世界华人消化杂志
World Chinese Journal of Digestology 세계화인소화잡지
- 主管单位: 华人消化杂志;新消化病学杂志
- 主办单位: 山西省科学技术厅
- 影响因子: 0.00
- 审稿时间: 1-3个月
- 国际刊号: 14-1260/R
- 国内刊号: 李军亮
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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不同消化道癌对化疗药物敏感性的应用研究
目的:通过常见消化道癌对不同抗癌药物以及不同联合用药方案的敏感性作比较,以期寻找各自的合理的化疗用药方案,从而指导不同消化道癌的化疗.方法:通过肿瘤细胞体外药敏试验(即四甲基偶氮唑盐着色法.MTT),对97例食管癌、116例胃癌、34例肝癌以及169例大肠癌新鲜标本进行化疗药物敏感性检测,并对其结果作比较.结果:除对丝裂霉素(mitomycin C,MMC)、顺氯氨铂(cisplatin,DDP)、5-氟尿嘧啶(5-flurouracil,5-FU)加DDP的敏感性无差异外(P>0.05),对其余所有药物的敏感性均有显著性差异(P<0.01),其中,食管癌、胃癌及大肠癌均对5-FU加羟基喜树碱(hydroxycamptothecine.HCPT.OPT)、5-FU加MMC敏感,其敏感率分别为79.4%和73.2%、78.4%和62.7%、60.4%和55.6%,肝癌则对5-FU加MMC及5-FU加柔红霉素(aunorubicin,DNR)敏感,其敏感率分别为70.5%和79.4%.结论:不同的消化道肿瘤对不同抗癌药物的敏感性存在差异,且联合药物的敏感性优于单药.
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直肠癌根治术联合放化疗的临床疗效比较
目的:对比直肠癌多种治疗模式对患者生存率的影响.方法:1994-01/2001-12住院的pTNM Ⅱ,Ⅲ期直肠癌患者242例,男149例,女93例,平均年龄53(20-82岁),分为单纯手术组57例;联合化疗组64例;联合放化疗组66例;免疫化疗组65例.随访12-72(中位随访时间47 mo),随访率94.2%.结果:术前放疗组的保肛率79%,显著高于其他组(56%,53%和51%,P=0.004).单纯手术组与联合化疗组和免疫化疗组相比,术后复发率无显著差异(16%,14%和15%),而联合放、化疗组复发率为6%;与其他三组比较有显著性差异(P=0.026);免疫化疗组远处转移率显著降低(30%对13%,P=0.011).与单纯手术组相比,联合化疗组在5 a生存率有提高(68%对76%,P=0.078);放化疗组和免疫化疗组的总生存率均有显著提高(68%对82%和80%;P=0.040和0.015).结论:直肠癌根治术加辅助放、化疗或免疫化疗的总体治疗模式效果优于单纯手术.
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络泰综合治疗十二指肠球部溃疡疗效观察
目的:观察探讨络泰注射用血塞通(冻干)综合法莫替丁与胶态次枸橼酸铋治疗十二指肠球部溃疡(DU)的疗效.方法:将120例DU患者随机均分为治疗组和对照组,治疗组为前2 wk静滴络泰、静滴法莫替丁及口服胶态次枸橼酸铋,后2 wk单口服法莫替丁,对照组为前2 wk静滴法莫替丁及口服胶态次枸橼酸铋,后2 wk单口服法莫替丁,两组疗程均为4 wk.结果:(1)治疗组60例中愈合54例(90%),好转4例(6.7%),无效2例(3.3%),总有效率96.7%.(2)对照组60例中愈合38例(63.3%),好转12例(20%),无效10例(16.7%),总有效率83.3%.治疗组疗效优于对照组,二者有显著差异(P<0.05).结论:络泰综合法莫替丁与胶态次枸橼酸铋治疗DU可提高愈合率及总有效率,是治疗DU的一种具有较好疗效的方法.
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脆性组氨酸三联体基因蛋白表达与炎症性肠病的临床关系
目的:探讨脆性组氨酸三联体基因(fragile histidine trail,FHIT)蛋白在38例溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)、25例Crohn's病、11例UC相关性腺癌和13例正常对照组中的表达情况.方法:标本常规石蜡包埋,采用免疫组化法检测FHIT在UC、Crohn's病、UC相关性腺癌和正常对照组中的表达.结果:38例UC中,25例FHIT蛋白表达阴性;25例Crohn's病中,19例表达阴性;11例UC相关性腺癌中,6例表达阴性.FHIT蛋白在UC和正常对照组(71.43% vs 7.69%,x2=18.80,P<0.01)、Crohn's病和正常对照组(76%vs 7.69%,x2=18.88,P<0.01)、UC相关性腺癌和正常对照组(54.55% vs 7.69%,X2=7.75,P<0.05)间均有显著性差异;而在UC和UC相关性腺癌中无显著性差异(54.55% vs 71.43%,X2=0.05,P>0.05).结论:FHIT蛋白在炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)和UC相关性腺癌中呈低表达或缺失,提示该基因可能与IBD和UC相关性腺癌发生有关.
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大鼠骨髓基质干细胞分化为胰岛样细胞
目的:探讨体外自体骨髓基质干细胞(MSC)定向诱导分化为胰岛样细胞的可能性,为进一步诱导分化胰岛细胞治疗糖尿病奠定实验和理论基础.方法:对Wistar大鼠骨髓基质干细胞(MSC)进行体外培养,通过不同的条件诱导MSC向胰岛样细胞分化:LN组,10 mmoL/L尼克酰胺+1 mmoL/L β-巯基乙醇的L-DMEM(含20 mL/L FBS)预先诱导24 h,10 mmoL/L尼克酰胺+1mmol/L β-巯基乙醇的无血清H-DMEM诱导10 h.HN组,含20 mmoL/L尼克酰胺的L-DMEM(20 mL/L FBS)预先诱导24 h,20 mmoL/L尼克酰胺的无血清H-DMEM诱导10 h.诱导细胞形态通过倒置显微镜观察,并通过免疫细胞化学检测分化细胞表达Insulin和Nestin.向3只Streptozotocin(STZ)诱导糖尿病大鼠皮下种植MSC分化胰岛细胞1×107,1 wk后观察大鼠血糖水平变化.结果:LN、HN组细胞均可见部分骨髓基质干细胞分化、增生,形成胰岛样细胞团,部分细胞向神经元样细胞分化,对照组细胞未见明显分化.免疫细胞化学显示Insulin在诱导细胞呈显著表达,Nestin在分化前细胞显著表达.皮下种植MSC分化胰岛细胞可有效降低STZ糖尿病大鼠的血糖水平.结论:体外诱导骨髓基质干细胞定向分化为胰岛样细胞存在可行性,本实验将可能为临床糖尿病干细胞治疗提供新的途径.
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大肠癌组织HLA-Ⅰ类抗原及相关分子的表达意义
目的:探讨大肠癌组织HLA-Ⅰ类分子及相关分子表达及其意义.方法:用免疫组化的方法,以切端黏膜作为正常对照,检测大肠癌组织、癌旁组织和正常黏膜组织中HLA-Ⅰ类分子及相关分子的表达,并结合肿瘤的临床病理资料综合分析.结果:受检的大肠癌组织中重链HLA-A位点、B/C位点及轻链beta2微球蛋白(β2M)较其相应正常黏膜表达明显下调(P=0.0 001);肠癌中低分子量多肽(LMP2)(P=0.0 001),钙联蛋白(calnexin)(P=0.004)较正常黏膜表达明显下调;肠癌中HLA-Ⅰ类分子表达与肿瘤分化无关;随着肿瘤的Dukes分期,癌组织中HLA-Ⅰ类分子表达渐次降低,但各位点表达情况并不相同,HLA-B/C表达水平与肿瘤分期相关,其在Dukes A期表达水平高于D期(P=0.0262).结论:肠癌组织及癌旁黏膜中HLA-Ⅰ类分子、低分子量多肽及钙联蛋白较正常黏膜表达明显下调;肠癌组织中HLA-B/C位点随着肿瘤Dukes分期演进其表达下调.
