胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤21例

目的:总结胃黏膜相关淋巴瘤的临床特点,提高诊治水平.方法:回顾性分析21例胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤病例资料.结果:在本组病例中,18例以腹痛、食欲不振为主要症状,2例以出血为首发症状,另1例主要表现为腹胀、消瘦.病理分期(Arbor标准)ⅠE期11例,ⅡE期4例,ⅢE期4例,ⅣE期2例.其中15例行手术治疗,术后均行抗Hp治疗及化疗,5 a生存率为86.7%,4例未进行手术及化疗及2例行单纯化疗的患者均于3 a内死亡.结论:对胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的早期诊断、手术切除胃原发病灶加抗Hp治疗是提高胃黏膜相关淋巴瘤生存率的关键.

PD98059对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增生的影响

目的:探讨特异性MEK1阻断剂PD98059对乙醛刺激的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增生及其细胞增生核抗原表达的影响.方法:用PD98059对乙醛刺激的HSC进行处理,分别以MTT比色、免疫细胞化学法检测细胞增生及其细胞增生核抗原表达.结果:PD98059在20μm0l/L时即对HSC增生出现抑制作用(P＜0.05,C组0.109±.020 vs B组0.146±0.030),50、100 μm0l/L时抑制作用逐渐增强(P＜0.05,D、E组0.081±0.010、0.056±0.020 vs B组0.146±0.030);HSC中PCNA表达也随PD98059剂量增加而减弱(P＜0.05,C、D、E组0.62±0.09、0.47±0.04、0.34±0.04 vs B组0.74±0.05)结论:PD98059对HSC增生及细胞增生核抗原表达具有抑制作用,提示Erk信号传导通路是调控肝星状细胞增生的重要通道.

多粘菌素B及其模拟肽体外抗内毒素的实验研究

目的:观察PMB及其模拟肽处理前后FITC-LPS与PMBC的结合能力及培养上清中IL-6、TNF α的含量变化.方法:LPS(或FITC-LPS)100μg/L分别与PMB100 mg/L、peptide 0 100 mg/L、peptide 1 100 mg/L、PBS,37℃孵育30 min后(分别加入50 mL/L NHS)刺激PBMC,用流式细胞仪检测FITC-LPS与PBMC的结合能力及CD14表达;ELISA法检测培养上清中细胞因子TNF α、IL-6含量.结果:FITC-LPS分别与PMB、peptidel孵育后,细胞膜平均通道荧光显著减少,LPS与PBMC的结合能力显著降低(分别为8.1±1.8 vs 15.8±4.5 P＜0.01;8.5±2.0vs15.8±4.5 P＜0.01).100μg/L LPS刺激PBMC3h后CD14阳性率明显增加;LPS分别与PMB和peptidel预孵育后可显著降低LPS刺激PBMC细胞膜CD14表达(分别为45.5±6.2%vs68±5.5%P＜0.01;43.2±4.1%vs68±5.5%P＜0.01).LPS刺激PBMC分泌TNF-α和IL-6显著增加,LPS分别与PMB和peptidel预孵育后能显著减少细胞因子TNF-α(分别为15.30±1.0vs45.9±5.7 P＜0.01;18.2±0.9vs45.9±5.7P＜0.01)和IL-6分泌(分别为50.5±4.2 vs176.4±12.1 P＜0.01;58.1±4.1 vs176.4±12.1 P＜0.01).结论:多粘菌素B及其模拟肽(Peptidel)可能通过下调PBMC CD14表达,降低细胞因子水平来减少LPS诱导的炎症反应.

肝硬化大鼠肝部分切除后肝细胞生长周期的调控

目的:本实验通过检测肝硬变大鼠肝部分切除术动物模型肝组织内细胞周期蛋白(Cyclin)A、B和D的表达以及癌基因调节蛋白的变化,研究Cyclin及其癌基因调节蛋白在肝细胞再生中的作用.方法:采用CCL4制作大鼠肝硬模型,切除大鼠肝脏的左叶和中叶.采用免疫组化和原位杂交的方法,观察大鼠肝脏Cyclin A和Cyclin D及相关因子变化.结果:术后肝细胞Cyclin A和D mRNA的表达和分布基本相似,主要在胞质和胞核内.在中央静脉等静脉血管的周围,其阳性表达量高且表达出现时间早,在术后6 h已有明显的表达出现.在肝细胞再生过程中,Cyclin A和DmRNA的表达明显,呈局灶样分布.Cyclin B和Rb蛋白主要分布在细胞核和胞质内,在术后6-24 h,Cyclin B和Rb在肝细胞有较强的阳性表达.P27的表达在术后24 h开始出现,术后1 wk点显著,RB蛋白也呈现较强的阳性表达.结论:肝细胞再生机制可能是通过多种途径共同作用的结果.

肥大细胞在胃嗜酸性肉芽肿发病中的作用

目的:探讨肥大细胞在胃嗜酸性肉芽肿发病中的作用.方法:应用免疫组化SP染色检测胃嗜酸性肉芽肿中的肥大细胞及微血管密度;HE染色计数嗜酸细胞;电镜观察肥大细胞J脱颗粒情况.结果:肥大细胞数量在胃溃疡和胃嗜酸性肉芽肿中差别无显著性(9.1±3.0 vs 8.9±3.0,P＞0.05);脱颗粒肥大细胞数量及比例在胃嗜酸性肉芽肿组明显高于胃溃疡组(73±2.4vs 4.3±1.4、80.3±15.7%vs 48.4±15.7%,P＜0.01);肥大细胞高计数组微血管密度高于肥大细胞低计数组(57.3±10.7 vs 32.4±7.2,P＜0.01);脱颗粒肥大细胞与嗜酸细胞具有正相关性(r=0.931,P＜0.01).结论:肥大细胞在胃嗜酸性肉芽肿中可促进嗜酸细胞浸润及血管新生,可能在胃嗜酸性肉芽肿发病中起重要的作用.

卡托普利对肝纤维化模型鼠MMP-2,3 TIMP-2,3表达的影响

目的:探讨卡托普利抗大鼠肝纤维化的作用及对MMP-2,MMP-3,TIMP-2,TIMP-3的表达影响.方法:Wistar大鼠40只随机分为正常对照组,实验对照组A、B,卡托普利预防组、治疗组,采用混合损害因素构建肝纤维化模型.行HE和VG染色,判断炎症和肝纤维化程度.免疫细化检测MMP-2,MMP-3,TIMP-2,TIMP-3的表达.结果:实验对照组A平均肝纤维化积分值为2.17±0.75、卡托普利预防组为1.33±0.52;实验对照组B为2.86±0.69、卡托普利治疗组为1.67±0.82,二者比较均P＜0.05.实验对照组A、卡托普利预防组的MMP-2阳性反应面积比分别为8.20±0.24%,4.43±0.25%,实验对照组B、治疗组分别为5.67±0.32%,3.21±0.16%,二者比较均P＜0.01;实验对照组A、卡托普利预防组MMP-3阳性反应面积比分别为1.54±0.36%,4.25±0.37%,实验对照组B、治疗组分别为3.69±0.27%,10.75±1.69%,二者比较均P＜0.01;实验对照组A、卡托普利预防组TIMP-2阳性反应面积比分别为3.61±0.46%,2.16±0.17%,实验对照组B、治疗组分别为6.68±0.52%,7.87±0.59%,二者比较均P＜0.01;实验对照组A、卡托普利预防组TIMP-3阳性反应面积比分别为4.13±0.29%,3.06±0.28%,实验对照组B、治宁组分别为8.54±0.45%,5.35±0.34%,二者比较均P＜0.01.结论:卡托普利可抑制MMP-2,TIMP-3蛋白表达,增强MMP-3蛋白表达,可能是其抗纤维化作用的机制之一.

