世界华人消化杂志
World Chinese Journal of Digestology 세계화인소화잡지
- 主管单位： 华人消化杂志；新消化病学杂志
- 主办单位： 山西省科学技术厅
- 影响因子： 0.00
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 14-1260/R
- 国内刊号： 李军亮
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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重叠丙型肝炎病毒感染在慢性乙型肝炎患者肝脏病变中的作用
目的:观察重叠丙型肝炎病毒(HCV)感染对慢性乙型肝炎(CHB)患者肝脏病变的近期及远期影响.方法:选择6 mo-15 a前后行两次肝脏穿刺活体组织学检查的CHB患者230例两次同期血清标本应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行了HCV-RNA检测,并将血清HCV-RNA阳性与阴性患者近期肝脏病变及血清HCV-RNA持续阳性患者(随访时间4.12±1.46a)与随访时间具有可比性的持续阴性患者远期肝脏病变分别进行了回顾性对比分析.结果:血清HCV-RNA阳性4l例(17.83%).血清HCV-RNA阳性患者近期肝组织炎症活动度(G1、G2、G3、G4例数分布分别为5、8、16、12)与纤维化程度(S0、Sl、S2、S3、S4分布分别为l、3、8、19、10)与阴性患者(G1、G2、G3、G4例数分布分别为37、60、57、35;S0、Sl、S2、S3、S4分布分别为8、20、63、69、29)差异具有显著性意义(P＜0.05).随访结束时血清HCV-RNA持续阳性患者29例.HCV-RNA持续阳性患者与116例持续阴性患者远期肝组织炎症活动度(加重、无变化、好转例数分布分别为12、10、7;24、24、68)与纤维化程度(加重、无变化、好转例数分布分别为15、8、6;27、26、63)差异亦具有显著性意义(P＜0.05).结论:重叠HCV感染加重CHB患者肝脏病变,并加速其进展.
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手术与非手术治疗重症急性胰腺炎120例
目的:探讨重症急性胰腺炎外科治疗成功的关键.方法:通过对120例重症急性胰腺炎救治经验的总结,分析手术和非手术治疗效果.结果:手术治疗75例,治愈59例,死亡16例;非手术治疗45例,治愈39例,死亡6例,两种治疗效果无统计学差别(P＞0.05).合并ARDS而肺功能未纠正施行胰腺引流,死亡率明显升高(P＜0.01),休克、胰性脑病和全腹膜炎的患者手术与否无明显差异(P＞0.05)与死亡率有关的合并症为休克、ARDS、全身感染、胰周脓肿大出血和胰性脑病,分别占SAP死亡率的36.3%、27.2%、13.6%、13.6%和9.1%.重症急性胰腺炎外科治疗由过去过分强调手术转变为过分依赖非手术治疗,许多患者或死于不当手术,或死于未及时手术.结论:重症急性胰腺炎佳治疗方法只有一个,手术与否、何时手术,如何选择和把握是临床外科医生治疗成功的关键.
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家兔回肠淋巴管铸型的扫描电镜研究
目的:观察家兔回肠淋巴管的三维结构和微细分布.方法:淋巴管铸型样品,通过扫描电子显微镜进行观察;半薄切片样品,用光镜进行观察.淋巴管铸型剂是Mercox,采用回肠壁间接注射法.将注入铸型剂的回肠壁切下,置入NaOH水溶液中腐蚀,直到肠壁组织完全脱离为止,然后将淋巴管铸型样品置于扫描电子显微镜下观察.结果:在小肠绒毛内清晰地显示出中央乳糜管,每个绒毛中有2-3个中央乳糜管.中央乳糜管与黏膜层毛细淋巴管丛相连通.黏膜层毛细淋巴管注入黏膜下层淋巴管,后者与肌层淋巴管相吻合.肌层淋巴管连接浆膜层淋巴管,然后汇入小肠系膜淋巴管.淋巴管呈串珠样外观,其表面存有双凹切迹,该处相当于淋巴瓣的部位.铸型表面还可以见到淋巴管内皮细胞核的压迹.结论:淋巴管铸型清晰地显示家兔回肠壁黏膜层丰富的中央乳糜管和毛细淋巴管丛以及黏膜下层、肌层毛细淋巴管和大量的淋巴管的三维结构.