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幽门螺杆菌感染与慢性胃炎胃黏膜组织中COX-2、iNOS表达的相关性研究
目的:探讨幽门螺杆菌(Hpylori)感染对曼性胃炎胃黏膜环氧化酶-2(COX-2)、一氧化氮合酶(iNOS)表达以及对胃上皮细胞增生与凋亡的影响,阐明Hpylori可能的致癌机制.方法:22例经胃镜及病理确诊为慢性浅表性胃炎患者,采用快速尿素酶及改良Giemsa染色法检测Hpylori;采用半定量RT-PCR和免疫组化法检测胃黏膜中COX-1、COX-2和iNOS的表达;以染色法原位检测胃上皮细胞的凋亡;以免疫组化法检测胃上皮细胞的增生.结果:与正常对照组相比,Hpylori相关性胃炎胃黏膜组织COX-2和iNOS表达明显增高,增生、凋亡指数差异显著;Hpylori感染导致的COX-2和iNOS表达程度与胃黏膜上皮细胞增生、凋亡呈正相关(r=0.716,0.603,P<0.01;r=0.665,0.572,P<0.01).结论:Hpylori感染导致胃黏膜COX-2和iNOS的高表达,与胃上皮细胞的增生与凋亡失衡有关,从而参与致癌.
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Melatonin对大鼠肝再灌注损伤的保护作用
目的:探讨褪黑素对大鼠肝再灌注损伤的影响作用及其机制.方法:150只健康♂Wistar大鼠(质量190-210 g,6-7周龄),随机分为褪黑素处理组(Mel)、酒精溶媒对照组(Alc)和生理盐水对照组(NS).建立肝缺血再灌注损伤模型,缺血均为60 min,之后每组分别按再灌注后30 min、1、6、12、24 h采集标本.M组(20 mg/kg)于缺血前30 min腹腔注射melatonin;A组采取与Mel组相同浓度的酒精液,N组则注射同比例的生理盐水.测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),肝组织中超氧化物岐化酶(SOD)及肝组织过氧化的终产物-丙二醛(MDA),对肝组织进行HE染色及ICAM-1免疫组化染色.结果:Mel组在再灌注后各时点的ALT均显著低于Alc及NS对照组(aP<0.05),且Alc组与NS组相比无显著性差异.Mel组在再灌注后6、12、24h时点的MDA显著低于Alc及NS对照组(aP<0.05),且各时点内Alc组与NS组相比无显著性差异.Mel组在再灌注后12、24 h时点的SOD显著高于Alc及NS对照组(cP<0.05),且各时点内A1c组与NS组相比无显著性差异.Mel组在再灌注后各时点ICAM-1染色的阳性细胞率均显著低于Alc组和NS组(aP<0.05),且每时点内的Alc组与NS组相比无显著性差异.结论:外源性Mel可以抑制再灌注后血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),增加肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、的活性,减少肝组织MDA的浓度,抑制肝组织ICAM-1蛋白的表达,对缺血再灌注肝损伤有明确的保护作用.
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银杏叶提取物抗大鼠肝纤维化的作用
目的:探讨银杏叶提取物对实验性大鼠肝纤维化的预防及治疗作用机制.方法:采用四氯化碳腹腔注射诱导的大鼠肝纤维化模型,60只Wistar大鼠分为5组:模型组、银杏叶干预组、银杏叶治疗组、银杏叶组,另设正常对照组,应用HE染色观察大鼠肝组织的改变及Von-Gieson胶原纤维特殊染色观察肝纤维化程度,并采用免疫组织化学染色法及RT-PCR法检测肝组织Ⅰ型胶原、TGF-β1蛋白和mRNA的表达.结果:银杏叶干预及治疗组与模型组相比肝组织结构明显改善、纤维化增生程度减轻;肝组织内Ⅰ型胶原、TGF-β1的含量(Ⅰ型胶原:0.2 563±0.0 009 vs 0.2 885±0.0 025,0.2 541±0.0 076 vs 0.2 885±0.0 025,P<0.01;TGF-β1:0.2 785±0.0 012 vs 0.3 015±0.0 012,0.2 791±0.0016 vs 0.3 015±0.0 012,P<0.01)以及mRNA的表达均明显低于模型组(Ⅰ型胶原:0.0 778±0.054 vs 0.2 361±0.113,0.1 075±0.007 vs 0.2 361±0.113,P<0.01;0.523±0.015 vs 0.956±0.049,0.524±0.009 vs0.956±0.049,P<0.01);银杏叶组与正常对照组之间无差异.结论:银杏叶提取物可抑制肝星状细胞激活和转化,下调Ⅰ型胶原、TGF-β1蛋白质及其mRNA的表达,从而抑制或逆转纤维化形成.
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颈交感神经干离断对应激大鼠ET-1及胃黏膜血流量的影响
目的:研究颈交感神经干离断对浸水大鼠胃黏膜血流量的影响.方法:30只♂SD大鼠随机分为3组(n=10)Ⅰ组为正常对照组,Ⅱ组为浸水对照组;Ⅲ组为颈交感神经干离断后浸水组.Ⅰ、Ⅱ组只将颈交感神经干暴露、分离,不离断;Ⅲ组离断颈交感神经干并将断端结扎.将Ⅱ、Ⅲ组大鼠垂直浸水(水温23±1℃)至剑突水平,6 h后取出,测定各组胃黏膜血流量(GMBF),评价黏膜损伤程度.放免法测定血浆及胃黏膜ET-1含量.结果:Ⅱ组胃黏膜见出血及糜烂.Ⅲ组黏膜损伤程度明显轻于Ⅱ组.Ⅲ组与Ⅱ组比较GMBF明显升高,二者分别为130.0±14.5;68.9±12.7(P<0.01).Ⅱ组和Ⅲ组的溃疡指数(UI)分别为50.1±12.3;26.6±9.4差异极显著(P<0.01),Ⅱ组和Ⅲ组的GMBF值与UI呈高度负相关,γ=-0.847,P<0.001.Ⅱ组大鼠的血浆及胃黏膜的ET-1值明显高于Ⅰ组,P<0.01;Ⅲ组的血浆ET-1值也明显高于Ⅰ组但与Ⅱ组比较明显减少,P<0.01.Ⅲ组大鼠的胃黏膜组织的ET-1值明显高于Ⅰ组,P<0.01,但与Ⅱ组比较无显著差异.结论:颈交感干离断可增加浸水应激大鼠胃黏膜血流量,对胃黏膜损伤有保护作用.血浆及胃黏膜ET-1参与了颈交感神经干离断对胃黏膜保护的作用.
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一氧化氮在大鼠梗阻性黄疸继发肝功能损伤中的作用
目的:探讨一氧化氮(NO)在梗阻性黄疸合并肝功能障碍中的作用.方法:将56只Wistar大鼠随机分成假手术对照组和胆总管结扎组(实验组).应用胶原酶灌注法分离肝细胞并进行培养;用白介素-1β(IL-1β)等细胞因子处理培养的肝细胞,应用Griess法和Western印迹分析法检测两组NO及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的产生;应用高效液相色谱法(HPLC)检测两组肝细胞5'三磷酸腺苷(ATP)的合成;应用酶法检测两组肝细胞酮体含量并计算酮体比率(乙酰乙酸盐/β-羟基丁酸盐)(KBR).结果:实验组NO产生量明显高于对照组(207.99 μmoL/L vs78.57 μmoL/L P<0.01);NO的产生与IL-1β作用时间和作用剂量有关;实验组和对照组的iNOS产生量在蛋白水平没有差异;IL-1 β降低了实验组培养肝细胞的ATP含量(15.94 nmoL/106 cells vs 20.21 nmoL/106cells,P<0.05),对照组改变不明显;IL-1 β降低了两组的KBR,实验组降低程度大于对照组;一氧化氮合酶(NOS)抑制剂NG-甲基-L-精氨酸(L-NMMA)抑制了NO的产生,使降低的肝细胞ATP含量、KBR得以恢复.结论:梗阻性黄疸能够促进肝细胞产生NO,导致肝功能障碍.L-NMMA可以缓解由于大量NO导致的ATP合成障碍及KBR下降.对NO产生的调节可能会成为预防及治疗梗阻性黄疸继发肝功能损害的有效方法.
