采用大肠杆菌系统表达乙脑病毒NS1蛋白,并对表达产物进行免疫原性分析.方法 将乙脑病毒NS1基因克隆入pET30a载体中,表达产物经Ni+亲和层析纯化后行SDS-PAGE和Western blot分析;并将纯化产物免疫新西兰大白兔,获得的免疫血清作间接ELISA及免疫荧光检测.结果 重组JEV NS1蛋白获得表达并纯化成功;Western blot结果显示纯化蛋白能与JEV免疫的鼠多克隆腹水反应;兔免疫血清的间接ELISA结果显示血清效价达到1∶51 200以上;免疫荧光结果显示血清作1∶50、1∶100、1∶200稀释时,JEV感染的BHK细胞均显示荧光.结论 重组NS1蛋白能在大肠杆菌系统中获得表达;纯化产物具有免疫原性,为进一步研究NS1蛋白的生物学特性及乙脑病毒的诊断试剂提供参考依据.
-
辽宁省B19微小病毒感染状况调查
B19微小病毒(PVB19)是一种由非结构蛋白和结构蛋白(VP1、VP2)组成的20面体单链DNA病毒. 1997年Bernard报道,在英国疑似麻疹病例中有15%的病例抗PVB19 IgM抗体阳性(麻疹IgM抗体阴性).为了解辽宁省疑似麻疹病例及正常人群PBV19感染状况,以及PVB19病毒是否是引起我省学龄前儿童出现此疹的主要原因,我们于1997~1998年采集疑似麻疹病人急性期血清标本110份,正常人血清标本113分,应用ELISA方法检测PVB19 IgM、IgG抗体.
-
人细小病毒B19感染与神经系统疾病
本文就人细小病毒B19(Human parvovirus B19,简称B19)的生物学特征、脑病患者B19基因组特点、B19相关神经系统疾病的发病机制、临床表现、诊断、防治等,综述如下。1 B19病毒的生物学特征 B19是动物病毒中体积小、结构简单的一种直径为23nm、无包膜、单链线状DNA病毒,含5.6kb碱基对。B19基因组编码两种衣壳蛋白即VP1(83ku)、VP2(58ku)和一个非结构蛋白NS1-1(77ku)。VP2氨基酸序列包含在VP1中,它们组成衣壳包裹在B19-DNA表面,构成B19的抗原性,参与机体的免疫反应;NS-1蛋白与B19毒力有关。B19的宿主范围为从红系爆式集落形成单位(BFU-E)到有核红细胞的红系细胞,其易感性随细胞分化而增加[1]。
-
丙型肝炎病毒与肝癌
一、HCV的基因结构及其产生的病毒蛋白HCV基因是由9500碱基构成的单链RNA病毒.该病毒基因组两端附有非翻译区(UTR),依含有5′UTR的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site,IRES)起动帽非依赖性翻译.本基因组中存在单一的长转录开放读框(ORF),于产生前体蛋白之后,继而通过加工形成不同的蛋白(图1).此包括构成病毒颗粒的蛋白即结构蛋白(核心、E1、E2及p7)和除此之外的非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B).
-
番鸭细小病毒免疫原蛋白基因的序列测定与分析
番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus MDPV)病是近十年来在我国华南、华东等地饲养的番鸭中普遍流行的一种急性传染病。该病毒的基因组有两个阅读框架,左阅读框主要编码病毒的非结构蛋白;而右阅读框主要编码病毒结构蛋白。其中VP2结构蛋白具有免疫原性,是病毒刺激机体产生保护性抗体的重要抗原蛋白。此外,有研究报道,细小病毒具有肯定的抑瘤活性。其对人类的多种转化细胞和癌细胞有选择性地杀伤作用,而对正常的细胞无可检测的影响。这意味着通过在分子水平上对细小病毒的深入研究,将有可能为人类癌症疾病的治疗开辟一条新的途径。MDPV-Q株是从具有典型临床症状和病理变化的雏番鸭体内分离得到的野毒,经鉴定为番鸭细小病毒。为了解我国分离株与国外分离株之间的异同关系以及为今后研制开发MDPV的基因工程疫苗,我们借助于PCR引物设计软件,设计了一对引物LHMP7/LHMP8,该对引物选取位于2 885~2 900及4 618~4 604的两段序列,跨幅为1 734 bp,同时在这2条引物中分别加入2种限制性核酸内切酶SacII和 KpnI的酶切位点,使扩增后的DNA片段的两端,分别含有这两种酶的酶切位点,以利于鉴定和今后的亚克隆。应用PCR技术扩增了MDPV-Q株的VP2蛋白基因片段。将扩增后的VP2蛋白基因重组到pMD18-T载体上,并对插入片段进行序列测定。测序结果表明,我国分离的MDPV的VP2蛋白基因序列与国外分离株具有很高的同源性,达98.1%。
-
丙型肝炎病毒NS5A蛋白功能的研究进展
丙型肝炎病毒(HCV)可引起肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝脏疾病,且慢性化几率较高.目前全世界HCV感染人数仍呈增加趋势,因此科学家对HCV的研究高度重视.HCV有一个大的开放阅读框编码约三千多个氨基酸的多聚蛋白,经蛋白酶裂解为十个多肽片段;氨基末端为结构蛋白包括有核心蛋白、包膜蛋白E1和E2、P7蛋白;羧基末端为非结构蛋白包括有NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NSSB蛋白.基中NS5A蛋白位于HCV多聚蛋白前体的1973-2419氨基酸区域,由447个氨基酸组成,氨基末端为双亲性α螺旋可与内质网膜结合.
-
丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3致肝癌机制的研究进展
大量研究显示丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)持续感染肝细胞能导致肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),但其致癌机制目前还不十分清楚.HCV是一种RNA病毒,其基因组不能整合到宿主染色体中引起基因突变,可能是通过其表达的蛋白质引起细胞转化.由于HCV NS3含有多种蛋白酶活性,因而推测HCV NS3在肝细胞癌的形成过程中具有重要作用,本文就HCV NS3致癌机制的研究进展作一综述.
-
丙型肝炎病毒细胞和动物模型研究进展
丙型肝炎病毒(HCV)为黄病毒科病毒的一条RNA正链.整条负链的中间编码区域、包膜、非结构蛋白都可以进行复制,包膜区包括超变量区域,与序列的变异有关.丙型肝炎"基因准种"的出现对疫苗和包括针对逃避变异抗病毒药物的开发增加了难度.