重庆医科大学学报杂志
Journal of Chongqing Medical University 중경의과대학학보
- 主管单位： 重庆市教育委员会
- 主办单位： 重庆医科大学
- 影响因子： 0.72
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 0253-3626
- 国内刊号： 50-1046/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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溺死相关硅藻rbcL基因检测技术研究
目的:筛选硅藻叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基(large subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase,rbcL)基因的特异性引物,建立溺死尸体组织内硅藻rbcL基因的聚合酶链式反应-毛细管电泳(polymerase chain reactioncapillary electrophoresis,PCR-CE)检测方法,探讨在溺死诊断中的应用价值.方法:采用荧光标记引物扩增硅藻rbcL基因,对21种标准藻株、5种浮游水生标准菌株、3种人体共生标准菌株和人类DNA扩增产物进行PCR-CE检测,验证引物特异性和灵敏度.检测溺死尸体组织样本中硅藻,并比对微波消解-真空抽滤-自动扫描电镜法(microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy,MD-VF-Auto SEM)检测结果.结果:使用引物ND-rbcL对21种标准藻株、5种浮游水生标准菌株、3种人体共生标准菌株和人类DNA进行扩增,其中舟形藻、菱形藻、小环藻、变异直链藻、针杆藻和骨条藻6种硅藻的CE检测结果为阳性,DNA片段为197 bp,其他为阴性.6种硅藻DNA检测阳性的灵敏度分别为0.502、0.117、0.029、0.042、0.275和0.215 ng(20 μL扩增体系).PCR-CE方法检测35例尸体(3例陆地正常死亡尸体,2例水中发现非溺死尸体,30例溺死尸体)的组织样本,肺脏、肝脏和肾脏硅藻检出率分别为100％、63.3％和53.3％,检测总阳性率为83.3％.当溺水死亡尸体脏器组织内硅藻含量＞10个/10 g时,使用MD-VF-Auto SEM方法检测,其检测总阳性率为100％,PCR-CE方法检测,其检测总阳性率为92.6％,两者对检测溺死尸体脏器中硅藻阳性率无统计学差异(x2=2.077,P=0.491);当硅藻含量＜10个/10 g时,PCR-CE方法检测为阴性,与MD-VF-Auto SEM方法检测溺死尸体各种脏器中硅藻阳性率具有统计学差异(P＜0.05).结论:基于ND-rbcL引物建立的PCR-CE法能快速检测硅藻rbcL基因,所需检材量小,易于推广,在溺死诊断中有较好地应用前景.
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大鼠溺死内参基因筛选和水通道蛋白5的表达
目的:在溺死尸体不同时间点模型中,筛选大鼠稳定表达的内参基因和探讨水通道蛋白5 mRNA(AQP-5 mRNA)的表达.方法:先建立溺死尸体不同时间点模型(0 min,n=6;15 min,n=6;4h,n=6;16h,n=6;48 h,n=6;72 h,n=6),提取样本总的RNA,逆转录合成cDNA,qRT-PCR定量候选内参基因,geNorm和NormFinder排序各候选内参基因的表达,筛选出稳定的内参基因,后定量目的基因AQP-5 mRNA的表达.结果:该模型中筛选出ACTB为稳定的内参基因,除72 h时间点,AQP-5 mRNA的表达均显著下调(15 min/0 min=0.51,P＜0.05;4 h/0 min=0.53,P＜0.05;16 h/0 min=0.63,P＜0.05;48 h/0 min=0.81,P＜0.05;72 h/0min=0.89,P＞0.05).结论:本研究AQP-5 mRNA在大鼠溺死表达有一定阳性意义,有助于法医溺死鉴定.
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基于时序特征的手足口病疫情模式聚类研究
目的:根据全国31个地区2010至2015年手足口病发病的时间序列特征,划分不同的疫情模式,为该疾病防控的统一规划和实施提供科学依据.方法:提取各地区手足口病发病率的时间序列特征,包括季节波动、趋势、自相关和混沌等;通过层次聚类分析,划分不同的时间序列疫情模式.结果:聚类分析共产生3类疫情模式,分别为非季节模式、单发季节模式和多发季节模式.结论:对非季节模式地区,需随时加强疾病监控,进一步分析其相关因素;对单发季节模式和多发季节模式,仅需在周期性高发来临时作好相应的预防措施,从而降低疾病大面积流行的可能性.
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NASBA-ELISA检测曲霉菌方法的建立及在侵袭性曲霉病诊断中的应用评价
目的:建立基于核酸序列依赖扩增的酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent assay of nucleic acid sequence-based amplification,NASBA-ELISA)法用于侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的诊断,并评价其诊断价值.方法:将核酸序列依赖扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)方法和高灵敏度的地高辛检测系统相结合,采用地高辛标记NASBA恒温扩增曲霉菌特异性18sRNA基因片段,用生物素标记的DNA探针在链酶亲和素包被的微孔板孔中杂交捕获地高辛标记的NASBA扩增产物,后加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体和底物进行酶标显色,应用此法分别对梯度数量的曲霉菌孢子和其他临床常见菌株进行检测以评价其灵敏度和特异度,并通过对82例临床标本(32例阳性,50例阴性)的检测分析其临床诊断效能.结果:将含有梯度数量的曲霉菌孢子的样本提取总RNA后进行NASBA-ELISA检测,结果表明光密度值与霉菌孢子量对数存在线性相关关系(y=0.278x +0.119,R2=0.887),该方法的灵敏度可达1个孢子;对照菌株(大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和新型隐球菌)和曲霉菌提取RNA后进行检测,结果仅曲霉菌的吸光度(absorbance,A)值大于设定的阈值(6个随机阴性标本的平均A值+3倍标准差)呈阳性;对82例临床标本进行NASBA-ELISA检测,其敏感度和特异度分别为80.6％、80.0％,受试者工作特征曲线曲线下面积为0.759(95％CI=0.644～0.874).结论:NASBA-ELISA方法检测曲霉菌具有敏感性高、特异性强、操作简便的特点,适合常规实验室开展,为侵袭性曲霉病的早期诊断提供了一条新方法.