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肝硬变大鼠肝部分切除术后残肝TGF-α、HGF、PCNA和IGFBP-1s mRNA的变化
目的:探讨肝硬变状态下肝部分切除术后肝细胞和KCTGF-α、HGF、PCNA和IGFBP-1s的mRNA表达,进一步阐明KC在肝细胞再生中的作用.方法:复制我们建立的大鼠肝硬变肝切除模型,分离肝细胞和KC,提取RNA,采用Northern杂交.结果:KC其HGF mRNA表达较肝细胞为早,在术后6 h点达到高峰.但肝细胞TGF-αmRNA表达含量明显高于KC的表达.肝细胞IGFBP-1s mRNA的表达含量低,术后6 h点相对较高.KCIGFBP-1s mRNA未见表达.肝细胞PCNA mRNA的表达在术后6 h其含量达到低点,明显受抑制.结论:HGF和TGF-αmRNA表达与肝硬变大鼠的肝细胞再生密切相关,而TGF-α是肝细胞再生中重要的物质.IGFBP-1s mRNA表达降低反应了肝硬变大鼠术后肝细胞代谢明显受损,而PCNA mRNA表达可提示肝细胞增生能力.
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HBeAg肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆
目的:HBeAg被认为与HBV引起免疫耐受、免疫系统功能障碍有关.筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制.方法:应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HBeAg基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌,接种在氨苄青霉素-LB平板上选择并测序,结果在GenBank中进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBeAg基因并在酵母细胞中表达,与肝cDNA文库配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落39个,其中有5个未知基因,3个含金属硫蛋白2A基因的菌落,8个补体8 α基因,1个补体因子H,1个补体1q,1个维甲酸受体应答元件2基因、2个细胞色素b基因、3个铁蛋白轻链,2个NAD(P)H脱氢酶亚基,1个3-羟基类固醇表位酶,1个3-羟基,3-甲基戊二酰辅酶A合成酶,1个双-特异性酪氨酸-Y-磷酸化调节激酶1A转录子突变体,1个Syndecans-1,3个2胺氧化酶,4个醛缩酶B,1个CD81,1个ATP合成酶6基因.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒e抗原的结合蛋白,为进一步研究HBeAg在病毒装配、分泌、影响宿主免疫系统功能等方面的具体作用提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选HBcAg肝细胞结合蛋白基因
目的:乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)在HBV感染的肝细胞中可同时存在于筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBcAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBcAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落16个,其中含金属硫蛋白A2基因的菌落有2个、未知基因4个、补体8 α基因1个、NAD(P)H脱氢酶亚基1个、维甲酸受体应答元件2基因1个、细胞色素c氧化酶基因1个、细胞色素b基因1个、DAZ相关蛋白2基因2个、线粒体核蛋白L41基因2个、人血白蛋白基因1个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒核心蛋白的结合蛋白,为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
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大鼠肠巨噬细胞TNFα表达及复方大承气汤的影响
目的:探讨体外培养的肠巨噬细胞分泌TNFα的规律及地塞米松、TNFα单克隆抗体及复方大承气汤对LPS诱导的肠巨噬细胞TNFα产生的影响.方法:体外分离培养大鼠肠巨噬细胞.设对照组、脂多糖组、地塞米松处理组、TNFα单抗处理组和复方大承气汤处理组.每组分别在3 h,6 h,12 h和24 h取上清液,用放免法检测TNFα浓度.并分别收集肠巨噬细胞,提取RNA,采用RT-PCR法相对定量TNFαmRNA.结果:肠巨噬细胞经脂多糖(LPS)诱导后,各时相TNFα分泌及TNFmRNA表达均明显增加;地塞米松、TNFα单克隆抗体及复方大承气汤处理后,各时相TNFα分泌都较脂多糖(LPS)诱导组显著下降,各处理组TNFα mRNA表达在3h时与脂多糖(LPS)诱导组比较无明显差异,6h、12h、24 h,地塞米松、复方大承气汤处理组显著降低,而TNFα单克隆抗体处理组无明显差异.结论:LPS是肠巨噬细胞分泌TNFα的有效激活剂,地塞米松、复方大承气汤能从蛋白质及核酸水平抑制TNFα的产生,而TNFα单克隆抗体只能从蛋白质水平抑制TNFα的产生.