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评价幽门螺杆菌根除治疗效果的检查方法和时机选择
幽门螺杆菌(Hp)根除治疗后,因细菌数量减少和尿素酶活性受抑制或其他产尿素酶的细菌过度生长,常导致多种Hp检测方法出现假阴性或假阳性,影响对Hp根除治疗效果的评价.本文对根除治疗后Hp检查方法和时机的选择加以综述,Hp根除治疗后6 mo,尿素酶依赖性试验(RUT或13C-UBT)评价根除治疗效果准确性高,粪便Hp抗原(却SA)试验在根除治疗后6 mo仍有一定的假阳性,准确性不如尿素酶依赖性试验.
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抑制性消减杂交技术及其在感染病学中的应用
抑制性消减杂交技术(Suppressive subtractive hybridization,SSH)是近年来兴起的一种检测差异表达基因的方法,广泛用于寻找疾病及肿瘤相关基因、生长和发育相关基因、物的筛选和靶向治疗及其明确基因的功能等.本文从SSH技术的原理、效率、存在的问题和展望及其在感染病学中应用等方面进行了综述.
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基因功能研究新途径-RNA干扰
近年来的研究表明,一些小的双链RNA可以高效特异地阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNA interference,RNAi).他是体内抵御外在感染的一种重要保护机制,也可以作为一种简单有效的代替基因敲除的遗传工具.现就RNAi的研究进展做一综述.
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RNA干扰技术与消化系肿瘤的基因治疗
将靶基因序列同源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)导入细胞可以抑制某些基因的表达,即RNA干扰(RNA interference,RNAi).RNAi是机体中普遍存在的机制,起到负责基因的表达和调控的作用.由于RNAi能够高效特异地抑制基因表达,RNAi技术在研究基因功能、遗传规律、信号转导机制等多个领域迅速展开.作为一项崭新的技术,RNAi在肿瘤的基因治疗方面具有非常广阔的前景.本文就近年来RNAi技术在消化系肿瘤的基因治疗中的运用作一综述.
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Calpainμ与肝脏的缺血再灌注损伤
随着医学科学的迅速发展,肝移植和肝癌手术已逐渐成为普遍的手术.然而,供肝的保存和肝癌手术时,肝门部常温阻血后的再灌注损伤是导致移植肝脏和肝癌术后的肝脏能不良的重要因素.当肝脏的缺血再灌注时,Ca2+细胞内大量流入,引起与Ca2+依赖性水解蛋白酶(calpain μ)的活性化(初期反应变化)为十分重要的基点.我们曾经通过TBHP(tert-butyl hydroperxride)处理培养肝细胞,发现细胞内Ca2+的大量流入,从而发现及确定了calpain μ的活性化出现,继而发现了细胞膜bleb的形成,造成细胞骨骼蛋白如talin、α-actinin酶系统的大量分解.我们曾在大白鼠的动物模型中,以68%肝门部常温阻血10 min,再灌注5 min,反复重复6次共缺血1 h,但未发现calpainμ的出现.在人体肝脏手术中,肝门常温阻血12 min也同样地未发现calpain μ的出现.另外,在肝门部常温阻血前静脉注射prostaglandinI2(PGI2)的诱导体OP2507、prostag-landin E1(PGE1)或prednisolone,发现即使肝门部常温阻血25 min,也未发现calpain μ的出现.
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胃肠功能障碍患者胃黏膜内pH值的监测方法和意义
胃肠功能障碍容易诱发多器官功能障碍综合征(MODS),胃黏膜内pH(pHi)值作为研究胃肠功能障碍患者病情变化的主要检测指标,能够敏感反映MODS发生过程中容易受累的胃肠黏膜缺氧情况,较其他临床指标更早提示患者病情的变化.目前测定胃phi的方法主要有张力计法和胃管法,二者均能够连续测定胃pHi值,及时准确地反映胃肠功能障碍患者的病情变化.本文通过查阅大量文献资料并结合临床经验,系统阐述了胃肠功能障碍患者胃pHi的监测方法、意义和需要注意的问题,为及早采取相应治疗措施,预防MODS的发生提供理论依据和临床参考.
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生物芯片技术
生物芯片技术是近年发展起来的极具时代特征的新型检测分析技术.他的出现实现了对生物样品高效、快速和高通量的微量检测,使全面、综合分析某些生命现象成为可能,从而为生命科学、医学、化学、新药开发、食品与环境监督等众多领域提供了强有力的技术支持.
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错配修复基因甲基化紊乱与消化系肿瘤
肿瘤的发生过程中,表型遗传修饰对肿瘤相关基因的表达起调控作用,主要有总基因组甲基化水平降低,癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化及抑癌基因的低乙酰化.其中,DNA错配修复基因的失活与基因的甲基化紊乱密切相关.hMLHl(human Mut L homologue 1)和hMSH2(humanMut S homologue 2)是DNA错配修复的主要控制基因,其表达的失活与该启动子区高甲基化有关.本文就消化系肿瘤发生中错配修复与甲基化紊乱关系作一综述.
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肿瘤干细胞与实体肿瘤
人急性粒细胞性白血病干细胞(LSC)的分离、鉴定及功能研究认为肿瘤起源于干细胞,是一种干细胞疾病.虽然有证据表明,实体肿瘤也存在类似的肿瘤干细胞,但基于条件限制长久以来没有得到分离鉴定.近具有自我更新和分化能力以及特异表面标志的乳腺癌、脑肿瘤干细胞相继被离鉴定,提出实体肿瘤是干细胞疾病的理念,认为肿瘤是功能异质性的,只有小部分肿瘤干细胞才有成瘤及维持恶性显型的作用,因此肿瘤的治疗关键应是针对肿瘤干细胞的治疗,这对传统的肿瘤治疗方式提出了巨大的挑战.作为新课题,实体肿瘤干细胞的起源、研究方法、研究内容及进一步研究方向尚需探讨,但是肿瘤干细胞研究对实体肿瘤发生发展机制的阐明、治疗新靶点的发现等将产生深远影响.
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大肠组织中PTEN表达在大肠癌诊断与预后中的临床意义
目的:探讨PTEN的表达在大肠癌发生、发展中的作用及其在预后判断中的临床意义.方法:采用免疫组化S-P方法对12例正常大肠组织,45例大肠癌组织进行PTEN蛋白表达的研究.结果:大肠癌组织中PTEN蛋白阳性表达率(42.22%),明显低于正常大肠组织(91.67%),两组比较有显著性差异(P<0.05).PTEN蛋白表达与大肠癌肿瘤大小、患者年龄、组织分级、临床分期无关.PTEN蛋白的表达与大肠癌淋巴结转移、远处脏器转移及预后有关.结论:PTEN蛋白的异常表达参与了大肠癌的癌变过程,PTEN可以作为判断大肠癌浸润和转移的分子学指标,并对大肠癌预后有一定的参考价值.