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绿脓杆菌芳香硫酸酯酶序列与活性关系的初步表征
目的:通过定点突变初步表征绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas Aeruginosa arylsulfatase,PAAS)序列-活性关系,识别通过迭代饱和突变提高突变体比活性的合适位点.方法:分析PAAS活性中心三维构象初步识别催化相关位点;定点突变获得突变体,重组表达后Ni2+-NTA亲和纯化,表征其酶学性质.结果:与野生型相比,R55、M72、G138、D317、K375等位点用常见氨基酸替换/突变都显著降低其催化活性;R55、D317和K375等突变显著降低底物选择性和/或热稳定性,而M72和G138突变主要改变其催化活性.结论:M72和G138适合作为通过迭代饱和突变实施定向进化的候选位点.
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人PDE4B2全长与截短突变体的重组表达及表征
目的:比较6His-SUMO融合的人全长环核苷酸磷酸二酯酶4B2(SF-hPDE4B2)及152-528aa截短突变体(ST-hPDE4B2)在大肠杆菌融合表达、亲和纯化及酶学特征,以明确ST-hPDE4B2用于筛选抗炎活性hPDE4B2抑制剂的优势.方法:分别将6His-SUMO融合到人全长PDE4B2基因编码区的N端和152-528aa截短突变体N端得到SF-hPDE4B2和ST-hPDE4B2;大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,Ni2+-NTA亲和层析纯化,用偶联碱性磷酸酶的孔雀绿定磷法测定酶活性.结果:纯化后ST-hPDE4B2比活性接近SF-hPDE4B2的40倍,活性收率超过100倍;SDS-PAGE和6His标签免疫印迹发现纯化后2种融合蛋白都有多种带6His标签的降解片段;测定咯利普兰[(R)-Rolipram]和罂粟碱的抑制常数表明,SF-hPDE4B2对(R)-Rolipram主要为高亲和力结合构象,而ST-hPDE4B2主要为低亲和力结合构象.结论:与SF-hPDE4B2相比,ST-hPDE4B2用于筛选抗炎活性hPDE4B2抑制剂可能更有优势.
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溴吡斯的明纳米乳的体外释放及体内动力学研究
目的:对溴吡斯的明纳米乳(pyridostigmine bromide nanoemulsion,PBNE)在体外的释放行为和体内的药动学行为进行初步研究.方法:建立高效液相色谱法考察体外释放行为和体内药动学行为.结果:PNBE与溴吡斯的明(pyridostigminebromide,PB)在4种释放介质(pH1.2的盐酸溶液,pH6.8、pH7.4、pH7.8的磷酸缓冲溶液)中的体外释放行为相似,PBNE的MRT(0-h)值较PB增加0.98 h,PBNE的Cmax值是PB的1.55倍,PBNE的口服生物利用度是PB的1.82倍.结论:PBNE在不同介质中的体外释药行为相似,PBNE可改变体内的药动学行为,其口服生物利用度比PB好,PBNE具有一定的缓释作用.
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131I-fulvestrant的合成与鉴定
目的:建立氟维司群(fulvestrant)放射性碘(131I)标记技术.方法:采用改良氯胺-T法对氟维司群进行放射性碘标记,纸层析法测定标记率及标记物稳定性,柱层析法分离及纯化,质谱法鉴定标记化合物,细胞结合实验及MTT实验检测标记化合物对MCF-7(ER+)细胞的结合及抑制能力.结果:在pH 7.5,室温反应5 min的条件下,碘化氟维司群标记率为(62.34±1.80)％,放化纯度为(98.6±3.4)％,48 h半数抑制浓度(IC50)为35 μCi,标记化合物具有良好的稳定性且保留了与人乳腺癌细胞MCF-7(ER+)的结合能力.结论:成功利用放射性碘标记氟维司群,为今后开发新型乳腺癌药物提供可能.
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吴茱萸碱水包油型复合纳米乳的体外释放和在体吸收研究
目的:研究吴茱萸碱磷脂复合物水包油型纳米乳(evodiamine nanocomplex oil-in-water nanoemulation,OECNE)体外释放特性和在胃肠吸收情况.方法:采用透析法建立OECNE体外模型,用模型拟合法和相似因子法(f2)考察其体外释放行为;应用大鼠单向肠灌流模型研究其吸收情况.结果:在pH 1.2盐酸溶液和pH 6.8磷酸缓冲溶液中,OECNE的累积释放率均约为EDA的3倍,释放曲线均符合Weibull方程,f2说明OECNE能促进EDA释放;其吸收速率常数在胃部、十二指肠、空肠、回肠和结肠分别为EDA的2.32、2.74、3.36、4.13和2.74倍,有效渗透系数在4个肠段中分别为EDA的4.66、3.70、4.87和3.60倍,OECNE增加了在大鼠胃和不同肠段中药物的吸收.结论:OECNE改善了EDA的释放行为;OECNE提高了EDA的吸收.
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3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程中lncRNA表达谱的变化
目的:观察铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerltginosa,PA)分泌的信号分子N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(N-3-oxododecanoy1-L-homoserine lactone,3-O-C12-HSL)阻碍单核细胞来源的树突细胞(monocytes derived-dendritic cells,Mo-DCs)成熟过程中长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)表达谱的变化情况.方法:采用免疫磁珠法分选人外周血CD14+单核细胞,经重组人粒-单核细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素-4诱导分化为Mo-DCs.不同因素处理Mo-DCs,实验组加入终浓度0.1 μg/mL的LPS和口终浓度为40 μmol/L的3-O-C12-HSL,对照组加入相应体积的含0.1％DMSO的PBS,模型组加入终浓度0.1 μg/mL的LPS.利用lncRNA芯片技术检测对照组、模型组和实验组间lncRNA表达谱的差异.对筛选数据进行分析处理,利用散点图分析2倍以上差异lncRNA在各处理因素间的总体变异情况,利用聚类分析研究表达差异5倍以上lncRNA的聚类情况.结果:与对照组和模型组相比较,实验组筛选出2倍以上表达差异的lncRNA为1 386条,其中上调表达的548条,下调表达的838条.筛选出具有5倍以上表达差异的lncRNA共153条,占2倍表达差异lncRNA的11.04％,其中上调表达的22条,下调表达的131条.散点图发现2倍表达差异的lncRNA总体分布呈集中趋势,存在特征性改变.聚类分析发现5倍表达差异的lncRNA能根据处理因素进行有效的分层聚类.结合GO分析和mRNA通路分析,差异lncRNA的相关基因可富集至PPAR信号通路、钙信号通路和NF-κB信号通路中.结论:3-O-C12-HSL作用于Mo-DCs后,lncRNA表达谱发生了特征性变化,表达差异的lncRNA可能参与了3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程.