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大鼠肝卵圆细胞的生物学特征
目的:观察大鼠肝卵圆细胞的形态学参数、细胞表型及分化演变等生物学特征.方法:建立大鼠肝卵圆细胞增生模型,在肝组织切片上对大鼠肝卵圆细胞进行细胞图像分析及免疫组化染色.结果:肝卵圆细胞体积小、外形及胞核为椭圆形;胞质对细胞角蛋白(CK)19,OV6,甲胎蛋白(AFP)及波形蛋白染色呈阳性,对白细胞共同抗原(LCA)染色呈阴性,胞核对增生细胞核抗原(PCNA)染色呈阳性;在汇管区外周部位可见肝细胞样细胞,CKl9及OV6染色呈阳性.结论:肝卵圆细胞在形态学上明显不同于肝细胞,同时具有胆管细胞及肝细胞的表型;肝细胞样细胞为肝卵圆细胞向肝细胞演变的中间过渡细胞.
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细菌内同源重组法构建HBV S区和C区基因非复制型腺病毒载体及其体外表达
目的:构建表达乙肝病毒表面抗原(HB sAg)和e抗原(HBeAg)的非复制型重组腺病毒载体,并检测他能否在真核细胞中有效表达目的基因.方法:扩增乙肝病毒(HBV)前S2/S基因和前C/C基因片段,分别亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生分别携带HBV S区和C区基因的重组腺病毒载体pAd-HBs和pAd-HBe,经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-HBs和Ad-HBe;体外转染293和Vero细胞,RT-PCR和ELISA法检测目的基因的表达.结果:构建了表达HBsAg和HBeAg基因的重组腺病毒,病毒滴度可达5x1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论:成功构建表达HBsAg和HBeAg的重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.
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鼠肝移植对胃黏膜损伤的实验研究
目的:观察肝移植术后胃黏膜的病理变化.方法:采用二袖套法+肝动脉重建吻合法行鼠肝移植,经组织病理和电镜切片观察肝移植后胃黏膜的组织结构和细胞结构的变化.结果:肝移植后胃黏膜组织结构表现为充血、水肿、溃疡、糜烂形成.结论:肝移植伴随胃黏膜的损伤,需要预防治疗.
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细胞外信号调节激酶在胃癌组织中的表达及其与幽门螺杆菌感染的关系
目的:研究胃癌组织中细胞外信号调节激酶(ERK)的表达与幽门螺杆菌(H.pylon)的感染情况,探讨胃癌组织中ERK的表达与H.pylori感染的关系.方法:ERK的表达采用免疫组化S-P法,用改良Giemsa染色、快速尿素酶试验和H.pylori-IgG检测胃癌组织中H.pylori感染情况.结果:ERK1、ERK2在胃癌组织的细胞质和/或细胞核中表达,ERK1、ERK2在胃癌组织中表达的阳性率分别为82.5%和77.5%,在高-中分化腺癌、低分化腺癌、黏液腺癌和未分化癌中表达的阳性率均无显著性差异(P＞0.05).ERK1、ERK2的表达与胃癌的分期无关(P＞0.05).H.pylori阳性胃癌患者ERK1、ERK2的表达阳性率均明显高于H.pylori阴性患者(P＜0.05).结论:人胃癌组织中ERK1、ERK2的表达与H.pylori感染有关,H.pylori感染可能通过ERK信号传导途径诱导胃上皮细胞的增生,与胃癌发生有关.
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中药复方肠安泰对肠癌肺转移模型小鼠肠黏膜固有层B细胞及IL-12的影响
目的:探讨中药复方肠安泰对肠管绒毛黏膜固有层B细胞及IL-12的影响及其与肺转移的关系.方法:经皮下植入大肠癌高度肺转移细胞(C026Lu),建立大肠癌肺转移小鼠动物模型,采用ABC免疫染色及免疫荧光染色方法做相关分析.结果:荷瘤治疗组与荷瘤对照组相比IgA、IgM及IL-12阳性细胞在小肠绒毛黏膜固有层均有显著意义的增加.两组数值依次为172.3±6.7,59.2±53,79.6±4.1;131.2±53,45.1±4.3,24.4±2.5(P＜0.01).结论:中药复方肠安泰预防大肠癌肺转移的机制,与其促进了荷瘤小鼠小肠绒毛黏膜固有层B细胞的活化及IL-12的诱导有关.