肝细胞生成素核受体的确定及特性

目的:肝细胞生成素(HPO)特异性刺激肝细胞增生的信号转导存在特异性核受体信号转导途径.方法:利用125I标记的HPO,通过受体结合和特异性竞争抑制实验及Scatchard分析原代培养大鼠肝细胞和肝癌细胞核抽提物中核受体.结果:原代培养大鼠肝细胞和肝癌细胞核抽提物中存在核受体,核受体数量分别为1.7×109/g、和5.0×109/g,平衡解离常数(Kd)分别为35 pmol及1 2 pmol,且存在数量上和亲和力的差异,此结合不能被EGF、生长激素和甲状腺激素所竞争抑制.HepG2细胞放射自显影显示HPO核受体的存在.结论:HPO促肝细胞增生作用可以通过肝细胞核受体介导.

大鼠急性酒精性脂肪肝造模方法的改进

目的:为酒精性脂肪肝的研究提供有价值的模型.方法:采用高浓度酒每日灌胃,同时改进饲料配方,增加食物中脂肪含量、增加铁剂的方法.结果:造模2 wk后可见肝脏轻微脂肪沉积,3 wk后呈中度脂肪肝,4 wk后为重度脂肪肝病变;与对照组相比,肝指数明显增大(模型组4.9±1.1;对照组4.0±0.6,P＜0.05),具有统计学意义.结论:本造模方法与人类酒精性脂肪肝病变类似,方法简单易行、实验周期短,结论明确,一般实验室均可进行.

大肠癌组织胸苷磷酸化酶/血小板衍生内皮细胞生长因子的表达及意义

目的:探讨胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)/血小板衍生内皮细胞生长因子(platelet-derived endothelialcell growth factor,PD-ECGF)和微血管密度(microvesseldensity,MVD)与大肠癌临床病理特征的关系.方法:应用免疫组化SP法,检测50例大肠癌组织中胸苷磷酸化酶/即血小板衍生内皮细胞生长因子蛋白表达及微血管密度,分析TP/PD-ECGF和MVD及其与大肠癌临床病理因素及预后的关系.结果:TP/PD-ECGF表达强度和MVD与大肠癌的肿块大小、Dukes分期、淋巴结转移、浸润深度密切相关(P＜0.01);而与肿瘤分化无关(P＞0.05).MVD与TP/PD-ECGF表达二者呈正相关(r=0.72).结论:TP/PD-ECGF与大肠癌血管生成密切相关,对大肠癌的生长与浸润转移起促进作用.TP/PD-ECGF与MVD可作为反映大肠癌生物学行为的指标,同时也是判断预后和指导辅助治疗的有效指标.

苦参碱对大鼠原位肝移植冷缺血再灌注中肝窦内皮细胞损伤的影响

目的:探讨苦参碱对大鼠原位肝移植冷缺血再灌注中肝窦内皮细胞损伤的保护作用及其机制方法:本实验采用大鼠原位肝移植模型,供肝保存5 h,224只大鼠随机分为对照组、小剂量治疗组、大剂量治疗组和假手术组,分别检测移植术后1、2、4 h血透明质酸(hylluronic acid,HA)及肝组织细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的含量,并观察肝血窦内皮细胞形态学、肝功能及各组大鼠术后1 wk生存率的改变.结果:与对照组比较,两治疗组术后各时点的透明质酸和细胞间黏附分子-1表达均显著降低,肝血窦内皮细胞形态也发生改善,且两治疗组大鼠术后肝功能和1 wk生存率显著提高,而两治疗组间各指标比较均无显著差异.结论:苦参碱对大鼠原位肝移植冷缺血再灌注中肝血窦内皮细胞损伤具有保护作用.

雌二醇对肝纤维化大鼠Ⅰ,Ⅲ型胶原及TGFβ1表达的影响

目的:观察雌二醇对肝纤维化大鼠肝脏胶原沉积和转化生长因子β1(TGF β1)表达的影响,研究雌激素对肝纤维化形成的抑制作用,并探讨其可能的机制.方法:设立模型组、治疗对照组、雌二醇组和正常对照组,以四氯化碳复合因素诱导大鼠肝纤维化动物模型,雌二醇组在四氯化碳应用的同时皮下注射苯甲酸雌二醇1 mg/kg,2次/wk,共8 wk.大鼠肝脏HE染色与Masson染色,分级观察肝组织的炎性坏死与胶原纤维沉积变化,并观察对大鼠肝纤维化形成过程中肝脏表达Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白及对TGF β1的影响.结果:与正常对照组比较,四氯化碳模型大鼠出现典型的肝纤维化表现,肝脏胶原纤维间隔广泛形成,肝小叶与肝窦内胶原增生沉积明显,Ⅰ,Ⅲ型胶原(0.58±0.26vs 6.34±2.24,1.07±0.49 ys 5.28±1.28,P值均＜0.001)及TGF β1基因表达明显增多;雌二醇应用可以明显减轻肝脏内胶原纤维增生沉积(P＜0.05),抑制肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白(2.47±0.76 vs 6.34±2.24,3.02±1.20 vs5.28±1.28,P值均＜0.05)及TGF β1的合成表达.结论:雌二醇可抑制肝纤维化大鼠肝脏Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白及TGF β1的合成表达,发挥对肝纤维化的抑制作用.

牛磺酸脱氧胆酸损伤线粒体诱导HepG2细胞凋亡

目的:探讨牛磺酸脱氧胆酸(TDCA)诱导HepG2细胞凋亡的分子机制.方法:应用HE染色、电镜和DNA电泳对细胞凋亡定性;应用流式细胞仪对细胞凋亡定量;检测TDCA诱导HepG2细胞凋亡过程中,线粒体细胞色素C释放及凋亡特异性蛋白酶Caspase-3、8、9活性的变化.结果:TDCA 400μmol/L孵育12 h可诱导显著HepG2细胞凋亡,凋亡率为50.4±2.20%;TDCA诱导HepG2细胞凋亡过程中,线粒体细胞色素C释放呈时间依赖性增加,同时伴有Caspase-9,3蛋白酶活性显著增高,Caspase-8活性仅轻度增高.结论:启动线粒体细胞色素C释放及随后激活Caspase-9途径,可能是TDCA诱导HepG2细胞凋亡的主要机制.