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利用CRISPR/Cas9系统检测同源片段长度对重组效率的影响
目的:在大肠埃希菌中利用CRISPR/Cas9系统对插入失活的mCherry红色荧光报告基因进行靶向切割并重组,以研究同源片段长度对重组修复效率的影响.方法:通过Golden Gate克隆方法构建Cas9表达质粒pKD46-Cas,转化至大肠埃希菌DH5α中,阿拉伯糖诱导表达Cas9蛋白,Western blot检测蛋白表达.用同样的方法,将一段随机靶标序列引入pTac-mCherry-3guid质粒中,造成插入失活,同时在插入序列两侧分别预留0、40、80、120 bp的mCherry编码区overlap序列,构建出含不同长度同源片段的插入失活mCherry荧光报告质粒pQ0、pQ40、pQ80、pQ120,并将其分别转化到表达Cas9蛋白的大肠埃希菌DH5α中,对应的细菌平板分别为pQ0组、pQ40组、pQ80组及pQ120组,每组各9个平板,对每个平板的红、白色菌落进行计数,分别计算出红色菌落数/菌落总数的比值,即为重组修复效率.结果:PCR及测序证实pKD46-Cas质粒及插入失活的mCherry荧光报告载体pQ0、pQ40、pQ80、pQ120构建成功,Western blot鉴定pKD46-Cas在大肠埃希菌DH5α中表达Cas9蛋白;红色菌落计数显示pQ0组为0,其余3组均出现红色菌落,4组重组修复效率的差异有统计学意义(P＜0.05),重组修复效率与同源片段长度呈正相关(r=0.792,P＜0.01).结论:成功建立了基于mCherry红色荧光报告基因和Cas9的同源重组效率检测系统;研究表明不包含同源片段的质粒无法进行有效的重组,当同源片段在0～120 bp时其长度对重组效率有影响.此系统为深入研究原核生物的同源重组提供了一个新的技术平台.
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可吸收形状记忆聚氨酯腰椎间融合器的生物力学评价
目的:评价自主研制的可吸收形状记忆聚氨酯(shape memory polyurethane,SMPU)腰椎间融合器(cage)在尸体腰椎单节段的生物力学特性.方法:将15具腰骶椎(L1～S1)标本随机分为3组:自体髂骨组(n=5),SMPU cage组(n=5),聚醚醚酮(polyetheretherketone,PEEK)cage组(n=5).通过腰椎侧方入路,摘除L3～4椎间盘髓核后植入3种内植物,在力学试验机上测试每组标本术前与术后的运动范围(range of motion,ROM)及轴向破坏载荷.结果:ROM结果显示:术前自体髂骨组、SMPU cage组及PEEK cage组在前屈、后伸、左侧弯、右侧弯、左旋转、右旋转6个方向上的ROM相比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).自体髂骨组在6个方向上的术后ROM均较术前明显增加(P＜0.05);SMPU cage组在6个方向上的术后ROM均较术前明显减少(P＜0.05);PEEK cage组在6个方向上的术后ROM均较术前明显减少(P＜0.05).SMPU cage组与PEEK cage组术后在6个方向上的ROM均明显低于自体髂骨组(P＜0.05);SMPU cage组与PEEK cage组术后在6个方向上的ROM相比较,差异无统计学意义(P＞0.05).轴向压缩测试结果显示:PEEK cage组的破坏载荷较SMPU cage组和自体髂骨组明显增加(P=0.000),SMPU cage组的破坏载荷较自体髂骨组明显增加(P=0.000).结论:SMPU cage能满足腰椎椎间融合的初始稳定性,并能够承载腰椎的生理负荷.
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尿酸酶基因工程菌的构建与分泌表达
目的:将产朊假丝酵母菌尿酸酶编码基因克隆至已改造的表达载体pET-28a中,使尿酸酶在大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli中以分泌的形式持续表达,并具有生物学活性.方法:①利用重组PCR技术删除pET-28a中Lac O和Lac I序列构建表达载体;②金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A,SPA)信号肽编码基因与尿酸酶基因N端融合成目的基因;②将目的基因克隆至表达载体中,再转化至E.coli DH5α中,使之表达;④利用SDS-PAGE鉴定并测定表达产物生物学活性.结果:尿酸酶在E.coli中以分泌的形式持续表达,并具有生物学活性.结论:利用肠道内正常菌群E.coli构建可分泌、持续表达蛋白的载体pET-28a-sUOX,可将表达的尿酸酶作用于高尿酸血症模型上,为应用于动物实验通过肠道降低尿酸水平提供依据.
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MRI钆剂瘘管造影与DCE-MRI联合使用对高位复杂型肛瘘细小分支瘘管及瘘口的诊断价值
目的:MRI钆剂瘘管造影与动态对比增强磁共振成像(dynamic contrast enhanced MRI,DCE-MRI)联合使用,对高位复杂型肛瘘进行诊断,探讨其对高位复杂型肛瘘术前评估的指导意义.方法:收集2014年12月10日至2016年12月10日MRI平扫初步证实为高位复杂型肛瘘但细小内瘘口、分支瘘管显示不清的患者264例,首先行DCE-MRI检查,30 min后再行瘘管内注入钆特酸葡胺4 mL+生理盐水16 mL造影检查同步DCE-MRI扫描.分别对MRI平扫、DCE-MRI及瘘管造影+DCE-MRI诊断结果特异度及敏感度行约登指数、ROC曲线下面积(AUC)进行检验.结果:瘘管造影+DCE-MRI示高位复杂型肛瘘外瘘口、内瘘口及分支瘘管显示清晰,瘘管T1WI、T2WI上呈高信号;脓肿为不规则形或马蹄状,T1WI等、稍低信号,T2WI、脂肪抑制高信号.对照手术结果,瘘管造影+DCE-MRI对于术前诊断对于细小内瘘口及细小分支瘘管的诊断价值明显提高;MRI平扫对于细小瘘管显示约登指数为31.60％,曲线形面积为0.576,对于细小内瘘口约登指数为-23.70％,曲线形面积为0.176;DCE-MRI对于细小瘘管显示约登指数为69.40％,曲线形面积为0.603,对于细小内瘘口约登指数为-4.80％,曲线形面积为0.201;瘘管造影+DCE-MRI对于细小瘘管显示约登指数为87.80％,曲线形面积为0.798,对于细小内瘘口约登指数为79.50％,曲线形面积为0.898.结论:钆剂瘘管造影与DCE-MRI联合使用检查对临床高位复杂型肛瘘的术前评估具有较高指导意义.