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实验性肝纤维化形成过程中几种基质金属蛋白酶表达的研究
目的:研究基质金属蛋白酶及基质金属蛋白酶抑制因子在大鼠实验性肝纤维化形成过程中的作用及表达.方法:应用免疫组织化学和核酸原位杂交法研究MMP-1、MMP-2、TIMP-1蛋白及其mRNA和MT1-MMP mRNA在四氯化碳实验性大鼠肝纤维化形成过程中的表达变化.结果:在肝脏间质细胞和部分肝细胞中表达.在纤维化形成过程中MMP-1、MMP-2、TIMP-1蛋白及其mRNA和MT1-MMP mRNA的表达程度与肝纤维化程度密切相关.结论:肝脏间质细胞是MMPs及TIMPs主要细胞来源,部分肝细胞也有表达.MMPs及TIMPs在肝纤维化形成过程中共同发挥作用.
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新基因结构与功能研究的策略
发现一种新的基因,同时把其编码的新蛋白的结构与生物学功能、与生物学和临床医学之间的相互关系、以及新基因表达调节的机制阐明,是目前基因的分子生物学研究领域中具挑战性的工作.首先利用酵母双杂交(yeasttwo-hybrid)技术、酵母单杂交技术(yeast one-hybrid)、抑制性消减杂交(SSH,suppression subtractive hybridization)技术、基因芯片(DNA chip)技术、噬菌体表面展示(phagedisplay)技术等获得蛋白结合蛋白的编码基因、差异表达的基因、DNA/RNA结合的蛋白基因等,或利用生物信息学技术获得推测的编码基因.然后,利用分子生物学技术和生物信息学技术相结合的手段,阐明新基因的功能、基因表达启动子的结构和调节机制基础,终阐明新基因的结构和新蛋白的生物学功能,以及这种基因研究的可能临床医学意义.生物信息学技术与分子生物学技术的结合,是目前基因的分子生物学研究领域中的重要、有效的研究技术和方法.
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肿瘤抑制因子p21/waf1与肝炎病毒复制与表达的调节研究
0引言作为一种肿瘤抑制基因,p21/waf1在细胞周期、细胞凋亡、信号转导以及癌变中具有十分重要的调节作用[1].
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基因芯片技术在肝炎病毒研究中的应用
0引言基因芯片(gene chip)也称为DNA微距阵(DNA microarray)、DNA芯片(DNA chip)等,是近年发展起来的一项前沿生物技术.
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抑制性消减杂交技术原理及应用
0引言抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头,连接于测试cDNA片段的5'末端,达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段,抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他消减杂交技术相比具有假阳性率低、敏感性高、效率高等优点而得到广泛应用.
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丙型肝炎病毒与MAPK信号转导系统
0引言丙型肝炎病毒(HCV)是一种正链RNA病毒,其致病机制与DNA病毒和逆转录病毒有明显的区别[1].在病毒的生活周期中,HCV基因组编码多种结构和非结构蛋白,自身结合形成同二聚体形式,或与其他HCV病毒蛋白、细胞蛋白结合形成异二聚体,甚至是多聚体形式在肝细胞内存在[2].
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酵母双杂交系统的原理及应用
0引言蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础.随着分子生物学技术的发展,特别是人类基因组计划的完成,使人类对基因的结构和功能的认识不断加深,但基因编码的蛋白质的功能研究尚是一个难题.酵母双杂交(yeast two hybrid)技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用,该方法建立以来,经过不断的完善和发展,不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用,更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白.
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生物信息学技术与新基因的研究
0引言新基因的克隆化无异是生物医学领域创新知识源泉的重要组成部分.这一任务,不仅是人类基因组计划(HGP)的核心内容,同时也是后基因组计划(post-HGP)的重要内容.
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乙型肝炎病毒对细胞信号转导的影响
0引言乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒的一种,HBVDNA长度为3.2kb,具有4个开放读码框架(ORF),分别编码HBV的表面抗原蛋白,核心/e抗原,X蛋白以及HBV DNA的聚合酶.此外,HBV DNA结构中还有4段启动子、2段增强子以及与HBV DNA复制过程密切相关的顺向重复序列1、2(DR1、DR2)等[1].