垂体后叶素和特利加压素降低门胆汁性肝硬化大鼠门静脉高压对肝组织氧分压的影响

目的:探讨垂体后叶素和特利加压素降低肝硬化门脉高压时对肝组织氧分压的不同影响.方法:采用胆总管结扎法制作胆汁性肝硬化模型,40只大鼠随机分成2组:垂体后叶素组(n1=20),特利加压素组(n2=20),两组分别从门静脉缓慢注入垂体后叶素和特利加压素,连续观察用药前及用药后5,10,15,20,25,30 min的门静脉压及肝组织氧分压.结果:两组用药后门静脉压均明显降低,两组间无显著差异(t=0.39 P＞.05);垂体后叶素组用药后肝组织氧分压明显下降,特利加压素组无明显下降,两组间有显著差异(t=9.19P＜0.01).结论:垂体后叶素降低门静脉压时肝组织氧分压明显下降,而特利加压素在降低门静脉压时肝组织氧分压无明显降低,是治疗急性食管、胃静脉曲张破裂出血较理想的药物.

犬肝动脉输注阿霉素联合血液灌流的研究

目的:采用阿霉素肝动脉输注与血液灌流二者联合应用,以NK107树脂,日本活性炭作为黏附剂,观察杂种犬外周循环血液中阿霉素浓度及其副作用.方法:采用杂种犬肝动脉输注阿霉素,同时杂种犬股动、静脉插管以NK107树脂(灌流组Ⅰ),日本活性炭(灌流组Ⅱ)作为黏附剂进行血液灌流,测定血中阿霉素浓度,观察外周血象、心肌酶、肝、肾功能.结果:灌流组Ⅰ,Ⅱ在灌流1 h,2 h;3 d,14 d血浆阿霉素浓度(89±9,60±15,21±5,10±2;99±14,61±13,26±5,12±2mg@L-1)明显低于对照组(312±23,237±12,116±15,58±8 mg@L-1)(P＜0.01)时;心肌酶(LDH,CPK-MB,α-HBDH)在灌流24 h(0.9±0.4,11.9±6.4,1.0±0.3;1.1±0.3,4.3±3.7,1.9±0.6 μkat@L-1),72 h(0.9±0.4,8.2±4.5,0.8±0.3;1.1±0.1,2.6±2.3,2.7±2.3 μkat@L-1)无显著性变化(P＞.05),而对照组24 h(1.6±0.2,23.9±12.9,2.7±0.3 μkat@L-1)后高于灌流前(P＜0.05),72h (3.1±0.1,33.7±10.4,8.5±0.3 μkat@L-1)后明显高于灌流前0.8±0.1,11.1±10.7,1.4±0.1 μkat@L-1)(P＜0.01).外周血白细胞(WBC),血小板(Pt),红细胞(RBC),血红蛋白(Hb)灌流后3,7,14 d灌流组无明显变化(P＞0.05),而对照组在第7天(8.5±5.4×109/L,77±35×109/L,4.8±1.2×1012/L,94±27 g/L)低于灌流前(16.3±4.2×109/L,131±38×109/L,5.9±1.6×1012/L,131±28 g/L)(P＜0.05),14 d(6.2±4.4×109/L,69±39×109/L,5.2±1.6×1012L,109±28g/L)明显低于灌流前P＜0.01).肝,肾功能在灌流前,灌流后无显著变化(P＞0.05).结论:以NK107树脂,日本活性炭作为黏附剂,肝动脉输注阿霉素与血液灌流二者联合应用能够减低外周血阿霉素浓度,降低其副作用.

电泳法检测肝和血清中醇脱氢酶同工酶

目的:建立琼脂糖凝胶电泳法检测人血清醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase isoenzymes ADH EC 1.1.1.1)同工酶.方法:采用自制琼脂糖凝胶板,摸索实验条件,在pH 8.6,74 mmol/L巴比妥电泳缓冲系统中进行20 mA、20 min电泳,可清晰地分离出ADH同工酶三条区带.结果:检测了67例患者血清ADH总活性0.013-0.021 Kat/L,同工酶ADH Ⅰ占ADH总活性0.01-0.30,ADHⅡ占ADH总活性0.12-0.31,ADHⅢ占ADH总活性0.39-0.80.检测了10例人健康肝组织匀浆的ADH总活性为0.136-0.196Kat/L,同工酶ADH Ⅰ占总活性的0.07-0.25,同工酶ADHⅡ占总活性的0.19-0.27和同工酶ADHⅢ占总活性的0.56-0.73.结论:正常人血清中ADH酶活性很低,为0-1.8×10-3 Kat/L,其同工酶不易被检测出.而肝脏组织中含有大量ADH酶活性,当肝脏受到严重损伤时,ADH即从肝细胞内逸出,进入血液,使血清中ADH酶活性明显升高,同时通过琼脂糖电泳对其同工酶的检测可测出三条区带,帮助临床进一步了解肝细胞损伤程度,对患者预后和病程的监测具有一定的临床意义.

丁酸钠联合穿琥宁对人大肠癌细胞HCT-8增生的影响

目的:探讨丁酸钠、穿琥宁体外联合应用对结肠癌细胞的影响.方法:应用生长曲线、MTT、流式细胞仪、电镜研究丁酸钠、穿琥宁对HCT-8的增生抑制及诱导凋亡作用.结果:丁酸钠对HCT-8细胞有明显抑制作用,48 h后各组抑制率分别为15.7%,20.3%,33.3%(P＜0.01),呈现浓度、时间依赖性.电镜下观察可见成熟分化改变及凋亡细胞,流式细胞仪可检测到亚G1峰,细胞周期分析发现其主要阻滞在G1期.穿琥宁与其联合应用,混合组1在24 h,48h凋亡率为23.5%,48.6%,混合组2在2 4h,48 h凋亡率为30.8%,54.2%(P＜0.01).结论:丁酸钠抑制HCT-8细胞增生,并诱导其成熟分化、凋亡.穿琥宁与其合用使凋亡率增加.

中国人金属基质蛋白酶组织抑制因子-1基因的克隆与表达

目的:克隆和表达中国人金属基质蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1;ⅡMP-1)基因,获得具有抗原性的人TIMP-1蛋白.方法:用RT-nest-PCR扩增TIMP-1编码区基因片段,用基因重组技术构建含该片段的重组质粒并进行序列分析.在大肠杆菌E.coli中表达融合蛋白MBP-TIMP-1,用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行分析鉴定,并用亲和层析试剂盒纯化融合蛋白MBP-TIMP-1.结果:经核苷酸序列分析表明,本研究克隆的中国人TIMP-1为624bp,与报道的国外TIMP-1基因序列同源.经SDS-PAGE和Western blot表明,表达的融合蛋白MBP-TIMP-1分子质量为66Ku,具有TIMP-1的抗原性,并可进行亲和层析纯化.结论:克隆了中国人TIMP-1基因,表达和纯化了具有免疫原性的融合蛋白MBP-TIMP-1,他将对肝纤维化的诊断有一定作用.