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中药消痰散结方对人胃癌裸鼠原位移植瘤VEGF,KDRmRNA表达的影响
目的:研究消痰散结方(以下简称消方)对裸鼠人胃癌原位种植瘤生长转移的抑制作用及其对(vascular endothelialgrowth factor,VEGF),(kinase insert domain receptor,KDR)表达的影响.方法:建立人胃癌裸鼠原位种植高转移模型,实验动物随机分为4组(荷瘤对照组、消痰散结方组、5-FU化疗组、联合组),于接种第12 wk处死动物,取肝脏及淋巴结,作组织病理学检查,观察消方对肿瘤转移的抑制率,同时留取部分标本运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对VEGF、KDRmRNA作定量检测.结果:所有荷瘤鼠胃壁均有肿瘤生长,且有不同程度的远处转移.RT-PCR检测发现,消方组、化疗组、联合组癌组织内VEGF、KDRmRNA含量均显著低于荷瘤对照组(P<0.01),且消方组中癌组织VEGF、KDRmRNA表达量较化疗组、联合组亦明显降低(P<0.01),具有统计学意义.结论:消方具有一定抑制胃癌转移的作用.其作用机制之一可能是下调了肿瘤组织VEGF、KDRmRNA表达水平而起到抗胃癌浸润转移的作用.
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胃肠道间质瘤端粒酶活性与细胞凋亡及p53、Bcl-2表达的关系
目的:探讨端粒酶活性、细胞凋亡及p53、Bcl-2基因表达与胃肠道间质瘤(GIST)生物学行为的关系.方法:分别采用端粒酶活性试剂盒、原位末端标记和免疫组织化学的方法对38例GIST标本进行端粒酶活性、细胞凋亡和p53、Bcl-2基因表达的检测,并结合临床病理资料进行分析.结果:GIST端粒酶活性阳性率在恶性中为85%(17/20),在潜在恶性中为22.8%(2/9),在良性中为0(0/9)(P<0.01);GIST细胞凋亡指数在恶性中为11.7±5.4,在潜在恶性中为30.2±5.6,在良性中为45.2±7.2(P<0.05);端粒酶阳性组细胞凋亡指数为9.5±5.7,阴性组为22.9±8.4(P<0.01);端粒酶阳性组p53阳性表达率为78.9%,阴性组为40.0%(P<0.05);端粒酶阳性组Bcl-2阳性表达率为84.2%,阴性组为40.0%(P<0.05).结论:端粒酶活性、细胞凋亡与GIST良恶性有关,他们的检测有助于GIST的临床病理诊断.
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c-MYC与大肠癌血管生成的关系及临床意义
目的:探讨c-MYC与大肠癌血管生成的关系、可能机制及与临床病理特征间的关系.方法:采用免疫组化S-P法对50例大肠癌组织,16例正常大肠组织的c-MYC、血管内皮生长因子(vascular eh-dothelial growth factor,VEGF)及CD34进行检测.结果:c-MYC与VEGF的表达之间存在显著相关性(x2=9.232,P=0.002),c-MYC、VEGF阳性组及c-MYC、VEGF双阳性组的MVD值(43.3±9.6、42.3±9.2、42.6±8.9)均显著高于c-MYC、VEGF阴性组及双阴性组的MVD值(t=2.253、2.105、2.301,P<0.05);c-MYC、VEGF及双阳性组大肠癌的淋巴结转移率明显高于阴性组(x2=6.879、5.711,P<0.05),且以双阳性组高(68.9%);c-MYC、VEGF及双阳性组的阳性率随Dukes分期而增加(x2=9.306、6.330、6.953,P<0.05);而c-MYC、VEGF的阳性率与大肠癌的组织学类型及分化程度无关(P>0.05).结论:c-MYC与大肠癌的血管生成相关,并可能是通过VEGF引起的,这为以c-MYC为靶点的基因治疗提供了理论依据.
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肝纤维化大鼠肝细胞凋亡和增生的关系
目的:在四氯化碳诱导的实验性肝纤维化大鼠中研究肝细胞凋亡及Fas抗原和Bcl-2蛋白表达与增生细胞核抗原(PCNA)的关系.方法:将SD大鼠44只随机分成2组,每组22只,分别造模.常规石蜡切片,TUNEL原位标记法检测细胞凋亡指数,免疫组织化学法检测Fas抗原、Bcl-2蛋白和PCNA.结果:病理模型组实验大鼠肝组织细胞凋亡指数(AI)明显低于正常对照组(0.31±0.12 vs 0.49±0.10),P<0.01.与正常对照组相比,病理模型组实验大鼠肝组织Fas阳性表达计分明显降低(2.72±0.47 vs 1.75±0.67),P<0.01.Fas与Bcl-2呈明显负相关(r=-0.67,P<0.05).AI与Bcl-2(r=-0.28,P>0.05)、PI(r=-0.33,P>0.05)和Fas(r=0.31,P>0.05)均无相关性.结论:Fas和Bcl-2参与肝纤维化的发生过程中,二者在其中起着相反的作用,细胞凋亡在肝纤维化中明显低下,而细胞增生无明显变化,表明在肝纤维化中存在细胞凋亡和增生失衡.
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超声图预测肝硬化患者食管静脉曲张程度
目的:筛选有意义的超声检查指标,结合Child-Pugh分级对中度以上食管静脉曲张的肝硬化患者进行预测,探讨超声检查预测肝硬化患者食管静脉曲张程度的价值.方法:将所有病例按Child-Pugh评分分级,进行超声及胃镜检查,用Spearman等级相关分析筛选出与食管静脉曲张程度相关并且对其判断贡献较大的指标,建立Logistic回归方程.结果:食管静脉曲张程度与Child-Pugh分级呈正相关(r=0.39,P<0.01),Child-Pugh C级患者中度以上食管静脉曲张占93.3%.对Child-Pugh A级患者,判断食管静脉曲张程度贡献较大的指标是PUV,Logistic回归方程:P(A)=1/[1+e-(-0.405+1.686PUV)],其判断准确率为68.0%,敏感性为60.0%,特异性为78.3%.对Child-Pugh B级患者判断食管静脉曲张程度贡献较大的指标有PVD,PUV,GBBL和AS,Logistic回归方程:P(B)=1/[1+e-(-19.554+9.295AS-2.757PUV-4.278GBBL+1.288PVD)],其判断准确率为92.7%,敏感性为96.8%,特异性为80.0%.结论:Child-Pugh C级肝硬化患者绝大部分有中度以上的食管静脉曲张;以超声检查指标建立的回归方程对Child-Pugh A,B级患者中度以上的食管静脉曲张判断符合率较高,可以用于肝硬化患者食管静脉曲张程度的预测.
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应用SF-36生活质量对肠易激综合征进行疗效评价
目的:采用SF-36生活质量和临床症状综合评价不同疗法对肠易激综合征(IBS)患者的疗效.方法:2001-01/2002-01消化科门诊符合罗马Ⅱ标准的IBS患者172例,按排便习惯分为便秘为主型、腹泻为主型和腹泻便秘交替型,分别修稿一种方案治疗,疗程为8 wk.方案A:匹维溴胺(100mg,3次/d);方案B:匹维溴胺(100mg,3次/d)+多虑平(25 mg,晚服);方案C:安慰剂对照组.分别记录治疗前后患者SF-36生活质量评分和症状积分.结果:A方案症状显效率和总有效率分别为40.5%和73.0%;B方案分别为65.4%和88.5%;C方案分别为30.5%和47.9%.A,B方案总有效率均显著高于C方案(P=0.046和0.002),B方案与A,C方案显效率均有显著差异(P=0.045和0.015).A,B方案对生活质量的改善优于C方案,以B方案对各个纬度的生活质量改善为明显.B方案治疗后,躯体疼痛(BP)、总体健康(GH)、活力(VT)、社会功能(SF)和精神健康(MH)维度的积分有显著提高(P<0.05),且患者的生理功能(PF)、生理职能(RP)、总体健康(GH)、活力(VT)、情感职能(RE)和精神健康(MH)6个维度的生活质量甚至接近杭州市普通人群的生活质量(P>0.05).三种不同亚型患者症状总有效率、显效率均无显著的统计学差异(P>0.05).症状疗效和生活质量改善呈一定的相关性,但相关无统计学意义(P>0.05).结论:综合SF-36生活质量标准和症状疗效,可全面评价IBS疗效.联合匹维溴胺和抗抑郁药对改善患者的生活质量和IBS症状疗效佳.