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基因捕获技术在肝癌侵袭和迁移相关基因筛选中的应用
目的:用基因捕获技术在肝癌细胞SMMC7721细胞中寻找与肝癌侵袭和迁移相关的基因.方法:首先,将pU21质粒转染到肝癌细胞SMMC7721细胞,用G418筛选出单克隆稳定细胞系;其次,采用Transwell小室实验和划痕实验,检测这些单克隆细胞侵袭和迁移能力的变化;后,用5'-Full RACE实验、T克隆及基因测序检测这些细胞系中被pU21质粒捕获的基因.结果:成功获得了约300株稳定转染pU21质粒的单克隆细胞系,得到了约30株侵袭和迁移能力增强的细胞株和约40株侵袭和迁移能力减弱的细胞株.通过5'-Full RACE实验、T克隆及基因测序检测,证明了在A554细胞系中,被pU21质粒捕获的基因是long inter-genic non-protein coding RNA 52(LINC00052).结论:应用基因捕获技术筛选肝癌侵袭和迁移相关基因是可行的.
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外源性联合应用EPCs和SDF-1α对大鼠肝移植缺血再灌注的保护作用
目的:探讨外源性注射骨髓来源的血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)或基质细胞源性因子-1α(stromal derived factor-1 alpha,SDF-1α)或两者联合,比较性评估3种方法对大鼠肝移植术后缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)的影响.方法:LEWIS大鼠骨髓EPCs提取培养,流式表型鉴定,激光共聚焦功能鉴定;建立大鼠原位肝移植模型,随机分为5组:A组(假手术组),B组(手术组),C组(SDF-1α组),D组(EPCs组),E组(SDF-1 α±EPCs组);再灌注12h后处死各组大鼠,免疫组化检测肝组织再生以及肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的表达情况;WB检测肝组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、HGF、转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,GF-β)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)蛋白表达;ELISA检测VEGF、HGF、TGF-β表达.结果:LEWIS大鼠骨髓提取的EPCs CD34、CD133的阳性比例分别为78.32％、70.76％,同时具有结合ac-LDL和UEA-1功能的EPCs,阳性率达80％以上;SDF-1α诱导EPCs穿过的细胞数[(79.6±6.3)个]明显高于对照组[(36.2±2.9)个](P=0.000);各组大鼠肝组织中,C、D组肝组织HGF分泌和再生情况免疫评分明显高于A、B组(P=0.000),E组免疫评分明显高于C、D组(P=0.000);各组VEGF、HGF、TGF-β、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达结果,C、D组VEGF、HGF、TGF-β、Bcl-2蛋白表达明显高于A、B组(P=0.000),E组VEGF、HGF、TGF-β蛋白表达明显高于C、D组(P=0.000),而C、D、E组Bcl-2蛋白表达比较差异无统计学意义.B、C、D组Caspase-3蛋白表达明显高于A组(P=0.000),而E组Caspase-3蛋白明显低于C、D组(P=0.000);ELISA结果与Western blot结果一致.结论:外源性联合应用EPCs和SDF-1α能有效保护肝移植缺血再灌注的损伤,诱导肝细胞再生,减少肝细胞凋亡.
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83例轻度慢性乙型肝炎合并肺结核患者肝组织病理学与血清生化学及T细胞亚群相关性分析
目的:分析ALT轻度升高的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)合并肺结核(pulmonary tuberculosis,PTB)患者的肝脏病理学改变及与相关血清学指标的关系.方法:83例CHB合并PTB感染患者按照肝脏炎症程度(G)和纤维化情况(S)进行分组,运用Sperman相关分析及有序多分类logistic回归模型(ordinal duo logistic regression model,OLM)分析病理分级与肝功能相关指标谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(straw transaminase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBil)、血清白蛋白(serum albumin,ALB)、胆碱酯酶(cholinesterase,CHE)水平,及HBV-DNA载量各项临床指标的关系.结果:83例患者肝细胞呈现轻度炎症(＜G2)者21例,占25.3％,轻度纤维化(＜S2)者36例,占43.4％;中、重度炎症以上(≥G2)者62例,占74.7％,中、重度纤维化(≥S2)者44例,占56.6％,其中有7例患者的肝穿结果提示肝硬化存在(S4).Spernan相关分析显示,本组患者的G与血清AST、TBil呈正相关(rs分别为0.232、0.239,P分别为0.034、0.029);与CHE呈负相关(rs=-0.273,P=0.012);而与ALT、ALB水平、HBV-DNA载量无明显相关关系(rs分别为0.068、-0.073、0.048,P分别为0.538、0.508、0.660).S与AST、TBil呈正相关(rs分别为0.287、0.273,P分别为0.008、0.012);与胆CHE呈负相关(rs=-0.316,P=0.003);而与ALT、ALB水平、HBV-DNA载量无明显相关关系(rs分别为0.050、-0.094、-0.036,P分别为0.650、0.395、0.745).G与肝组织内的CD4+、CD8+T淋巴细胞,CD20+B淋巴细胞,CD57+NK细胞表达呈正相关(rs分别为0.622、0.638、0.290、0.316,P分别为0.000、0.000、0.007、0.003).S与肝组织内的CD4+、CD8+T淋巴细胞,CD20+B淋巴细胞,CD57+NK细胞表达呈正相关(rs分别为0.543、0.559、0.295、0.270,P分别为0.000、0.000、0.007、0.013).OLM分析结果显示,CD8与G分级存在关联,随着G分级升高,CD8计数将升高,回归系数=0.045,回归系数95％置信区间为(0.007,0.084),P=0.021.AST和CD20均与S分级均存在关联,S分级升高,均会引起这两项指标数值上升,均会引起S分级升高,AST:回归系数=0.039,回归系数95％置信区间为(0.002,0.057),P=0.037;CD20:回归系数=0.026,回归系数95％CI=0.001～0.051,P=0.040.结论:在40 U/L＜ALT＜80 U/L的CHB合并PTB患者中,多数存在中度以上炎症及肝纤维化改变;肝脏炎症程度(G)和纤维化程度(S)与AST、TBil呈正相关,与CHE呈负相关;肝脏炎症程度(G)和纤维化程度(S)与肝组织内的CD4+、CD8+T淋巴细胞,CD20+B淋巴细胞,CD57+NK细胞表达均呈正相关;此类患者若在进行抗痨治疗前,进行肝穿刺病理检查,有利于进一步明晰肝脏炎症及纤维化程度.