肝硬化患者血浆胃动素、胆囊收缩素、生长抑素及其胃电的改变

目的:通过测定肝硬化患者血浆胃动素(MTL)、胆囊收缩素(CCK)、生长抑素(SS)及其胃电的变化,探讨肝硬化患者胃肠功能障碍的主要机制.方法:应用放免法分别测定38例肝硬化患者和30名健康志愿者空腹血浆MTL、CCK及SS4浓度.采用美国3CPM胃电图仪观察所有入选者水负荷试验前后胃肌电活动情况,观察指标包括频率百分比、主频、餐后和餐前功率比以及运行性频谱分析.结果:肝硬化患者MTL,CCK水平较对照组明显升高(287±81 ng/L,3.3±1.4 ng/L vs131±27 ng/L,1.1±0.5 ng/L;P＜0.01,t=11.150,n=38;P＜0.01,t=9.146,n=38),且不同肝功能状态时MTL、CCK水平之间差异显著(P＜0.05,F=87.570;P＜0.05,F=47.506),呈现Child-Pugh C级＞B级＞A级的趋势.血浆SS水平在Child-PughB级和C级患者明显升高,与对照组差异显著(67±10 ng/L vs 28±13 ng/L;P＜0.01,t=7.652,n=16;P＜0.01,t=9.428,n=12),而在Child-Pugh A级患者升高不明显.同时,Child-Pugh B级,C级患者胃电节律紊乱率明显高于对照组(P＜0.01,t=-8.088,n=16;P＜0.01,t=7.697,n=16;P＜0.01,t=-10.178,n=12;P＜0.01,t=9.817,n=12),主频(P＜0.01,t=-7.575,n=16;P＜0.01,t=-11.623,n=12)、餐后和餐前功率比(P＜0.01,t=-3.987,n=16;P＜0.01,t=-4.330,n=12)低于对照组,差异显著.结论:肝硬化患者胃电节律紊乱百分比较正常人明显升高.胃肠激素的变化是肝硬化患者胃运动功能障碍的重要原因之一.

汉防己甲素抑制肝癌细胞增生的作用

目的:研究汉防己甲素(tetrandrine,TTD)对肝癌细胞的作用及其机制.方法:采用MTT比色法观察了TTD对肝癌细胞增生的影响;采用流式细胞仪法观察了TTD对肝癌细胞内活性氧的影响;采用琼脂凝胶电泳法观察了DNA片断化的梯形条带.结果:10 and 20 μmol/L TTD作用于肝癌细胞系24,48,72 h后其增生率分别为90.1±1.0%and 77.5±2.0%,70.2±2.9%and 56.6±1.6%,61.6±2.0%and 47.2±1.9%(F=40.025,P＜0.001);0、10和20μmol/L TTD作用于肝癌细胞系2 h后O2-为35%、36.6%、63.2%;H2O2.为24.5%、40.5%、84.6%.48 h后20 umol/LTTD组肝癌细胞出现典型的凋亡表现.结论:TTD能够通过诱导肝癌细胞内活性氧的产生,而引起细胞凋亡,呈明显的剂量依赖性.

抗栓灵含片治疗伴有血小板活化的难治性溃疡性结肠炎

目的:研究抗栓灵含片治疗伴有血小板活化的难治性溃疡性结肠炎(UC)的疗效和机制.方法:常规应用激素和/或柳氮磺吡啶(SASP)治疗1 mo以上无效或恶化的UC患者18例(男8例,女10例,平均年龄32.4岁),加用抗栓灵含片,2片(相当于2 400 U低分子肝素钠)含化,2次/d,观察大便次数、便血情况、自觉症状、肠黏膜肠镜下和组织病理学改变,并在治疗前和治疗后4 wk用流式细胞仪测定血液中黏附分子P选择素(CD62p),溶酶体膜糖蛋白(CD63),血液和组织中细胞间黏附分子(CD54),多药耐药基因(MDR)产物P-糖蛋白170(Pgp-170),用放射免疫法测定血栓素A2代谢产物TXB2含量,用血小板黏附仪测定血小板黏附率.结果:应用抗栓灵含片治疗后,与治疗前相比,大便次数(1.6 vs 8.2次/d)、便血情况(范围0-3,0.3 vs 2.7分)、肠镜下情况(范围0-3,1.1 vs 2.6分)、病理组织学观察(范围0-15,5.0 vs 12.0分)、自觉症状(范围0-5,0.7 vs3.9分)均明显改善或缓解(P＜0.05).CD62p(4.1±1.8% vs8.0±3.1%,),CD63(3.2±1.6% vs 6.3±2.1%),TXA2(390±67ng/L vs548±85ng/L),血小板黏附率(34.8±8.1%vs 43.2±10.7%),体外血栓形成长度(1.8±0.3 cm vs2.3±0.6cm),血液中CD54(14.4±5.1% vs 26.9±6.9%),组织中CD54(23.1±4.1% vs 51.1±6.2%),血液中多药抗性基因(MDR)产物P-糖蛋白170(Pgp-170)(10.4±2.7%vs 18.9±3.9%),组织中Pgp-170(10.2±2.3%vs 16.5±3.2%)明显下降(P＜0.01或0.05).结论:抗栓灵含片治疗伴有血小板活化的难治性溃疡性结肠炎有效,可抑制血小板活化和高凝状态,减轻炎症,抑制多药耐药基因表达.

奥沙拉秦钠治疗慢性反复发作型溃疡性结肠炎随机对照研究

目的:研究国产奥沙拉秦钠治疗慢性反复发作型溃疡性结肠炎(UC)患者的疗效及其安全性.方法:应用奥沙拉秦钠治疗21例活动期UC患者,并与柳氮磺吡啶(SASP)治疗组21例作随机对照研究,观察两组临床总疗效,临床症状缓解情况,肠镜缓解情况,组织学缓解情况,复发情况及不良反应.结果:临床总疗效:奥沙拉秦钠(完全缓解16例,有效4例,无效1例)显著优于SASP(完全缓解10例,有效4例,无效7例,P＜0.05).临床症状缓解情况:奥沙拉秦钠(完全缓解15例,部分缓解5例,无效1例)显著优于SASP(完全缓解10例,部分缓解5例,无效6例,P＜0.05).肠镜缓解情况:奥沙拉秦钠(完全缓解11例,部分缓解9例,无效1例)显著优于SASP(完全缓解7例,部分缓解8例,无效6例,P＜0.05).组织学缓解青况:奥沙拉秦钠(完全缓解13例,部分缓解7例,无效1例)显著优于SASP(完全缓解6例,部分缓解10例,无效5例,P＜0.05).胃肠道反应情况:奥沙拉秦钠组上腹部不适、烧心、恶心等反应例数少于SASP组,水样大便次数增多例数较SASP组多.奥沙拉秦钠组未见其他不良反应,而SASP组则有ALT升高、WBC下降、皮疹等不良反.复发青况随访6 mo-1 a,奥沙拉秦钠治疗组21例中有2例复发,而SASP治疗组21例中有8例复发.结论:奥沙拉秦钠治疗慢性反复发作型溃疡性结肠炎患者的疗效及其安全性优于SASP.