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吻合器痔上黏膜钉合术治疗重度痔疮226例
目的:探讨吻合器痔上黏膜钉合术(PPH)治疗重度痔疮的临床疗效.方法:对226例Ⅲ,Ⅳ度痔疮患者行PPH术,比较患者术前,术后1,6,30 d和随访终点的疼痛、出血、坠胀和水肿情况.结果:226例患者的平均手术时间为9 min;术后1 d疼痛的发生率为20.5%、出血的发生率为5.7%;至术后30 d疼痛、出血情况明显改善;术后46.9±10.8 h出现首次排便;平均住院天数为4.4±1.2 d;恢复正常工作的平均时间8.0±1.7 d;术后并发症发生率低,以尿潴留(10%)和出血(5.7%)多见,但少见的并发症(感染、吻合口狭窄、腰背部酸痛等)也需引起重视;有2例严重的痔疮患者先后作了2次PPH术,术后恢复良好;随访了186例患者,平均随访时间为22.4±7.4 mo,随访率为89.6%(186/208),仅有4.5%的患者表现为少量的出血,其余均恢复良好,无复发.结论:吻合器痔上黏膜钉合术具有手术时间短,创伤小,恢复快,并发症少等优点,是治疗重度内痔的理想方法.
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乙型肝炎病毒新开放读码框架的确定及其意义
乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝部分双链DNA病毒,基因组长度只有3.2kb,结构基因与调节基因序列之间重叠,甚至结构基因序列之间重叠,因此HBV DNA序列的利用率之高实属罕见.1979年首次报告HBV DNA的全基因序列并确定4个主要的开放读码框架(ORF)之后,一直沿用至今.我们在中国流行株HBV基因序列的分析中,在前-Sl和X基因之前,分别发现了2段编码基因序列:前-前-S基因长度135 bp,编码产物为45 aa;前-X基因长度168 bp,编码产物为56aa.在前-前-S基因、前-X基因的上游存在启动子序列,具有指导报告基因表达的活性.对15例慢性乙型肝炎(CHB)患者基因型C型9例、B型1例、B/C混合型5例,共31个克隆测序结果,发现均存在前-前-S基因区.17例CHB患者A型1例、B型3例、C型10例、B/C混合型3例,共测序45个克隆,C型编码前-X区的克隆数占总编码克隆数的60肝,C型不能编码前-X区的原因主要是A2608→C/T替换突变或C/A2733→T替换突变单一突变;而B型、B/C型都不能编码前-X区蛋白,主要因为双突变的存在.在HBV基因组中发现前-前-S和前-X基因序列的存在改写了HBV DNA编码基因序列研究的历史.
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乙型肝炎病毒DNA聚合酶蛋白中RNase H研究进展
乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒的一种,HBVDNA的长度为3.2kb,具有4个开放读码框架(ORF),分别编码HBV的表面抗原蛋白、核心/e抗原蛋白,X蛋白以及HBV DNA聚合酶(HBV DNA P)[1].HBV DNA P基因在ORF中长,并且与C、S、X基因区有重叠,其编码的P蛋白含有3个功能域和1个无意义的隔离片(spacer),目前对聚合酶及其所编码的各个功能区域蛋白质的功能的认识虽然还不是很清楚,但已经取得了一定的进展.
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细胞色素CYPⅡE1与肝脏疾病关系的研究进展
在肝细胞微粒体内有1个氧化还原酶系统,由多种水解酶和结合酶组成.这个酶系统在生理情况下,可以促进生理活性物质的灭活和排泄,另一方面也可以促进药物代谢,所以又叫药酶.
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丙型肝炎病毒核心蛋白与白介素-2启动子的调节
丙型肝炎病毒(HCV)持续感染,增加了肝纤维化和肝细胞癌(HCC)的危险性,其机制与HCV引起机体免疫调节障碍有关.HCV基因表达产物中,高度保守的HCV核心(core)蛋白具有免疫调节功能.辅助性T细胞产生白介素(IL-2),HCV患者IL-2表达分泌异常,与痊愈有明显相关性.研究表明HCV核心蛋白具有转录激活IL-2启动子的作用,本文对此方面的研究作一综述.
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乙型和丙型肝炎病毒蛋白对胱冬肽酶基因表达的调节作用
细胞凋亡(apoptosis)又称细胞程序化死亡(programmedcell death,PCD),是细胞死亡形式之一,他以细胞DNA发生特异性的降解,形态上表现为核固缩、胞膜发泡和凋亡小体形成为特征.
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乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒蛋白对亮氨酸拉链蛋白LZIP的调节
乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌(HCC)的发生密切相关.虽然HBV、HCV感染与肝细胞癌之间的关系已经得到确定,但是具体的分子生物学机制还有许多工作要做.其中肝炎病毒编码蛋白对于肝细胞基因组表达的反式调节作用,即肝炎病毒蛋白与肝细胞基因组启动子DNA结合,对于肝细胞基因表达谱产生影响,从而调节肝细胞的生长、代谢、凋亡及恶性转化,在病毒感染致病机制中起着重要作用[1-5].人碱性亮氨酸拉链蛋白LZIP是碱性亮氨酸拉链蛋白家族重要成员之一,在肝炎病毒致肝细胞癌发生过程中发挥重要作用.
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乙型肝炎病毒对c-fos基因表达调节的影响
癌基因(oncogene)是一类编码关键性调控蛋白的正常细胞基因,在正常情况下,不表达或只有有限表达,又称原癌基因(proto-oncogene).当受到理化等因素刺激时,他们可以异常表达,导致细胞的增生、分化或癌变.
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富含脯氨酸的酪氨酸激酶-2与肝炎病毒关系的研究进展
富含脯氨酸的酪氨酸激酶-2(proline-rich tyrosine kinase2,Pyk-2)是一种属于局灶黏附激酶(FAK)家族的细胞质中的酪氨酸激酶[1-2].
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核因子κB的信号转导机制及研究策略
核因子кB(nuclear factor of кB,NF-кB)是一种广泛存在的转录因子,几乎每个真核细胞中都存在NF-κB,不同的刺激信号激活该转录因子后,参与相应的基因表达的调控,如细胞的生长、分化、凋亡、炎症反应、肿瘤发生等[1-2].由于其广泛的生物学活性,对NF-кB的研究为阐明某些疾病的发病机制及治疗具有重要的意义.
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乙型和丙型肝炎病毒对c-jun基因表达调节的影响
乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)不仅可引起急慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化和肝细胞癌(HCC)的发生及发展密切相关.HCC是严重危害人民健康的疾病之一,在对HCC的致病机制的探索中,原癌基因也成为研究的的重点.研究发现,HBV和HCV均能调节原癌基因c-jun的激活与表达,从而导致肝细胞异常增生、分化,进而引起肝细胞癌变.通过对肝炎病毒和癌基因c-jun之间关系的阐述,有助于我们掌握肝细胞癌变的分子机制.
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HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响
目的:研究HCBP6蛋白在细胞内表达时,是否通过蛋白-蛋白之间的相互作用,对HCV核心蛋白的反式激活作用产生影响.方法:利用常规的分子生物学技术分别构建HCBP6蛋白和丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的真核表达载体.酶联负疫黏附法enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CAT的表达水平,间接测定HCV核心蛋白对于SV40病毒即刻早期启动子的反式激活活性.结果:重组表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6、pcDNA3.1(-)-core经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.转染HepG2细胞之后,HCV核心蛋白的表达,对于SV40病毒即刻早期启动子的转录表达活性具有显著的反式激活作用.但是,当与HCBP6蛋白的表达载体进行共转染时,SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性受到抑制.重复试验得到了相似的结果.HCBP6蛋白的表达对于HCV反式激活SV40病毒即刻早期启动转录活性的抑制率40.4-62.3%.结论:HCBP6蛋白在细胞内的表达对HCV核心蛋白反式激活SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性具有显著的抑制作用.