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丙型肝炎病毒与JAK-STAT信号转导系统
0引言丙型肝炎病毒(HCV)感染具有显著的慢性化倾向,而且只有部分患者对于干扰素α(IFN α)的治疗有较好的应答.为什么会存在这种情况和差别,这是与HCV-肝细胞之间相互作用的分子生物学机制和基础来决定的[1].
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噬菌体展示技术的原理及应用
0引言1985年Smith[1]首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造,将EcoR Ⅰ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与pⅢ基因融合,获得的重组噬菌体可在体外稳定增生,表达产物能被抗EcoR Ⅰ内切酶抗体所识别.1988年Parmley et al[2]将已知抗原决定族与pⅢ的N端融合呈现在表面,可特异性地被抗体选择出来,并提出通过构建随机肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.1990年McCafferty et al[3]也报道了用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体的方法,从而开始了这项技术的广泛应用的新时代.
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酵母单杂交技术的原理及应用
0引言酵母单杂交(yeast one hybrid)技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法,通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析,来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因,或对DNA结合位点进行分析.运用此技术,能筛选到与DNA结合的蛋白质,并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列,而无需复杂的蛋白质分离纯化操作,故在蛋白研究中,具有一定的优势;而且,酵母属真核细胞,通过酵母系统得到的结果比其他体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况.
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应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因
目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因.方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1 000 b插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因.结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.
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噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体
目的:制备丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)的特异性人源化单链可变区抗体(scFv).方法:采用噬菌体表面展示技术,将生物合成的应用酵母双杂交技术筛选得到的HCV核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)16肽固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选出48个克隆,利用酶联免疫黏附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCBP6结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆,并对HCBP6特异性scFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了162倍.用酶联免疫黏附法测定第5轮筛选后上清液中含有的噬菌体抗体与HCBP6结合活性.其中有30株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高(P8 nm 0.77,P240.714,P26 0.728,P29 0.723,P38 0.803,P39 0.762,P43 0.747等).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有7株交叉反应较弱(P80.145,P24 0.119,P26 0.17,P29 0.186,P38 0.118,P39 0.138,P43 0.178),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株(P24)阳性克隆.提取质粒,SfiI/NotI双酶切后,将片段亚克隆到pCANTAB5E载体,进行DNA序列测定,DNA大小为771 bp,符合人源化单链可变区抗体典型的骨架区(FR)及互补决定区(CDR)的序列结构.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCBP6的scFv.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析