肠易激综合征402例发病时间分布及症状特征

目的:了解肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)患者首次发病时间分布规律,为IBS进一步的病因研究提供线索.方法:对消化专科门诊就诊的符合罗马Ⅱ诊断标准的IBS患者402例进行问卷调查.对首次发病月份采用圆分布资料分析.结果:IBS患者的长病程达54 a,平均病程7.62 a,男、女患者病程分布差别无显著性(χ2=2.35,P＞0.05).IBS患者发病有季节性,春季高发(Z=31.78,P＜0.01),男性高发月份为3月份(Z=18.37,P＜0.01),女性高发月份为4月份(Z=16.55,P＜0.01),男、女性高发月份差别有显著性(t=3.32,P＜0.01).患者中腹泻型占36.6%,便秘型占18.4%,其他占45.0%,男、女亚型差别有显著性(χ2=7.77,P＜0.05);腹痛是IBS常见特征,腹痛部位以左下腹多,其次为全腹痛,再次为右下腹痛,无单独的左上腹痛.结论:门诊IBS患者发病有季节高峰,季节可能是IBS发病的影响因素之一.

胃癌前病变演变过程中凋亡相关蛋白和PCNA的表达意义

目的:探讨凋亡相关蛋白P53、Bcl-2和增生细胞核抗原(PCNA)在胃癌前病变不同转归中的作用以及在胃癌早期诊断中的意义.方法:采用免疫组化(LSAB)法检测52例胃癌患者癌前病变组织标本及56例非胃癌患者组织标本的P53、Bcl-2和PCNA的表达.结果:发生癌变者与P53、Bcl-2和PCNA阳性强度有密切关系;PCNA标记指数(PCNA LI)在癌变组表达明显高于非癌变组,差异有显著性(t=5.261,P＜0.01);在癌变组,88.5%的病例有单一或多种基因表达异常,51.9%为两种或两种以上基因同时表达,与非癌变组相比有显著性差异(χ2=4.393,P＜0.05).结论:在胃癌发生过程中,P53、Bcl-2表达强度明显增加,细胞增生活性升高,且为多基因协同作用,说明在胃癌演变过程中他们起重要作用.

美蓝染色放大电子结肠镜观察结肠息肉与细纲病理学的关系

目的:研究美蓝染色后用放大电子结肠镜观察结肠息肉的微细结构类型与组织病理学的关系.方法:使用0.5%美蓝对电子结肠镜检查到有息肉的部位进行息肉及邻近的黏膜进行染色,然后用放大电子结肠镜观察.按Kudo's标准记录正常结肠黏膜和息肉,然后行活检或息肉电切术,以便组织病理学评价.结果:本组共67人,普通电子结肠镜检查发现息肉180颗,经美蓝染色后又发现了1-3 mm大小的息肉90颗,共计270颗息肉.放大结肠镜可明显提高腺瘤性病变的检出率,P＜0.001.270颗病变的隐窝类型分为6种,呈Ⅱ型者2颗(0.7%);Ⅲs型203颗(75.2%);ⅢL型49颗(18.1%),其中伴有轻、中度非典型增生者7颗;Ⅳ型11颗(4.1%),伴有轻度非典型增生者2颗、黏膜癌1颗(9.1%),Vn共5颗(1.9%),伴有中度非典型增生者1颗,黏膜癌2颗(40%).本组息肉均进行了电切术.结论:美蓝染色后用放大电子结肠镜可清晰地观察到结肠隐窝,其大小一致,呈圆形或椭圆形;诊断为腺瘤性息肉与病理组织学的符合率为96.7%,可明显提高息肉的检出率,并可鉴别电切息肉术后残留的基底部是否残留腺瘤组织或癌灶.

乙型肝炎病毒基因组结构与功能复杂性的认识

全世界有乙型肝炎病毒(HBV)感染者3.5亿人.对于HBV多年的研究已经积累了丰富的资料,但是,我们对于HBV基因组特性的认识远远没有穷尽,事实上还有许多方面需要进行探索.通过对特定慢性HBV感染者血清中不同的HBV病毒基因克隆序列的比较提出了HBV准种特点,使我们对于HBV基因组结构与功能的复杂性有了更为深入的了解.野生型病毒之间、野生型病毒与突变型病毒之间、突变型病毒之间的反式调节机制是各种类型的缺陷型HBV存在的重要条件和机制,也是HBV感染引起肝细胞癌(HCC)的重要的分子生物学机制.外周血中存在羧基末端截短的表面抗原中蛋白(MHBst)的编码基因,使我们对于HBV基因编码的反式激活蛋白的类型有了新的认识.通过对克隆的HBVDNA全长基因序列的比较,以及与其他地域所流行的HBV DNA序列之间的比较,发现了新型的开放读码框架(ORF),如前-X(pre-X)蛋白的编码基因和前-前-S(per-pre-S)蛋白的编码基因.长距离精确聚合酶链反应(LA-PCR)技术克隆的HBV DNA全长序列,是我国流行的adr亚型的HBVDNA全基因序列,代表了真正存在的HBV的基因全长序列,在HBV基因结构与功能的研究中,以及在抗HBV治疗疗效应答的研究中具有重要的理论和实际应用价值.

重视溃疡性结肠炎的诊断和个体化规范化治疗

溃疡性结肠炎的诊断和治疗对于临床医生仍然是-个挑战.诊断方面,因为该病缺乏特异的诊断指标,必须强调排除性和综合性的原则,要做到这些有时是非常困难的.治疗方面,由于该病病因和发病机制目前还不完全清楚,因此治疗缺乏特异性,对如何减少复发以及提高难治性患者的疗效仍然是一个难题.而在我国,没有一个适合我国国情的规范化治疗方案则是突出的问题.本文结合我们自己的工作,提出了在分型基础上进行个体化规范化治疗的建议,以期引起对这个问题的重视和探讨,形成具有中国特色的创新性治疗方案.

RNA干扰与抗肝炎病毒治疗前景的研究

0引言从基因的分子生物学角度,病毒性肝炎也是一种基因病,相对于正常肝细胞来说,从肝炎患者的肝细胞中获得了肝炎病毒的基因,因此,病毒性肝炎的治疗也可以采取象遗传病那样的基因治疗(genetherapy)策略[1-5].

乙型和丙型肝炎病毒对MAPKK信号转导的影响

0引言乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生密切相关.虽然HBV和HCV感染与肝细胞癌之间的关系已经得到确定,但是具体的分子生物学机制还有许多工作要做.

乙型肝炎病毒X基因启动子结构及调节研究

0引言乙型肝炎病毒(HBV)持续感染导致全球性健康问题,目前全世界有3.5亿人感染HBV,约占全部人口的6%.其中相当一部分感染者发展为慢性肝炎,少数还发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC),至今仍缺乏有效控制[1-4].

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的研究

0引言乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生、发展过程密切相关[1-5].