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表达谱基因芯片技术研究甘草甜素上调白介素-18基因的表达
目的:了解甘草甜素调节白介素-18(IL-18)基因启动子的活性,为甘草甜素的作用机制提供理论依据.方法:应用基因表达谱芯片技术对于甘草甜素刺激HepG2细胞之后的基因表达谱进行研究.聚合酶链反应(PCR)扩增IL-18基因启动子,命名为IL-18P.以T-A克隆法,将IL-18P基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pT-IL-18P,与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnI和Bg1Ⅱ双酶切后构建IL-18启动子报告基因表达载体pCAT3-IL-18P,以重组表达质粒pCAT3-IL-18P瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,甘草甜素刺激后24 h后收获细胞.用酶联免疫黏附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性.结果:表达谱基因芯片研究结果表明,甘草甜素可上调IL-18基因表达水平达2.815倍.构建的报告载体pCAT3-IL-18P经过序列分析和酶切鉴定正确.pCAT3-IL-18P和甘草甜素瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是CAT3空载体的7.7倍,pCAT3-IL-18P的1.5倍.结论:甘草甜素可以上调IL-18启动子的活性,进而上调IL-18基因的表达.为深入了解甘草甜素的免疫调节作用及其在病毒的清除过程中的作用机制提供新的理论依据.
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应用酵母双杂交技术筛选肝细胞cDNA文库中乙型肝炎病毒前-X蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV基因组中的前-X基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBV的前-X基因,构建表达载体并在酵母细胞中表达,配合后选出在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落19个,其中5个是人铁蛋白;1个是人的胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3);1个是人醛缩酶B;1个是人糖基化磷脂酰肌醇锚定结合因子1(GPAAl);1个是人血红素结合蛋白;1个是人C1酯酶抑制子(C1-INH);1个是人玻连蛋白;1个是人电压依赖性阴离子通道1(VDACl);1个是丝氨酸穿膜蛋白酶(hepsin);1个是人梭素;1个是人纤溶酶原(PLG);3个是人假想蛋白;1个是RP11-542M13克隆,位于染色体16.结论:成功克隆出前-X的结合蛋白,为进一步研究HBV的前-X蛋白的作用提供了新线索.
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基因表达谱芯片技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式调节基因TAHCCP2的调节基因
目的:应用基因表达谱芯片技术了解TAHCCP2在肝细胞中可能上调或下调的基因,了解其可能的调节功能线索.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinfo-rmatics)技术筛选并克隆HCV核心蛋白反式激活的新型靶基因TAHCCP2.以TAHCCP2表达质粒pcDNA3.1(-)-TAHCCP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果:TAHCCP2表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP2经酶切鉴定和DNA测序鉴定正确.经基因表达谱芯片分析,4种基因的表达水平下调.结论:筛选到的一些与体内氧化应激、细胞生长和能量代谢相关的基因,推测了TAHCCP2可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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乙型肝炎病毒基因组前-前-S基因区的分子流行病学研究
目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组是否存在前-前-S编码基因,并探讨前-前-S基因与HBV基因型分布之间的关系.方法:自慢性乙型肝炎患者血清中提取病毒基因组DNA,首先应用多引物-多聚酶链反应(PCR)进行HBV基因型分型,之后将前-前-S区扩增,TA克隆到pGEM Teasy载体后进行单克隆测序,利用Vector 8.0软件进行序列分析.结果:选择15例患者,经过HBV基因型分型实验确定基因型为B型者1例,B/C混合型者5例,C型9例.自15例患者血清中提取的HBV基因组中扩增出前-前-S基因片段,TA克隆后选择31个克隆进行测序,测序结果证明这31个克隆均编码前-前-S基因.结论:前-前-S区编码在B、C基因型中均为普遍存在的现象.
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应用酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库与NS5ATP1结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与NSA5TP1结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP1基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS5ATP1基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落10个,其中2个人HLA-B27;2个人亚砷酸盐转移子(arsA);1个人单倍型E22i线粒体;1个人pyrin(MEFV);1个人肌动蛋白素1(cofilin 1);1个人染色体15;1个来自RP11-353N14克隆人的DNA基因,位于染色体17;1个新基因.结论:成功克隆出NS5ATP1的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因
目的:我们在以往的研究中,应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因.为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能,应用酵母双杂交技术,筛选并克隆人白细胞中与NS5ATP9蛋白相互作用蛋白的基因,进一步阐明NS5ATP9的生物学功能及其作用途径.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP9基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS5ATP9基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基上生长,又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上变蓝的真阳性菌落46个,其中含人类免疫球蛋白轻链13个,核小体表面蛋白10个,铁蛋白重链2个,人类重组免疫球蛋白λ轻链11个,14-3-3家族蛋白1个,脑膜炎球菌PorA蛋白1个,RNA多聚酶Ⅲ 3个,烟草有丝分裂原激活蛋白激酶1个,细胞色素P450Ⅱ2个,SLIT2蛋白1个,DNA依赖蛋白激酶催化亚基1个.结论:成功克隆出丙型肝炎病毒NS5ATP9蛋白的结合蛋白,为进一步研究NS5ATP9的生物学作用提供了新的线索.
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基因表达谱芯片技术筛选肝再生增强因子反式调节基因
目的:为了阐明人肝再生增强因子(augmenter of liverregeneration,ALR)的表达对于肝细胞基因表达谱的影响,我们应用基因芯片技术,对于转染和未转染的HepG2细胞进行了分析.方法:从HepG2细胞RNA中用反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)扩增出ALR编码区DNA,常规分子生物学技术构建ALR的真核表达载体pcDNA3.1(-)-ALR,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,ALR的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:经过限制性内切酶分析和序列测定,证实pcDNA3.1(-)-ALR构建正确.ALR在HepG2细胞中的表达以Westernblot杂交技术得到证实.对于ALR重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达谱,利用基因芯片技术进行分析.结果表明,2种基因的表达水平上调,24种基因的表达水平下调.这些基因包括淀粉酶α、肿瘤坏死因子受体、金属蛋白酶1组织抑制因子、性激素相关蛋白等基因,相信这些类型的基因在ALR所发挥的生物学效应起到重要的作用.结论:ALLR于肝细胞基因表达谱存在一定影响;基因芯片技术是分析蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径,有助于了解ALR对肝细胞和其他生物学功能的调节作用.
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乙、丙型肝炎病毒基因联合诊断芯片的研制及应用
目的:制备一款肝炎病毒检测芯片,能同时实现对乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、HBV YMDD变异株及HCV基因型的检测,并与其他检测方法进行比较,以探讨基因芯片技术临床应用的可行性.方法:根据HBV、HCV的序列设计出探针,采用点样法制备芯片.收集HBV DNA阳性和HCV RNA阳性血清各20份,YMDD变异株阳性血清20份,HBV DNA阴性和HCVRNA阴性血清各10份,用基因诊断芯片检测,并与荧光定量法、错配PCR及测序法比较.结果:HBV DNA阳性标本和HCV RNA阳性标本用芯片检测均为阳性;芯片法检测HBV YMDD变异株和错配PCR法的符合率为75%,和测序法的符合率为95%;芯片法检测HCV基因型和测序法的符合率为75%.结论:基因诊断芯片的敏感性和特异性较高,且能检测出不同病毒株的共生状态,但在检测HCV基因型方面存在一定的假阴性和假阳性.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因2基因组DNA结构分析及其不同剪切体的克隆化研究
目的:HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP2及其不同剪接体基因序列的确立、克隆化研究.方法:依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得,提取HepG2细胞的总RNA,进行反转录(RT-PCR),扩增产物与原核表达载体连接,进行测序鉴定.结果:经测序鉴定成功获得新基因的编码序列,并意外发现了NS5ATP2的不同剪接体,对NS5ATP2基因组进行分析,获得剪接体的编码序列,并成功进行了克隆化研究.结论:利用分子生物信息学技术,发现并鉴定了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP2(615)及其可变剪接体NS5ATP2(216),为研究新基因的生物学功能及丙肝发病机制提供新的依据.