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全凭静脉麻醉联合超声引导下腹横肌平面阻滞在腹腔镜胃肠道手术中的临床研究
目的:探讨全凭静脉麻醉联合超声引导下腹横肌平面(transverses abdominis plane,TAP)阻滞在腹腔镜胃肠道手术中的临床效果.方法:选取择期进行腹腔镜胃肠道手术的患者84例,按随机数字表法分为2组,每组42例.对照组采用全凭静脉麻醉,观察组在对照组基础上实施超声引导下TAP阻滞,比较2组视觉模拟评分法(visual analogue scale,VAS)评分、术后恢复情况及不良反应情况.结果:观察组术后1、4、8、12、24 h VAS评分较对照组均降低,差异有统计学意义(均P＜0.05);手术48 h后,观察组第1次补救性镇痛时间为(11.67±1.23)h,较对照组的(4.32±1.21)h明显延长,差异有统计学意义(t=27.607,P=0.025);手术48 h后,观察组下床时间及胃肠道恢复时间与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);观察组术后右肩疼痛12例(28.57％),与对照组16例(38.10％)比较,差异无统计学意义(x2=0.857,P=0.355);2组患者均未出现呼吸抑制、皮肤瘙痒、呕吐、恶心及精神障碍等不良反应.结论:在腹腔镜胃肠道手术中实施全凭静脉麻醉联合超声引导下TAP阻滞可有效减轻术后疼痛程度,延长第1次补救性镇痛时间,具有临床推广价值.
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杠板归总黄酮提取物对α-萘异硫氰酸脂诱导小鼠胆汁淤积性肝损伤保护作用研究
目的:通过构建α-萘异硫氰酸脂(α-naphthylisothiocyanate,ANIT)诱导小鼠肝损伤模型,研究杠板归总黄酮提取物对小鼠肝脏的保护作用及其作用机制.方法:随机将60只昆明种小鼠分为6组,分别为空白对照组,病理模型组,阳性对照组(联苯双酯0.15 g/kg),杠板归总黄酮提取物高、中、低剂量组(1.2、0.6、0.3 g/kg).除空白对照组外,采用腹腔注射ANIT的方法制造小鼠急性肝损伤模型,用杠板归总黄酮提取物连续灌胃9d,禁食20 h后,眼球取血、取肝组织,测定肝组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量及血清谷丙转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate amino transferase,AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、总胆汁酸(total bile acid,TBA)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)水平.结果:与模型组相比,杠板归总黄酮高剂量组小鼠血清ALT水平[(243.14±27.35) U/L]、AST水平[(345.02±24.01) U/L]、LDH水平[(505.97±68.56) U/L]、TBA水平[(112.02±17.16) nmol/mL]、TBIL水平[(15.08±4.09)nmol/mL]以及肝组织中GSH含量[(63.08±4.88) μmol/mg]和MDA含量[(3.55±0.32) nmol/mg]明显降低,差异具有统计学意义(P＜0.05);中剂量组小鼠肝组织中血清ALT水平[(330.56±24.74) U/L]、AST水平[(438.60±32.51)U/L]、LDH水平[(597.90±66.90) U/L]、TBA水平[(144.62±16.37)nmol/mL]、TBIL水平[(27.36±6.51) nmol/mL]以及肝组织中GSH含量[(54.52±3.80) μmol/mg]和MDA含量[(5.65±0.35) nmol/mg]与模型组相比也明显降低,差异也具有统计学意义(P＜0.05).结论:杠板归总黄酮对ANIT诱导小鼠胆汁淤积性肝损伤有一定的疗效.
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血浆置换联合连续性血液滤过治疗肝衰竭前期临床分析
目的:观察血浆置换(plasma exchange,PE)联合连续性血液滤过(continuous hemodiafiltration,CHDF)治疗肝衰竭前期(pre-liver failure,pre-LF)患者的临床疗效.方法:对49例肝衰竭前期患者临床资料回顾性分析,对照组为20例单纯内科综合治疗患者,治疗组为29例在内科综合治疗基础上进行PE联合CHDF治疗的患者.比较2组患者治疗1周后的血生化指标、临床转归等情况.结果:治疗组进行非生物型人工肝治疗(non-biologic artificial liver support system,NBALSS)后患者乏力、纳差、黄疸等症状得到改善,血C-反应蛋白(C reactive protein,CRP)[(19.04±11.37) mg/L vs.(54.81±37.60) mg/L]、白介素-6(inter-leukin 6,IL-6)[(17.01±9.86) pg/mL vs.(31.86±13.01) pg/mL]、谷氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)[(88.59±51.06)U/L vs.(279.93±69.75) U/L]、总胆红素(total bilirubin,TBIL)[(67.39±35.22) μmol/L vs.(133.21 ± 26.52) μmol/L]均明显下降(t值分别为6.28、7.51、12.26、7.40,均P=0.00),血凝血酶原活动度(serum prothrombin activity,PTA)水平明显升高[(88.86±20.16)％vs.(45.70±3.47)％,t=8.81,P=0.00];与对照组比较,差异均有统计学意义[C-反应蛋白:(19.04±11.37) vs.(29.21±22.05),t=2.04,P=0.02;白介素-6:(17.01 ±9.86) vs.(31.37±11.02),t=4.26,P=0.00;谷氨酸转氨酶:(88.59±51.06) vs.(194.70±90.86),t=4.93,P=0.00;总胆红素:(67.39±35.22) vs.(103.63±69.65),t=2.12,P=0.02;血凝血酶原活动度:(88.86±20.16)％ vs.(66.20±14.33)％,t=3.48,P=0.00].此外,治疗组患者1周后好转率为86.21％,高于对照组的55.0％ (x2=5.94,P=0.015).29例治疗组患者中死亡1例,20例对照组患者中死亡2例.结论:血浆置换联合连续性血液滤过治疗肝衰竭前期疗效优于对照组,提高了患者近期的好转率.