乙型和丙型肝炎病毒蛋白对于细胞周期素A的调节研究

0引言细胞周期(cell cycle)是细胞分裂增生的经典概念,过去的研究主要集中在细胞周期的形态学描述上.随着细胞周期素(cyclin)和细胞周期素依赖性激酶(cyclin dependentkinase,CDK)的发现及其作用机制的研究进展,使得我们对于细胞周期调节有了分子生物学水平上的深入认识.细胞周期的分子生物学调节机制的研究,也促进了肿瘤形成的分子生物学机制的研究,同时对于肿瘤病毒(oncogenic virus)引起正常细胞的恶性转化机制的研究具有十分重要的促进作用.

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活作用的研究

0引言乙型肝炎病毒(HBV)是引起急、慢性肝炎的主要原因,部分HBV感染者还可发展为肝硬化、原发性肝癌[1-3].HBV是很小的包膜病毒,病毒基因组结构精密,约3 200个bp(nt),含4个开放读码框架,X基因为小的一个,位于1 374-1 838 nt,编码一个Mr为16-17 kD的145-154个氨基酸残基(aa)多肽.

乙型和丙型肝炎病毒对细胞周期素及细胞周期素依赖性蛋白激酶的调节

0引言乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)感染与肝细胞癌(HCC)发生发展之间的密切关系,早已被大量的临床医学和临床流行病学资料所证实[1].随着细胞周期(cell cycle)调节的分子生物学机制研究不断深入,特别是关于细胞周期素(cyclin)、细胞周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)的发现,使得细胞周期这一经典的概念又有了新的内容,大大促进了肿瘤形成的分子生物学研究的进展[2].

乙型和丙型肝炎病毒蛋白对蛋白酪氨酸激酶信号转导的影响

0引言生物细胞每时每刻都在接触着来自细胞内或者细胞外的各种各样信号.信号只是个诱因,生理反应是信号作用于细胞的终结果.相同的信号作用于不同的细胞可以引发完全不同的生理反应;不同的信号作用于同一种细胞却可以引发出相同的生理反应.

乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白的研究

0引言基因组研究自从开展以来,已经取得了举世瞩目的成就.随着基因组测序工作的完成,接下来就是研究基因的功能.因为基因是通过蛋白质之间的相互作用而发挥功能的,蛋白质之间的相互作用是很多生命现象的基础,故基因表达的蛋白质的功能研究尤为重要.

乙型肝炎病毒基因组结构与功能复杂性的研究进展

编者按关于乙型肝炎病毒(HBV)病毒的受体,HBV DNA与肝细胞基因组DNA之间的整合及其后果,HBV蛋白在肝细胞中与肝细胞蛋白之间的相互结合和相互作用,HBV DNA RNA与肝细胞中蛋白的结合及其调节作用,HBV蛋白对于肝细胞基因表达谱的影响等,目前尚不十分清楚.在HBV DNV克隆化完成之后,立即确定了4个公认的开放读码框架(ORF),但是HBVDNA中是否还会存在其他的ORF,这此,ORF编码的蛋白究竟起什么样的作用,一直是人们怀疑和探索的焦点.

准种是乙型肝炎病毒存在的基本方式

0引言与其他的慢性病毒一样,乙型肝炎病毒(HBV)与人类长期共存,导致了彼此之间的相互适应.针对HBV来讲,为了生存,就得不断进行适应生存环境的变化.这种变化的内因是HBV DNA聚合酶不仅是DNA聚合酶,而且还是前基因组RNA逆转录为子代DNA的逆转录酶.

慢性酒精性肝损伤致Gilbert综合征样改变1例

报告1例慢性酒精性肝损伤致Gilbert综合征样改变.临床上与Gilbert综合征较难鉴别.通过病理检查可以看到肝组织色素沉着较弥散,并同时伴有炎症损伤改变,附图片1张提示治疗上应积极去除病因,进行适当护肝治疗

酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白新基因C-12的研究

目的:乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)在HBV感染的肝细胞中可同时存在于细胞核和胞质中,对于病毒前基因组RNA装配入核壳体是必须的,HBcAg还是HBV介导体液免疫反应和CD4+T细胞免疫反应的重要抗原,寻找人肝细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用蛋白的基因,是研究HBcAg生物学功能的重要途径.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBcAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-d-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析.根据Genbank的信息设计新基因的引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录PCR扩增出C-12#新基因的完整序列,连入另一酵母表达载体pGADT7,并转化进酵母细胞Y187,再次与转化了诱饵质粒的酵母细胞AH109配合(回交),以进一步证实HBcAg与C-12#新基因编码蛋白的结合作用.结果:成功克隆出HBcAg基因并在酵母细胞中的表达,配合后选出既能在四缺(SD/Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落16个,其中未知基因4个.用自行设计的引物成功地从HepG2细胞的mRNA中扩增出C-12#新基因的完整序列,回交实验证实二者之间的结合作用.结论:成功克隆出HBcAg的肝细胞结合蛋白,发现未知功能基因,为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.

乙型肝炎病毒中国流行株全基因的克隆与序列分析

目的:从中国慢性乙型肝炎患者的血清中,应用长距离多聚酶链反应技术(L-PCR)技术扩增、克隆乙型肝炎病毒(HBV)的全基因组序列,建立中国HBV流行株的参考标准序列.方法:从2例慢性乙型病毒性肝炎患者血清提取DNA,以L-PCR技术对于3 200 bp的HBV DNA进行扩增,纯化后克隆到TA载体中进行序列分析.对于HBV DNA的各个编码基因区进行分析.结果:克隆获得的5个HBV DNA全基因序列分别为G376-A6、G376-A7、G683-A1、G683-A2和G683-A3,全基因序列长度分别为3 125、3 215、3 213、3 182和3 215碱基对(bp),在GenBank中的注册号分别为AF384372、AF384371、AF363963、AF363962和AF363961.其中G376-A6、G376-A7来源于同一个患者,G683-A1、G683-A2、G683-A3来源于另一个患者.G376-A6、G683-A2两株病毒在前-S1区存在缺失突变区.其中G683-A2的羧基末端区存在缺失突变.来源于不同患者的e/核心抗原蛋白质一级结构序列没有显著的差别,但来源于同一个患者的HBV基因序列有着明显的同源性.G376-A6、G683-A2两株病毒存在多聚酶蛋白区的缺失突变,但不在多聚酶蛋白的活性结构区,因此考虑这种形式的突变尚不会影响到多聚酶的活性.G683-A3株病毒的多聚酶在其羧基末端存在较长的缺失突变区,使其多聚酶区结构被破坏.5株病毒的X蛋白的一级结构序列比较的结果说明其高度保守.但是相对来讲,X蛋白的氨基末端更为保守,羧基末端序列有一定程度的变异.结论:克隆了HBV DNA中国株的全基因序列,可以作为研究中HBV流行株的参考序列.