目的:筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白基因,并对新基因转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制.方法:应用酵母双杂交技术,以HCV的核心蛋白作为"诱饵(bait)",筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因.应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)基因的全长编码序列,并构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6.应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测.结果:通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定,结合生物信息学分析,确定人的HCBP6基因由456 nt组成,编码152aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1 152条目的基因均为GenBank中登录的基因,HCBP6表达质粒转染的细胞有20条差异表达基因,其中13条基因表达增强,7条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、增生、分化及生长调节密切相关.结论:酵母双杂交技术结合生物信息学技术,是克隆蛋白结合蛋白的有效方法,基因表达谱芯片技术对于初步全面探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明HCV核心蛋白与Hcbp6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因和蛋白的生物信息学分析
目的:克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合的肝细胞的蛋白基因,对新发现的基因及编码产物的结构与功能,及其基因表达的调节机制的结构基础进行生物信息学分析.方法:应用酵母双杂交技术,以HCV的核心蛋白作为"诱饵(bait)",筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因.应用生物信息学(bioinformatics)技术,对其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)全长基因及其编码产物的一级结构序列,进行生物信息学分析.获得该基因的基因组序列,并利用同源基因序列的比对,确定该基因在染色体上的定位,并确定人HCBP6基因的内含子序列.对其编码上游的基因组DNA序列进行分析,获得该基因启动子序列的一些信息.同时,根据同源基因序列的比较,确定了小鼠HCBP6的基因序列和氨基酸残基序列.通过对氨基酸残基序列的疏水性特点的分析,确定了HCBP6蛋白的潜在的抗原结构位点.通过蛋白质一级结构的在线计算机软件的分析,对人HCBP6蛋白质一级结构潜在的功能性结构位点进行了计算机辅助分析预测.结果:通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定,结合生物信息学分析,证实人HCBP6基因由456 nt组成,编码产物由152 aa组成.人HCBP6的基因组DNA是没有内含子序列的DNA结构.通过生物信息学技术分析,确定人HCBP6基因组DNA定位于人22号染色体上.在对人HCBP6基因启动子序列的生物信息学分析中发现了几段可能的启动子序列结构,以及可能的转录因子蛋白潜在的结合位点.利用同样的技术,确定了小鼠的HCBP6的基因序列和蛋白质一级结构序列.对人HCBP6的蛋白质一级结构序列进行分析,发现在其序列中第80-110氨基酸残基序列之间存在疏水性结构位点,提示抗原位点所在,对其进行免疫学分析提供了可能.利用在线软件,对人的HCBP6蛋白质结构中潜在的功能位点进行了初步的预测,为进一步研究HCBP6蛋白的生物学功能的实验研究,提供了丰富的信息.这些生物信息学分析的结果,虽然目前还只是初步的,有些还不能被实验所证实,但是,对新基因的结构与功能的研究来说,毕竟这种生物信息学分析,能够提供一些线索,对下一步结构与功能分析实验的设计,具有很大的帮助.结论:酵母双杂交技术结合生物信息学技术,是克隆、分析蛋白结合蛋白的基因,对于其功能结构域的预测的有效工具,在病毒性肝炎的致病机制研究中具有重要应用前景.
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酵母双杂交技术筛选Hcbp6结合的肝细胞蛋白编码基因
目的:Hcbp6是与核心蛋白相结合的未知功能蛋白基因,为了初步提示他的生物学功能和在细胞中的存在形式,采用酵母双杂交体系寻找与他相互作用的肝细胞蛋白,探讨Hcbp6的生物功能.方法:应用酵母双杂交系统3,构建Hcbp6诱饵质粒并转化酵母AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,在涂有x-α-gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒,转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析.结果:筛选出4种与Hcbp6特异性相互作用的蛋白,包括Paralemmin(PALM)、Ran结合蛋白2(Ranbp2)、跨膜运输蛋白21(Tmp21)和血清白蛋白.结论:推测该蛋白可能为一分泌性蛋白,或与分泌蛋白的形成有关,进一步的生物学功能的研究需要更多的实验加以探讨.
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单克隆抗体3A5-复方中药安迪偶联物的肝癌导向治疗
目的:探讨单克隆抗体3A5-复方中药安迪粉针剂偶联物(3A5-Andi)的肝癌导向治疗作用.方法:用单克隆抗体3A5与安迪粉针剂(Andi)制备偶联物,ELISA检测3A5-Andi偶联物保持对人肝癌BEL-7402细胞的免疫反应性;采用小鼠/裸鼠移植性肿瘤模型,5-FU为阳性对照组,观察12、24和50mg/kg的导向治疗作用.结果:克隆生成法显示,3A5-Andi具有比Andi更强的细胞毒性,二者的IC50分别为2.8 mg/L和5.1 mg/L(P＜0.01).24 mg/kg和50 mg/kg3A5-Andi ip对小鼠移植性腹水型H22肝癌的生命延长率(LPR)分别为133%和167%(P＜0.05);而12mg/kg和24mg/kgAndi的LPR分别为112%和138%(P＜0.05).24 mg/kg 3A5-Andi和12 mg/kg Andi iv对裸鼠移植性人肝癌BEL-7402细胞瘤的瘤重抑制率分别为63.5%和52.2%(P＞0.05).24 mg/kg 3A5-Andi和12 mg/kg Andipt对BEL-7402人肝癌的抑制率分别为75.4%和61.0%(P＞0.05).结论:3A5-Andi偶联物具有一定的肿瘤导向治疗作用;3A5-Andi与Andi比较,3A5-Andi对裸鼠移植人肝癌BEL-7402具有较强的治疗作用;pt方式3A5-Andi比iv疗效更好.