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葡萄糖调节蛋白GRP78与HBV的PreS1相互作用位点的初步研究
目的:初步研究78 kD的葡萄糖调节蛋白(the 78 kD glucose-regulated protein,GRP78)与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的前S1蛋白(PreS1)的相互作用位点.方法:利用PCR技术扩增GRP78的基因,将扩增的目的基因克隆至pW28载体质粒,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)B834中表达,经过镍离子亲和层析柱纯化GRP78蛋白;将PreS1 3个截短片段的重组质粒(pGST-PreS1-X1/X2/X3)在B834中表达后,经过GST亲和层析柱纯化相应蛋白;利用蛋白质体外结合实验(pull down)、微量热泳动(microscale thermophoresis,MST)检测GRP78与PreS1 3个截短片段的相互作用.结果:成功构建重组质粒pW28-GRP78;获得GRP78蛋白及PreS1 3个截短片段的融合蛋白;pull down及MST实验验证了GRP78可以与PreS1的3个片段结合,且GRP78与GST-PreS1-X1结合效果好.结论:利用分子克隆技术及蛋白质表达纯化技术,获得GRP78蛋白及PreS1截短片段的融合蛋白,并初步筛选了PreS1与GRP78的相互作用位点,为后续研究打基础.
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BCL6B抑制结直肠癌细胞HCT116增殖、迁移及其可能机制研究
目的:探讨B细胞淋巴瘤6B (B cell lymphoma 6 member B,BCL6B)对人结直肠癌细胞HCT116增殖、迁移的影响及机制.方法:采用定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和Western blot检测和比较人正常肠上皮细胞FHC及人结直肠癌细胞HCT116中BCL6B的内源性表达;用脂质体法将pcDNA3.1-BCL6B转入HCT116细胞,同时设转入空载体的对照组;运用MTT法、流式细胞术、划痕愈合及Transwell试验检测BCL6B对癌细胞增殖、周期及迁移能力的影响;采用Western blot检测细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、磷酸化的糖原合成酶激酶-3β(p-GSK3β)、细胞周期蛋白(CyclinD1)、基质金属蛋白酶-7 (matrix metalloproteinase-7,MMP-7)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达.结果:qPCR和Western blot结果显示,与正常肠上皮细胞FHC相比,BCL6B在结直肠癌细胞HCT116中呈明显低表达(P=0.017);转染pcDNA3.1-BCL6B后,细胞内BCL6B表达水平明显升高(-0.000).与阴性对照组相比,BCL6B组HCT116细胞4d时的增殖活性降低41.79％(P=0.040),且G1期细胞百分比增加62.09％ (P=0.001);同时,BCL6B组HCT116细胞48 h划痕愈合率及穿膜细胞数均明显减少(P=0.001).Western blot结果表明,BCL6B组HCT116细胞内β-catenin、p-GSK3β、CyclinD1和MMP-7的表达水平较阴性对照组分别降低65.66％ (P=0.028)、62.03％(P=0.001)、60.87％(P=0.021)和50.88％(P=0.030),E-钙黏蛋白的表达升高63.64％ (P=-0.018).结论:BCL6B可抑制结直肠癌细胞HCT116的增殖及迁移,其机制可能涉及Wnt/β-catenin通路的抑制.
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地塞米松对兔胆道成纤维细胞P311/TGF-β1/α-SMA通路表达的影响
目的:研究地塞米松(dexamethasone,DEX)对兔良性胆道狭窄(benign biliary stricture,BBS)模型胆管成纤维细胞(model fibroblast,MF)中P311/转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)/α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)通路表达的影响.方法:取2只家兔正常胆管培养正常胆管成纤维细胞(normal bile duct fibroblasts,NF),对2只家兔采用切开再吻合方法建立BBS模型并获取MF,进行细胞鉴定后分组为:NF、MF、MF+不同浓度的DEX(0.02,0.1及0.5 mg/mL)组,各组给予对应浓度的DEX干预48 h,CCK-8细胞计数法测定各组细胞增殖水平;qRT-PCR检测各组细胞P311、TGF-β1及α-SMA基因mRNA表达水平;Western blot检测各组细胞TGF-β1及α-SMA蛋白表达水平.结果:①各组细胞A值:NF为0.331±0.002,MF组为0.533±0.005,MF+DEX 0.02组为0.487±0.003,MF+DEX 0.1组为0.434±0.004,MF+DEX 0.5组为0.381±0.004.②各组细胞P311 mRNA值:NF组为1.000 0±0.024 8,MF组为4.146 3±0.037 1,MF+DEX 0.02组为3.789 9±0.056 8,MF+DEX 0.1组为3.566 1±0.148 1,MF+DEX 0.5组为2.945 8±0.165 4.③各组细胞TGF-β1 mRNA值NF组为1.000 0±0.034 6,MF组为2.647 9±0.048 5,MF+DEX 0.02组为1.929 7±0.054 8,MF+DEX 0.1组为1.678 2±0.080 2,MF+DEX 0.5组为1.676 2±0.036 9.④各组细胞α-SMA mRNA值:NF组为1.000 0±0.056 0,MF组为4.025 7±0.065 9,MF+DEX0.02组为3.644 9±0.196 4,MF+DEX 0.1组为2.712 9±0.102 4,MF+DEX 0.5组为2.320 7±0.031 2.⑤各组细胞TGF-β1蛋白值:NF组为0.999 6±0.046 3,MF组为2.096 3±0.029 3,MF+DEX 0.02组为1.781 8±0.040 4,MF+DEX 0.1组为1.531 4±0.032 5,MF+DEX 0.5组为1.384 0±0.035 7.⑥各组细胞α-SMA蛋白值:NF组为1.000 8±0.051 4,MF组为3.231 4±0.116 0,MF+DEX 0.02组为2.875 3±0.078 0,MF+DEX 0.1组为2.262 8±0.059 8,MF+DEX 0.5组为1.940 8±0.093 7.在DEX干预48 h后,MF增殖明显受到抑制,细胞P311、TGF-β1及α-SMA基因mRNA及蛋白表达明显下调(均P＜0.05,0.1～0.5 mg/mL),呈现浓度依耐性.结论:DEX抑制BBS形成的作用机制之一可能与它对MF中P311 fTGF-β1/α-SMA通路的调控有关.