乙型肝炎病毒X蛋白激活基因1的克隆化与序列分析

目的:利用分子生物学技术,研究乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)的反式激活作用,克隆HBxAg反式激活作用的靶基因,为进一步探索HBxAg的反式激活作用,以及反式激活作用的靶基因,阐明HBV感染引起慢性肝炎、肝细胞癌(HCC)发生发展的分子生物学机制,为探索新型预防和治疗技术、寻求新型途径奠定理论基础.方法:利用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增HBxAg的编码基因,构建表达载体pcDNA3.1(-)-X,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与转染空白载体的HepG2细胞对照组分别提取总mRNA,并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于获得的差异表达基因片段序列的同源性基因进行搜索,确认为与已知的功能基因无同源性之后,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,完成新基因序列的确定.然后自HepG2细胞提取总mRNA,应用生物信息学技术确定的新基因的序列设计特异性引物,进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术的扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析.结果:PCR技术扩增获得的HBxAg基因序列,经过限制性酶切鉴定和序列测定证实无误.转染HepG2细胞并提取足量的mRNA,利用SSH技术进行分析,获得的基因片段序列分析结果表明,其中之一为新型基因片段序列,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过对EST数据库中注册的基因片段序列同源性的搜索和比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总mRNA,以RT-PCR技术,扩增获得该新基因的全基因序列,并测序证实,命名为XTP1,在GenBank中注册,注册号为AF488828.结论:利用分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HBxAg的反式激活作用的新基因XTP1,并为进一步研究HBxAg的反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.

丙型肝炎病毒NS5A基因变异与干扰素疗效的关系

目的:探讨HCV1b型慢性丙型肝炎患者HCV NS5A基因变异与干扰素(IFN)疗效的关系,NS5A2209-2248片断是否存在干扰素敏感决定区(ISDR).方法:留取慢性丙型肝炎患者干扰素治疗前血清,应用RT-PCR法扩增NS5A基因片段,用直接测序法进行核苷酸及氨基酸序列测定.结果:11例HCV1b型患者中1例为中间型,其余为野生型.2例表现为完全应答,均为野生型,9例为无应答.两组之间核苷酸及氨基酸序列无显著差异.对1例患者的动态观察发现,干扰素治疗后其核苷酸及氨基酸序列均有所变化,改变了其在基因树中的位置.结论:HCVlb型NS5A基因变异与干扰素疗效无关,NS5A2209-2248区高度保守.未证实存在ISDR.干扰素治疗可引起HCV准种改变.

羧肽酶N调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究

目的:乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关.为深入研究HBV调节表达的机制,我们应用噬菌体展示技术,以HBV核心启动子DNA片段为固相支持物,筛选肝细胞cDNA文库,获得HBV核心启动子的肝细胞结合蛋白-羧肽酶N(CPN).CPN是一种从多肽和蛋白质C端氨基酸残基分离的血浆金属蛋白酶,他在调节激肽和过敏毒素的生物活性上起关键作用.CPN是分子量280 kD的四聚体,包含两个50KD酶性亚单位和两个83 kD调节亚单位.核心启动子产生两个3.5kb RNA:前-核心和前基因组RNA.前-核心RNA编码前-核心蛋白和e抗原,前基因组RNA不仅作为mRNA编码核心蛋白和聚合酶蛋白,而且与病毒蛋白一起包埋入核衣壳,作为模板逆转录.前基因组RNA的表达调控在病毒复制周期中起着关键作用.核心启动子分为两部分:基本核心启动子和核心上游调节元件(CURS),其上游为负性调节元件(NER,1616-1621 nt).CPD在体内与HBV核心启动子结合的作用还不清楚,我们分别构建HBV核心启动子及羧肽酶N的重组载体,通过脂质体转染NIH 3T3细胞,研究CPN对核心启动子的调节表达.方法:根据HBV核心启动子及羧肽酶N的序列设计引物,在核心启动子的引物两端引入MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ的酶切位点,在羧肽酶N的引物两端引入EcoR Ⅰ和BamHⅠ的酶切位点.用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和羧肽酶N基因,克隆到pGEM-Teasy载体上.核心启动子经MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pCAT载体上,羧肽酶N经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pcDNA3.1(-)质粒上,构建HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N的真核表达载体,脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞.结果:HBV核心启动子和羧肽酶N(CPN)的PCR产物经1%琼脂糖电泳鉴定与预期大小符合,分别为206 bp和580 bp.重组载体经双酶切鉴定后,证明HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N(CPN)的真核表达载体构建成功.脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞48 h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在羧肽酶N(CPN)的影响下,其活性有大约5-6倍的增加.通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核心启动子的表达.结论:HBV核心启动子结合蛋白羧肽酶N(CPN)与HBV核心启动子共转染细胞,明显调节HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的理论基础.

汉族人IL-12b和IL-10启动子区基因多态性与HBV感染的相关性

目的:我国是一个乙型肝炎大国,乙型肝炎感染及其转归显然有人种、人群差异.本研究对我国汉族人群中乙型肝炎病毒(hepatitis virus B,HBV)感染和发病与白介素-12 p40(interleukin-12 p40,IL-12b)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)启动子区基因多态性之间的关系进行了探讨.方法:利用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性分析(restricted enzyme-fragmentlength polymorphisms,PCR-RFLP)的方法对非相关人群的健康人群与HBV感染患者(轻、中度慢性肝炎、重度慢性肝炎)和HBV感染家系中的HBV携带者、既往HBV感染者、健康人群的IL-12b,IL-10启动子区-540C、-592A(IL10-5'A,IL12-5'C)单碱基多态性(SNP)进行了分析,并且对两个突变位点进行了基因测序.使用SAS统计软件进行统计分析.结果:IL10-5'A、IL12-5'C在非相关人群中的分布技符合Hardy-Weinberg平衡.非相关人群IL10-5'A、IL12-5'C突变等位基因在HBV患者中的频率近似于健康人群(IL10-5'A,HBV患者42.08%,健康人41.9%,P＞0.05;IL12-5'C,HBV患者55.8%,健J康人64.6%,P＞0.05).IL10-5'A与IL12-5'C基因分布在慢性肝炎(轻中)和慢性肝炎(重)两组无显著性差异(P＞0.05).提示IL10-5'A,IL12-5'C单碱基多态性(SNP)对乙型肝炎病情轻中无影响;HBV感染家系中IL10-5'A,IL12-5'C单碱基多态性在携带者、健康人群以及既往感染者三组间均匀分布,IL12-5'C突变频率与非相关人群相似(非相关人群-540T 55.3%,相关人群-540T 55.9%);IL10-5'A突变频率与非相关人群有显著性差异(非相关人群-592C42.0%,相关人群-592C 19.5%,P＜0.01).结论:IL10-5'A突变比IL12-5'C突变在HBV感染家系中可能起到更重要的作用,或影响相关人群对HBV的易感性.