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热休克蛋白70与IL-2对小鼠肝癌移植模型的治疗比较
目的:比较分析肿瘤热休克蛋白70(HSP70)与IL-2对小鼠肝癌移植模型的治疗作用,评价HSP70的疗效,为应用HSP70治疗人类恶性肿瘤提供有重要参考价值的实验依据.方法:细胞培养、蛋白质纯化技术、电泳技术、Western-blot法、动物实验等.结果:IL-2及HSP70对小鼠肝癌移植模型均有治疗作用,其中IL-2 10万U、HSP70 10μg效果佳,IL-2 5万U及HSP70 5μg有部分治疗作用,10万U的IL-2与5μgHSP70治疗效果相当,HSP70 10μg治疗后有40%小鼠移植肿瘤全部消退,长期生存790 d,与对照组及其他各组相比,差异具有显著性(P＜0.01,P＜0.05).结论:HSP70具有良好的抗肿瘤免疫活性,其疗效明显优于IL-2,本研究对于应用HSP70治疗人类的恶性肿瘤有十分重要的借鉴意义.
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肝癌组织中survivin蛋白表达的意义
目的:研究survivin蛋白在人肝癌组织中的表达与临床病理特征及预后的关系.方法:应用免疫组织化学染色对48例肝癌中survivin蛋白与增生细胞核抗原(PCNA)的表达情况进行检测,采用TUNEL方法检测细胞凋亡,结合临床病理特征及预后进行分析.结果:48例肝癌中survivin蛋白表达阳性率为64.6%.Edmondson分级Ⅰ-Ⅱ级患者survivin蛋白表达明显低于Ⅲ-Ⅳ级患者(39.1% vs 88.0%,P=0.013).survivin蛋白表达阳性者肝癌细胞增生凋亡比显著高于表达阴性者(1.8vs 1.1,P=0.045).survivin蛋白表达阴性患者与表达阳性患者比较,1 a生存率差异无显著意义,但3 a生存率前者显著高于后者(70.6% vs 35.5%,P=0.011).结论:survivin蛋白对破坏肝癌细胞增生凋亡平衡、促进肝癌细胞快速增生具有重要作用,survivin蛋白的表达可以作为预后不良的重要指标.
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树突状细胞体内外对肝癌细胞的抑制作用
目的:研究树突状细胞对肝癌等肿瘤细胞的直接作用.方法:用rhGM-CSF和rhIL-4从健康人外周血诱导树突状细胞,用ELISA和MTT法分别检测DC培养上清液中IL-12和TNF水平,用MTT法检测DC对肝癌细胞SMMC-7 721、QGY-7703、HEPG-2、Alexander,胃癌细胞SGC-7901,慢性髓原性白血病细胞K562、Burkitt's淋巴瘤细胞Raji和正常人二倍体细胞的抑制作用,同时用流式细胞术检测DC表面FasL的表达,后用DC进行人肝癌裸鼠皮下抑制瘤的抑制试验.结果:诱导7 d的DC对4种肝癌细胞和胃癌细胞均有不同程度抑制作用,随着效靶比的增加,DC对肝癌细胞和胃癌细胞的抑制作用逐渐增加;DC预防人肝癌裸鼠皮下移植瘤,其抑制率为97%.结论:DC进入机体后也可以非特异性抑制方式发挥抑癌作用,本研究丰富和拓展了肝癌DC疫苗的内容,为今后肝癌DC疫苗的研究奠定了基础.
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肝癌DC疫苗活化的CTL对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用
目的:本研究探讨肝癌DC疫苗活化的CTL对人肝癌裸鼠皮下抑制瘤的抑制作用.方法:将负载肝癌相关抗原DC经BCG HSP7 0活化后制成肝癌DC疫苗,用此肝癌DC疫苗诱导的肝癌特异性淋巴细胞预防和治疗人肝癌裸鼠皮下移植瘤,同时观察DC对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的直接预防作用和冷冻复苏后肝癌特异性淋巴细胞对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的预防和治疗作用.结果:DC对肝癌细胞的抑制率为97%,用冷冻复苏后的CTL预防人肝癌裸鼠皮下移植瘤,对肝癌细胞的平均抑制率为96%;冷冻复苏后的CTL治疗人肝癌裸鼠皮下移植瘤,对肝癌细胞的抑制率为98%.结论;本研究结果为肝癌DC疫苗的进一步深入研究及今后的临床应用奠定良好的基础.