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组织CD68+巨噬细胞与CD57+NK细胞对原发性食管癌生存状况的影响
目的:探究组织CD57+自然杀伤(natural killer,NK)细胞与CD68+巨噬细胞对原发性食管癌生存状况的影响.方法:回顾性分析2013年6月至2015年6月期间我院收治的96例原发性食管癌患者的临床资料.通过免疫组织化学染色法对患者CD57+NK细胞与CD68+巨噬细胞的浸润水平进行评估,分析96例患者CD57+NK细胞与CD68+巨噬细胞浸润情况、细胞浸润水平与病理特征的关系、CD57+NK细胞与CD68+巨噬细胞与TNM分期的关系、细胞浸润对原发性食管癌患者生存状况的影响.结果:原发性食管癌患者上皮组织中CD57+NK细胞高度浸润程度为64.58％,CD68+巨噬细胞为51.04％.原发性食管癌患者上皮组织中CD57+NK细胞与CD68+巨噬细胞浸润水平与患者的年龄、性别、肿瘤大小、N分期、T分期、TNM分期均无显著相关性(P＞0.05).原发性食管癌患者CD57+NK细胞、CD68+巨噬细胞在TNM分期Ⅰ-Ⅱ期与Ⅲ-Ⅳ期上的比较,癌旁CD57+NK细胞与CD68+巨噬细胞计数无统计学差异(P＞0.05).Ⅰ-Ⅱ期患者癌中CD57+NK细胞与CD68+巨噬细胞计数分别为(8.35±5.36)个/HP和(39.43±14.05)个/HP,均明显高于Ⅲ-Ⅳ期患者[(5.34±4.55)个/HP、(20.18±9.62)个/HP],差异具有统计学意义(P＜0.05).采用Cox模型(Forward:LR,引入α=0.05,剔除α=0.10)分析细胞浸润对原发性食管癌患者生存状况的影响.原发性食管癌患者肿瘤组织中CD57+NK细胞低浸润水平具有较高的死亡风险(P=0.046,RR=0.794,95％CI=0.633～0.996);原发性食管癌患者肿瘤组织中CD68+巨噬细胞高浸润水平具有较高的死亡风险(P=0.000,RR=1.925,95％CI=1.364～2.717).结论:CD57+NK细胞与CD68+巨噬细胞浸润水平能够反映机体免疫状态,CD57+NK细胞与CD68+巨噬细胞浸润水平检测在判断原发性食管癌患者的生存状况方面具有一定的临床价值.
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干扰素α-2a与α-2b的免疫原性研究
目的:观察干扰素α-2a(interferon α-2a,IFNα-2a)与干扰素α-2b (interferon α-2b,IFNα-2b)对昆明小鼠的免疫原性与免疫毒性.方法:实验设阳性对照P组(环磷酰胺,cytoxan,CTX,200 mg/kg)、IFNα-2b高剂量组(A组,2μg/mL)、IFNα-2b低剂量组(B组,0.5 μg/mL)、IFNα-2a高剂量组(C组,2μg/mL)、IFNα-2a低剂量组(D组,0.5μg/mL)以及阴性对照组(溶剂对照组,N组,0.1％牛血清蛋白Bovine serum albumin 0.1％BSA),每组8只腹腔注射给药5周.通过血清干扰素(interferon,IFN)浓度、干扰素抗体(antibodies of interferon,Anti-IFN)浓度及肾脏C3补体免疫组化进行免疫原性对比;通过小鼠体质量增量、脏器系数、血液学指标、免疫球蛋白以及脾脏组织病理学切片进行免疫毒性对比.结果:血清IFN浓度A组(9.27±0.79)高于C组(7.80±1.26) (P=0.000);B组(7.91±1.09)高于D组(5.97±0.98)(P=0.013).血清Anti-IFN浓度A组(7.49±1.30)低于C组(10.31±0.69)(P=0.000);B组(6.18±1.02)低于D组(8.24±0.74)(P=0.013).肾脏C3免疫组化A组(0.51±0.00)低于C组(0.54±0.00) (P=0.000);B组(0.42±0.00)低于D组(0.47±0.00)(P=-0.013).体质量增长量A组低于C组(P=0.015);B组低于C组(P=-0.003).脏器系数实验组与阴性对照组N组无差异.A、B、C、D组在白细胞计数(white blood cell count,WBC)、血小板计数(platelet count,PLT)、平均血红蛋白量(mean corpuscular hemoglobin,MCH)、淋巴细胞计数(lymphocyte count,LY)、淋巴细胞百分比(lymphocytes percentage,LY％)指标上高于N组但低于P组(P＜0.05).IgA、IgM、IgG浓度检测无统计学差异.干扰素实验组脾脏切片未发现病理结构改变.结论:IFNα-2a与IFNα-2b的免疫原性有差异;免疫毒性无明显差异.
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慢性应激对肠易激综合征的影响
肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是以腹痛、腹部不适或排便异常为主要表现的一种功能性疾病.应激是机体受到内外源刺激后,机体的一种适应性自我保护反应.长期慢性应激从多个方面诱发或加重肠易激综合征.全文就慢性不良应激对肠易激综合征的多方面影响进行综述.
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孤立性直肠结核1例并文献复习
目的:报告1例孤立性直肠结核患者的诊治过程,并综合国内外文献进行讨论,以提高对此病的认识.方法:对本院收治的1例孤立性直肠结核患者的临床表现、实验室检查、内镜及病理资料、诊断和治疗进行分析,并结合文献加以讨论.结果:本例患者以腹痛、排脓血便及消瘦入院,肠镜提示孤立性直肠巨大溃疡,病理检查未发现干酪样肉芽肿和抗酸杆菌,粪便细菌培养和结核杆菌聚合酶链反应(tuberculosis polymerase chain reaction,TB-PCR)阴性,结核菌素纯蛋白衍生物(tuberculin purified protein derivative,TB-PPD)+++,未见直肠外结核感染证据.诊断性抗结核治疗3个月后患者临床症状明显缓解,内镜下直肠溃疡较前好转,持续规范抗结核治疗15个月后痊愈,随访至今未见复发.结论:孤立性直肠结核临床罕见,缺乏特异的临床、影像及内镜下表现,易导致误诊.病理发现干酪样肉芽肿和抗酸杆菌阳性率低;结核菌素试验和诊断性抗结核简单、有效,对提高结核诊断率仍有重要意义.