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活基因1的克隆化研究

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)羧基末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)的反式激活作用,利用差异显示技术,筛选克隆MHBst蛋白的反式激活作用的靶基因,发现新型基因,为阐明MHBst对于肝细胞表达基因谱的影响,探索新的研究方向.方法:利用多聚酶链反应技术(PCR)扩增MHBst的编码基因片段,构建真核表达载体pcDNA3.1-MHBst,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与仅转染空白载体pcDNA3.1的HepG2细胞进行差异显示,利用抑制性消减杂交技术(SSH)克隆鉴定MHBst的反式激活作用的靶基因,通过生物信息学技术,确定新基因的序列,设计序列特异性引物,利用HepG2细胞来源的mRNA进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,克隆新基因,并对于新基因的序列以及编码基因产物序列进行分析.利用生物信息学技术确定TTP1基因是新基因.结果:构建表达载体pcDNA3.1-MHBst,经过序列分析和酶切鉴定正确.转染HepG2细胞系,利用SSH技术获得差异表达的基因片段.经对于美国生物工程信息学中心(NCBI)建立的核苷酸序列的数据库(GenBank)检索,证实这是一个新型基因片段.通过对于同源基因序列的比对,根据Kozak规则和终止密码子下游的多聚腺苷酸信号序列,确定新基因的序列,将这种MHBst反式激活的新基因命名为TTP1,并在GenBank中注册登录.结论:克隆并鉴定了乙型肝炎病毒羧基末端截短型表面抗原中蛋白反式激活作用的新型靶基因TTP1,为今后研究MHBst的反式激活作用,开辟了新的研究方向和可能.

乙型肝炎病毒前-S2蛋白结合蛋白基因S2-29的克隆化研究

目的:筛选人肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白(Pre-S2)相互作用的蛋白,探寻HBV致病机制.方法:用多聚酶链反应(PCR)技术扩增HBV前-S2基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,用营养缺陷型培养基及蓝白斑双重筛选阳性菌落,提取酵母质粒转化大肠杆菌并测序,进行生物信息学分析.逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法从HepG2细胞的mRNA中扩增出完整的新基因S2-29,连入另一酵母表达载体pGADT7,并用免疫共沉淀方法再次证实二者间的相互作用.结果:成功克隆出HBV前-S2基因并在酵母细胞中表达,配合后筛选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落26个,其中有1个未知基因S2-29,该基因能在HepG2细胞中表达,免疫共沉淀方法证实二者在体外也有结合作用.结论:成功克隆出与乙型肝炎病毒前-S2蛋白相结合的新基因,为进一步研究HBV前-S2的作用提供了新线索.

酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白E-19的研究

目的:乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对HBV的感染和复制都不是必须的,普遍认为其与HBV引起免疫耐受、免疫系统功能障碍有关.筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBeAg相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制.方法:应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HBeAg基因连接人酵母表达载体p GBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌氨苄青霉素-LB平板上选择并测序,结果在GenBank中进行生物信息学分析.并根据GenBank中的序列信息设计引物从并克隆到另一酵母表达载体pGADT7中,体外免疫共沉淀方法再次验证二者之间的结合作用.结果:成功克隆出HBeAg基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能使X-α-gal变成蓝色的真阳性菌落39个,其中有5个未知基因,在genbank中未找到同源序列,在HepG2细胞的mRNA中成功扩增出该基因的全序,体外免疫共沉淀方法证明HBeAg与新基因E-19表达的蛋白质在体外也有结合作用.结论:成功克隆出HBeAg的肝细胞结合蛋白,发现与HBeAg有相互作用的未知蛋白新基因,为HBeAg的功能研究提出新线索.

乙型肝炎病毒基因组中前-前-S区编码基因的界定

目的:乙型肝炎病毒(HBV)基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠,是基因组序列高度集中利用的-个典型.早期研究中确定了编码病毒蛋白的4个开放读码框架(ORF),本研究通过对于中国HBV感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较,阐明基因组结构的特点,并探索是否存在新型ORF的可能性.方法:考虑到HBV基因组序列的准种特点以及多聚酶链反应(PCR)技术的精确度,我们采用的技术是长距离且精确PCR(LA-PCR)技术,根据中国HBV患者的病毒基因序列设计PCR扩增用引物,自慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列,克隆入pGEM Teasy质粒,挑选克隆进行全基因组DNA测序,与其他HBV基因组序列进行比较.结果:测序结果5株HBV全基因组核苷酸序列存在一新的ORF,定义为前-前-S区,并发现该区之前存在一TA富集区,提示存在新型启动子的可能性.新界定的前-前-S区ORF编码氨基酸序列为MQLIITSKLGⅡYILCGRLVFYIREKLHAVPHFVGHHILGNKSYS,与前-S1、前-S2和表面抗原主蛋白编码基因框架一致表达.结论:在HBV基因组中存在有一新的ORF,命名为前-前-S区.

乙型肝炎病毒基因组中前-X编码基因的界定

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组存在前-X基因.乙型肝炎病毒(HBV)基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠,是基因组序列高度集中利用的一个典型.早期研究中确定了编码病毒蛋白的4个开放读码框架(ORF),本研究通过对于中国HBV感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较,阐明基因组结构的特点,并探索是否存在新型ORF的可能性.方法:考虑到HBV基因组序列的准种特点以及多聚酶链反应(PCR)技术的精确度,我们采用的技术是长距离且精确PCR(LA-PCR)技术,根据中国HBV患者的病毒基因序列设计PCR扩增用引物,自慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列,克隆入pGEM Teasy质粒,挑选克隆进行全基因组DNA测序,与其他HBV基因组序列进行比较.结果:测序结果提示来源于2个患者的5株HBV全基因组核苷酸序列在X基因之前存在一ORF,我们命名其为前-X(pre-X)区.前-X区编码氨基酸与X蛋白融合表达,序列为MGLGYWPSPPAWNLCGSSADPYCGTPSSLFCSQPVWSETYRNRQLCCPLSQIHLLS.该编码序列仅在adr血清型中有编码表现.结论:在HBV基因组中存在有一新的ORF,命名为前-X区,该区可能是一种HBV血清型特异性编码区.

乙型肝炎病毒X蛋白与去唾液酸糖蛋白受体2突变体相互作用的研究

目的:筛选并克隆鉴定人肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,明确HBxAg在HBV感染及致癌过程中的具体作用.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBxAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出阳性目的片段并测序,进行生物信息学分析.根据Genbank中的序列信息设计引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录出去唾液酸蛋白受体2(ASGPR2)突变体的完整序列,克隆到另一酵母表达载体pGADT7中,体外免疫共沉淀再次证明HBxAg与ASGPR2突变体的结合作用.结果:成功克隆出HBxAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能分解X-α-半乳糖(X-α-gal)变成蓝色的真阳性菌落41个,其中有一个是ASGPR2的新突变体.HepG2细胞的mRNA中能逆转录出ASGPR2的全基因序列,体外免疫共沉淀结果证实该突变体与HBxAg在体外也有结合作用.结论:成功克隆出HBxAg的肝细胞结合蛋白,发现一新的ASGPR2突变体,并证实HBxAg与ASGPR2突变体在体外及酵母细胞内均有结合作用.

世界华人消化杂志获得2001年度百种中国杰出学术期刊

WJG搭建我国消化学基础和临床研究惟一国际交流的平台

世界胃肠病学杂志英文版获得2003-2004年国家自然科学基金重点学术期刊专项基金资助

溃疡性结肠炎的基础和临床研究