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应用抑制性消减杂交技术筛选双环醇调节靶基因
目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybrid-ization,SSH)技术构建双环醇处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆双环醇调节相关基因,阐明双环醇对肝细胞调节作用的分子生物学机制.方法:以双环醇处理HepG2细胞,同时以二甲基硫氧化物(DMSO)处理的相同细胞系作为对照;24 h后制备细胞裂解液,提取muRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到46个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到2 0-1 000bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得14种已知基因序列.结论:应用SSH技术成功构建了双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明双环醇在体内的调节机制提供依据.
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乙型肝炎病毒E抗原结合蛋白E-19的猴同源基因的克隆化与序列分析
目的:乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对-HBV的感染和复制都不是必须的,普遍认为他与HBV引起免疫耐受,免疫系统功能障碍有关.应用酵母双杂交技术我们克隆了人肝细胞cDNA文库中与HBeAg相互作用蛋白的基因E-19,应用生物信息学技术克隆猴的E-19同源基因.方法:应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HBeAg基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,提取阳性菌落并测序,确定人E-19基因序列,利用生物信息学技术克隆猴的E-19同源基因,并进行编码产物的序列分析.结果:成功克隆出人的HBeAg结合蛋白新基因E-19.应用生物信息学技术,确定克隆了猴E-19同源基因,编码基因全长378 nt,编码产物由125 aa组成.结论:成功克隆出人的HBeAg的肝细胞结合蛋白E-19基因,并发现、确定了猴E-19的同源基因,为研究E-19基因的结构与功能、表达与调控、生物学意义以及在病毒性肝炎发病机制中的作用奠定了基础.
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重组人肝再生增强因子对小鼠CCl4中毒性肝损伤的治疗作用
目的:利用大肠杆菌的基因工程技术,制备重组的人肝再生增强因子(ALR)药物,对于CCl4肝损伤的小鼠模型进行治疗,评价重组的人肝再生增强因子在肝损伤治疗中的效果和价值.方法:应用大肠杆菌系统,表达、纯化重组人肝再生增强因子蛋白.利用四氯化碳法制备肝细胞损伤的动物模型,以重组的人肝再生增强因子药物进行治疗,以生理盐水治疗作为对照,比较治疗后血清ALT,AST水平的变化,评价重组的人肝再生增强因子对于肝损伤的治疗作用.结果:成功制备了重组的人肝再生增强因子药物,纯度在98%以上.成功制备了四氯化碳的小鼠肝损伤模型,经过重组的人肝再生增强因子药物治疗后,血清中ALT,AST水平都有显著的下降(ALT:991 U/L对2 134 U/L,P<0.01;AST:938 U/L对1873 U/L,P<0.01).结论:重组的人肝再生增强因子药物,有希望成为各种原因引起的肝细胞损伤的治疗药物.
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乙型肝炎病毒E抗原肝细胞结合蛋白E-18调节基因的表达谱芯片研究
目的:应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-E-18分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,筛选能被E-18反式调节的靶基因,研究未知功能的HBeAg结合蛋白E-18的生物学功能.方法:应用酵母双杂交技术和体外免疫共沉淀技术筛选并验证HBeAg的肝细胞结合蛋白基因,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增E-18蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-E-18.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:筛选出肝文库中HBeAg结合蛋白E-18的编码基因,构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 159个基因表达谱的筛选中,发现有52个基因有差异表达,其中36种基因表达水平显著下调,16种基因表达水平显著上调.结论:成功地应用DNA芯片技术筛选出HBeAg结合蛋白新基因E-18的反式调节蛋白,证明E-18基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.
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应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活基因1的反式调节基因
目的:筛选与克隆丙型肝炎病毒(HCV)NS3反式激活基因1的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin-formatics)技术筛选并克隆NS3TP1反式激活的新型靶基因.以NS3TP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人NS3TP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.随机挑选其中36个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得23种编码基因,其中3个为未知功能的新基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了NS3TP1可能存在的调控机制的线索.
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应用白细胞cDNA文库的酵母双杂交技术筛选HCTP4结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与HCTP4蛋白结合的蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCTP4基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HCTP4基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳糖(X-α-ga1)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落44个,其中25个免疫球蛋白λ轻链;6个来自RP11-189K21克隆的人DNA序列;4个来自RP11-507C10克隆的人DNA序列;2个人BAC克隆RPCI11-75L1;1个人BAC克隆RP11-21M10;1个人遍素酶智能弹(MIB);1个来自RP11-867O8克隆的人DNA基因;1个来自RP3-509I19克隆的人DNA序列;1个小核糖核蛋白G;1个UMP-CMP激酶;1个新基因.结论:成功克隆出HCTP4的结合蛋白,为进一步研究丙型肝炎病毒(HCV)的作用提供了新线索.
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应用抑制性消减杂交技术克隆HCV NS3蛋白反式激活基因2的上调基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV NS3蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HCV NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到61个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1 000bp插入片段.挑取30个插入片段测序分析,得到30个已知功能基因序列.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码因,推测了NS3TP2可能存在的调控机制的线索.
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慢性HBV感染者血清病毒动力学的检测及分析
目的:观察未抗病毒治疗的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者体内病毒载量的变化及其动力学特征.方法:采用荧光定量PCR方法对未进行抗病毒治疗的3例不同临床表型的慢性HBV感染者血清HBV载量进行连续监测,同时测定每一时相点的血清ALT和总胆红素.结果:不管是间隔1 d、1 wk还是1 mon,3例慢性HBV感染者体内HBV DNA水平均存在自发波动,且与血清ALT和总胆红素变化相关性不确定.结论:3例慢性感染者体内HBV载量的自然波动表现出一定的模式特征.我们提出一种宿主对病毒负反馈控制的PID模式,以期对持续性病毒感染的体内生态演化作出评价和预测.
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乙型肝炎病毒基因组前-X区的分子流行病学研究
目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组是否存在前-X编码基因,并探讨前-X基因与HBV基因型之间的关系.方法:自慢性乙型肝炎患者血清中提取乙型肝炎病毒基因组,首先应用多引物-多聚酶链反应(PCR)进行HBV基因型分型.之后将前-X区扩增,TA克隆到pGEM Teasy载体后进行单克隆测序,利用Vector 8.0软件进行序列分析.结果:17例患者中,A型者1例,B型3例,B/C混合型者3例,C型10例.克隆测序的45个克隆中,27个(60%)克隆编码前-X多肽,其中18个(66.7%)克隆来自C基因型.有3种形式突变导致前-X区编码不能.前-X区多肽具有个体化突变现象.结论:前-X区编码在B、C基因型中均为普遍存在的现象,其编码具有C型倾向性.
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血清类粘蛋白2下调乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ转录活性的研究
目的:探讨血清类粘蛋白2(ORM2)对乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(HBV-SP Ⅰ)转录的激活作用.方法:以我实验室前期得到的HBV-SP Ⅰ的酵母单杂交系统筛选结果为基础,利用生物信息学技术确定ORM2的基因编码区域,聚合酶链反应(PCR)扩增ORM2编码基因,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)-ORM2载体;将该质粒与SP Ⅰ的氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告载体pCAT3-SP Ⅰ共转染肝癌细胞系HepG2细胞系,并以pCAT3-SP Ⅰ单独转染HepG2细胞系作为对照,酶联免疫吸附法(ELISA)检测CAT的表达活性.结果:pCAT3-SP Ⅰ在HepG2细胞中能够启动CAT的表达;共转染实验中pCAT3-SPⅠ+pcDNA3.1(-)-ORM2组CAT的表达活性较pCAT3-SP Ⅰ下降了81.9%.结论:ORM2蛋白具有对HBV-SP Ⅰ的反式抑制作用.本实验验证了我室利用酵母单杂交技术筛选HBV-SP Ⅰ特异结合蛋白的结果,为进一步了解HBV-SP Ⅰ的转录调控机制及其与SPI结合的反式作用因子提供了新的线索.