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胰腺表面肠重复畸形并囊肿形成1例报道及文献复习
肠重复畸形是一种少见的先天性消化道畸形,胰腺表面肠重复畸形并囊肿形成则更为罕见[1-2].我院今收治1例该病患者,现一并综合国内外文献报道的病例进行相关分析与讨论,以提高对本病的认识.
关键词： -
自体骨髓间充质干细胞移植治疗失代偿期肝硬化Meta分析
目的:旨在汇集以前的临床对照实验,对BM-MSCs移植治疗晚期肝硬化进行有效性评估.方法:利用计算机联合检索万方(1990年1月至2016年5月)、知网(1990年1月至2016年5月)、PubMed(1990年1月至2016年5月)、Embase(1990年1月至2016年5月)、The Cochrane Library(2016年5期)、Science direct(1990年1月至2016年5月)、Medline(1990年1月至2016年5月)等数据库关于BM-MSCs移植治疗失代偿期肝硬化的随机对照试验(randomizedcontrolled trial,RCT)文献.语种限中文或英文,根据纳入和剔除标准筛选出符合要求的文献.以终末期肝脏疾病(end-stage liverdisease,MELD)评分、凝血酶原时间国际标准化比值(international normalized ratio,INR)、谷草转氨酶(aspertate aminotransferase,AST)等作为文章主要分析指标,用Review Manager 5.3软件进行Meta分析.结果:纳入文献8篇,共507例肝硬化患者(255例对照组,252例BM-MSCs治疗组).与对照组相比,BM-MSCs治疗1个月后MELD评分(MD=-1.65,95％CI=-2.8～-0.50,P=0.005),AST(MD=-0.26,95％CI=-0.44～-0.08,P=0.005),INR(MD=-0.26,95％CI=-0.44～-0.08,P=0.005)明显下降;BM-MSCs治疗6个月后疗效优于对照组:MELD评分(MD=-1.65,95％CI=-2.80～-0.50,P=0.005),AST(MD=-0.26,95％CI=-0.44～-0.08,P=0.005),INR (MD=-0.26,95％CI=-0.44～-0.08,P=0.005).结论:由于BM-MSCs具有调节免疫及分化成肝细胞的潜能,因此它可作为一种有前途的肝硬化治疗剂.且目前研究发现这种疗法能比较安全及有效地改善肝功能.然而,不同的变量在肝硬化优化治疗中如何控制尚不清楚.因此,肝硬化优化治疗策略需要在未来的临床试验及机制研究中进一步探讨.
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132例胆道闭锁Kasai术后患儿生存率及影响因素分析
目的:探讨影响胆道闭锁(biliary atresia,BA)患儿Kasai术后生存率的因素,为临床治疗方案选择及预后判断提供依据.方法:2007年1月至2014年1月间胆道闭锁行肝门空肠吻合术(Kasai术)且资料完整的患儿共132例,随访至2015年1月.所有数据录入SPSS19.0进行统计分析,运用寿命表法计算生存率,分别采用Kaplan-Meier法及COX比例风险回归模型对132例患者的手术时年龄、巨细胞病毒感染、术中病检肝硬化程度、术后是否应用激素与生存率间关系进行单因素和多因素综合分析.结果:132例患儿存活35例,死亡97例;存活患儿中位随访时间为53.3(12～86.17)个月.BA患儿Kasai术后1年预计生存率为(32.0±6.0)％,2年及5年预计生存率分别为(26.0±4.0)％及(24.0±4.0)％;术后未应用激素组存活率为18.7％(17/91),应用激素组存活率为43.9％(18/41);肝硬化组存活率为18.9％(14/74),非肝硬化组存活率为36.2％(21/58),经Log-rank检验,术后应用激素及非肝硬化为影响患儿长期生存的重要因素(P=0.027,P=0.037);经COX回归分析发现,术后激素应用是影响患儿生存率的重要独立因素(RR=0.602,95％CI=0.377～0.964,P=0.034).结论:Kasai术为提高胆道闭锁患儿生存率的有效治疗方式.术后合理应用激素治疗可能是提高术后生存率的重要措施之一.
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分化抑制因子1重组腺病毒的构建及其动物模型的建立
目的:构建分化抑制因子-1 (inhibitor 1 of differentiation,Id1)重组腺病毒(recombinant adenovirus,Rad),并建立Id1过表达的小鼠动物模型.方法:在HEK293细胞中将腺病毒重组质粒AdEasy-Id1进行包装以获得Id1重组腺病毒(RAd-Id1);通过绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记法测定腺病毒滴度;通过qRT-PCR和Western blot验证RAd-Id1感染的HepG2细胞中的Id1过表达效果,用MTS比色法检测RAd-Id1对HepG2细胞增殖的影响;通过尾静脉注射RAd-Id1的感染方式建立肝组织中过表达Id1的小鼠动物模型,病毒载量梯度实验分PBS空白组、RAd-GFP对照组及RAd-Id1实验组(n=5/组)以测定RAd-Id1感染小鼠的适合载量;病毒感染时间梯度实验每5d检测1次为1组,共7组(n=5/组)以测定感染小鼠的适合时间;通过Western blot检测小鼠肝组织中Id1的过表达效果及甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)和癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA)的表达水平,再采用ELISA检测小鼠血清中Id1的免疫原性及AFP和CEA的表达情况.结果:成功包装获得RAd-Id1,测得其滴度为1.5×1011 GFU/mL;RAd-Id1感染HepG2细胞48 h和72 h后,Id1的转录和蛋白水平均明显升高(P＜0.01);96 h时RAd-Id1实验组的MTS检测值较PBS空白组和RAd-GFP对照组(2.00±0.06 vs.1.18±0.05,2.00±0.06 vs.1.10±0.07;F=51.350,P=0.000)明显升高;Western blot结果显示:在RAd-Id1感染的小鼠肝组织中,Id1、AFP和CEA蛋白水平较PBS空白组和RAd-GFP对照组升高;ELISA实验结果表明:血清中AFP和CEA蛋白水平与RAd-Id1的载量呈正相关(rsAFP=0.903,PAPP=0.014;rs CEA=0.964,PCEA=0.002),不同载量RAd-Id1感染小鼠的血清中Id1抗体滴度无显著差异(尸＞0.05).结论:成功构建了RAd-Id1及其介导的小鼠动物模型;RAd-Id1可作为细胞水平上研究Id1对肝癌影响的载体工具;AFP和CEA的升高提示Id1可能参与诱导AFP和CEA的表达.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
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