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丙型肝炎病毒NS5A蛋白上调NS3TP6基因启动子表达活性的研究
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对NS3TP6启动子转录的激活作用.方法:以我实验室前期研究中得到的HCV NS5A/NS3的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定NS3TP6的启动子区域(NS3TP6-p),聚合酶链反应(PCR)扩增NS3TP6-p,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3-NS3TP6-p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫黏附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:限制性内切酶消化和序列分析结果表明,构建的NS3TP6-p指导的报告基因表达载体pCAT3-NS3TP6-p正确无误.pCAT3-NS3TP6-p在HepG2细胞中能够启动CAT的表达;共转染实验中pCAT3-NS3TP6-p+pcDNA3.1(-)-NS5A组CAT的表达活性是pCAT3-NS3TP6-p单独转染试验的1.87倍.结论:我室克隆的NS3TP6启动子有指导下游基因转录表达的活性;HCV的NS5A蛋白具有对NS3TP6基因启动子的转录具有反式激活作用.本实验进一步验证了我室利用基因表达谱技术研究HCV NS5A蛋白反式激活作用的结果,为进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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KAI1基因对MHCC97-H细胞裸鼠成瘤及转移的影响
目的:研究肿瘤转移抑制基因KAI1对MHCC97-H细胞裸鼠成瘤及转移的影响.方法:将已转染KAI1正、反义核苷酸的高转移潜能肝癌细胞MHCC97-H接种裸鼠皮下,观察皮下肿瘤生长情况,再将皮下肿瘤组织进行裸鼠原位肝接种,观察接种后肿瘤肺转移情况.其中,转染空载体及未转染的MHCC97-H亲本细胞作为实验对照组.结果:正义组、反义组、空载体组及亲本细胞组裸鼠皮下均成瘤,肿瘤出现的时间、肿瘤块生长的速度无明显差异,生长方式上反义组表现出明显的侵袭性.原位肝接种6 wk后裸鼠肺部均出现癌巢,AFP染色可见癌巢中肿瘤细胞质有黄色颗粒沉着,证实为肝癌转移至肺形成的转移灶.与MHCC97-H亲本细胞组比较,反义组转移灶数目明显增加(P=0.0 0158),正义组转移灶数目明显减少(P=0.00465),差异均有显著性,而载体组转移灶数目无明显变化(P=0.15166).结论:肿瘤转移抑制基因KAI1对MHCC97-H细胞裸鼠成瘤性及肿瘤生长无明显影响,但上调KAI1蛋白的表达水平能在一定程度上降低肿瘤的侵袭性、抑制转移的发生.这为肝癌的抗转移治疗研究提供了重要线索.
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肝癌组织HSP70和caspase 3的表达意义
目的:研究热休克蛋白70和caspase 3在肝细胞癌及癌旁肝组织中的表达及其临床意义.方法:利用免疫组织化学检测70例肝细胞癌及其癌旁肝组织HSP70和caspase 3蛋白的表达.结果:HCC中HSP70的阳性率和阳性强度明显高于癌旁肝组织(68.6%vs 31.4%,P<0.01),而caspase3蛋白的阳性率和阳性强度明显低于癌旁肝组织(17.1%vs35.7%,P<0.01).在HCC中HSP70和caspase3蛋白的表达强度与HCC的分化程度和肿瘤的大小明显相关,分化愈差和肿瘤愈大HSP70表达愈强(分别为:F=5.219和5.421,P均<0.01)而caspase3蛋白表达愈弱(分别为F=5.944和4.571,P均<0.01).统计学分析显示在HCC及其癌旁肝组织中HSP70和caspase 3蛋白的表达呈明显负相关(分别为:r=-0.4126和-0.5237,P均<0.01).结论:本文结果提示在HCC发生过程中HSP70的表达可能通过促进细胞的转化和增生及抑制细胞的凋亡,使HCC呈现无限制的生长及恶性程度不断增高;检测HSP70有望能成为判断HCC预后的重要指标之一.
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肝癌患者树突状细胞融合肝癌细胞体外诱导特异性抗肝癌免疫
目的:探讨肝癌(HCC)患者树突状细胞(DC)融合HCC细胞体外诱导同源T淋巴细胞产生特异性抗HCC免疫的效能.方法:应用人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和白介素-4(rhIL-4)对肝癌患者外周血单个核细胞进行体外诱导产生树突状细胞,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平,聚乙二醇融合DC与肝癌细胞HepG2,MTT法测定融合细胞(HepG2/DC)刺激同源T淋巴细胞增生、分化能力,细胞毒性试验检测HepG2/DC诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对HepG2的特异性杀伤作用.结果:体外培养1 wk后的DC高度表达CDh,HLA-DR,CD54,CD80和CD86,融合细胞HepG2/DC刺激同源T淋巴细胞增值能力显著高于HepG2,HepG2+DC,DC及PBS,A值分别为0.816±0.019,0.541±0.020,0.632±0.018,0.564±0.018,0.345±0.013(P<0.05),HepG2/DC活化的CTL对HepG2具有明显的特异性杀伤作用.结论:HCC患者外周血DC融合HCC细胞可有效诱导同源T淋巴细胞产生特异性抗HCC免疫,可望成为一条HCC免疫治疗的有效途径.
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胃癌相关基因GCRG224的克隆及其在大肠杆菌中的表达
目的:利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG224.方法:采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG224 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102/D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.结果:高效表达出相对分子量约16 800的重组融合蛋白.薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的22.3%.结论:在大肠杆菌中成功表达了GCRG224重组融合蛋白.
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胃癌候选抑癌基因Syk表达的意义
目的:探索酪氨酸激酶Syk(spleen tyrosine kinase,Syk)基因的表达与胃癌生成及转移的关系.方法:用半定量RT-PCR检测胃癌组织、正常胃组织61例Syk mRNA,p53的表达,同时用免疫组化方法检测Syk的表达.结果:所有正常胃组织都有Syk基因的表达,而61例胃癌组织中只有14例表达,正常胃组织Syk基因表达率显著高于胃癌组织(x2=72.3,P<0.05),且胃癌组织中SykmRNA含量比正常胃组织显著降低(t=2.1,P<0.05).31例有淋巴结转移的胃癌组织中,3例有Syk基因表达,30例无淋巴结转移的胃癌中有11例检测到Syk mRNA的表达,有淋巴结转移的胃癌Syk mRNA的表达率和表达水平显著降低(x2=4.85,P<0.05),且Syk mRNA表达与p53的表达呈正相关(x2=22.03,P<0.05).结论:Syk基因的表达缺失与胃癌的生长及转移相关,呈p53依赖性.
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胃癌变前后凋亡相关蛋白和PCNA的表达
目的:探讨凋亡相关基因p53,Bcl-2和增生细胞核抗原(PCNA)在胃癌发生中的作用以及在胃癌早期诊断中的意义.方法:采用免疫组化(LSAB)方法检测52例胃癌癌变前后组织标本的p53,Bcl-2和PCNA的表达.结果:肠上皮化生、不典型增生和胃癌的p53蛋白表达分别为27.8%,38.2%和57.7%;Bcl-2蛋白表达分别为33.3%,50.0%和65.4%;PCNALI分别为41.4±13.0,47.9±8.9和53.0±11.9.在肠型胃癌,癌前p53,Bcl-2阳性者发展到癌时仍全为阳性,无1例转阴性;在弥漫型胃癌,癌前Bcl-2阳性者到癌时有1例转阴;PCNA LI由癌前发展到癌时明显增高,在肠型胃癌差异有显著性(P<0.001).结论:在肠型胃癌发生发展过程中,p53,Bcl-2蛋白表达起重要作用,且细胞增生活性逐渐升高.
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致谢世界华人消化杂志审稿人