细胞与分子免疫学杂志
Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 세포여분자면역학잡지
- 主管单位： 中国免疫学会；第四军医大学
- 主办单位： 陕西省免疫学会,中国免疫学会
- 影响因子： 0.81
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1007-8738
- 国内刊号： 61-1304/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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藏羚羊大脑皮质cDNA文库的构建
目的:构建藏羚羊大脑皮质组织的cDNA文库并鉴定文库质量.方法:提取藏羚羊大脑皮质组织总RNA,经oligotex试剂盒纯化得到mRNA.利用SMART技术,使用含有Sfi I B酶切位点的oligo(dT)引物和含有Sfi I A酶切位点的SMART Ⅳ寡核苷酸在PowerScript逆转录酶作用下运用mRNA 5'末端的模板转换方法合成cDNA第1链.利用LDPCR扩增cDNA,经Sfi I(Ⅰ A和Ⅰ B)酶切后,通过CHROMA SPIN-400柱进行分级分离去除＜500 bp的片段,再同经Sfi I酶切的λTrip IEx2载体连接,体外包装后转染到大肠杆菌XL1-Blue宿主菌中,进行文库滴度和重组率的测定,然后扩增文库并随机挑取10个噬菌斑行PCR反应鉴定插入片段大小.结果:构建的cDNA文库滴度为1.8×109 pfu/L,重组率＞98%,文库扩增后滴度达8×1012 pfu/L,插入片段长度在750～6000 bp之间,平均长度为4250 bp.结论:文库具有良好的质量,为进一步筛选、克隆藏羚羊大脑皮质组织特异表达基因奠定了基础.
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细胞因子直接诱导正常人CD4+T细胞产生IL-17和IFN-γ
目的:探讨细胞因子(IL-23、IL-2和IL-15)对正常人外周血单个核细胞(PBMC)和CD4+T细胞IL-17产生的诱导作用和调节因素.方法:将正常人PBMC和纯化的CD4+T细胞在不同条件下与IL-23、IL-2和IL-15进行培养,采用ELISA法检测细胞培养液中IL-17和IFN-γ的水平;采用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)在单个细胞水平上检测IL-17和IFN-γ产生细胞的频率.结果:IL-23可诱导PBMC产生IL-17和IFN-γ;Th2细胞因子和抗IL-12受体β1(IL-12Rβ1)mAb可抑制IL-23诱导的IL-17和IFN-γ产生.IL-2和IL-15均可诱导IL-17和IFN-γ产生,并与IL-23具有共同诱导作用.IL-12可诱导PBMC产生大量的IFN-γ,但不产生IL-17.进一步研究表明,IL-23、IL-2和IL-15可直接诱导纯化的CD4+T细胞产生IL-17和IFN-γ.结论:IL-23、IL-2和IL-15可直接作用于正常人CD4+T细胞诱导其产生IL-17和IFN-γ;Th2细胞因子和抗IL-12Rβ1 mAb可抑制IL-23诱导的IL-17和IFN-γ产生.为探讨自身免疫性疾病等的发生机制和治疗提供了新的靶点.
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多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠脾细胞因子的变化
目的:探讨多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫后再以Em原头节攻击后小鼠脾细胞因子的变化.方法:将疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/c小鼠后8周,用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染.感染后18周杀鼠取脾,分离脾细胞,用EmAg或ConA刺激培养,并收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液中IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4的水平,同时设有空载体、BCG和PBS对照.结果:疫苗接种组的IFN-γ和TNF-α水平升高,IL-4水平降低;皮下注射组的TNF-α水平高于鼻腔内接种组.结论:多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗可诱导小鼠产生Th1型细胞应答,抵抗Em原头节的攻击感染.疫苗皮下注射途径优于鼻腔内接种.
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结核分枝杆菌Rv2450蛋白诱导小鼠免疫应答的实验研究
目的:以原核表达的结核分枝杆菌Rv2450蛋白在小鼠体内诱导体液和细胞免疫应答.方法:采用皮下包埋的方法,以预先转移到硝酸纤维素膜上的原核表达的Rv2450蛋白免疫小鼠(10只)3次,每次间隔2周.用间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体的滴度.末次免疫完成后4周,处死3只免疫小鼠并分离脾淋巴细胞,体外经PPD(2 μg/孔)刺激后,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖指数.用ELISA法检测脾淋巴细胞悬液中IFN-γ、IL-10及IL-12的水平.结果:Rv2450蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶3 200,淋巴细胞增殖指数为3.76±0.19.免疫小鼠脾淋巴细胞培养液中IFN-y、IL-10及IL-12的含量,分别为(1 740±19)ng/L、(678±15)ng/L、(469±13)ng/L,均高于各组的生理盐水对照组(P＜0.05).结论:Rv2450有可能作为新型结核疫苗的候选组分.
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两种HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及其免疫原性比较
目的:利用毕赤酵母表达系统表达两种融合形式的乙肝病毒表面抗原(HBsAg-s和s-HBsAg),并对融合蛋白的免疫原性进行研究.方法:用毕赤酵母分泌型表达质粒pPIC9k为载体,通过PCR方法引入(Gly4Ser)3连接肽的编码基因将GM-CSF融合到HBsAg基因的3'端或5'端进行分泌表达,表达产物以SDS-PAGE及Western blot进行分析并通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱进行蛋白纯化.将纯化的两种融合蛋白与单纯的HBsAg蛋白分别免疫小鼠,ELISA方法检测HBsAg特异的抗体反应水平.结果:两种HBsAg/GMCSF融合蛋白均可在毕赤酵母菌株GS115中获得了分泌表达,Western blot分析表明表达产物能够与抗GM-CSF抗体及抗HBsAg抗体发生特异性结合.免疫后的血清ELISA结果显示,相比单纯的HBsAg蛋白,两种融合蛋白可以诱导出更高的抗体水平(P＜0.05),其中将GM-CSF蛋白融合在HBsAg蛋白的C端效果要好于融合在N端.结论:通过与GM-CSF蛋白的融合可以显著增强HBsAg的免疫原性,这为提高乙肝疫苗的免疫效果提供了新的思路与方法.
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差速贴壁结合神经营养因子3体外纯化培养人胚嗅鞘细胞
目的:采用差速贴壁结合神经营养因子3的方法对人胚嗅球嗅鞘细胞进行原代纯化培养,探讨简单实用的嗅鞘细胞体外培养方法.方法:将差速贴壁后人胚嗅鞘细胞间隔48 h用含100 mL/L胎牛血清和含NT3的DF12培养液交替进行体外培养.观察嗅鞘细胞的生长变化,采用形态学和P75免疫细胞化学染色进行细胞及纯度鉴定.结果:体外培养的人胚嗅鞘细胞P75染色呈阳性反应,呈双极、三极细胞,细胞突起细长,并可形成细胞突起网络.在体外培养9 d时可以获得95%的嗅鞘细胞,12 d时为83%,且细胞状态良好.结论:差速贴壁法结合间断NT3应用是一种简单实用的嗅鞘细胞纯化培养方法.
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Wnt/β-catenin信号因子在HepG2以及L02细胞中的表达
目的:比较Wnt/β-catenin信号分子在HepG2和L02细胞中的表达,探讨Wnt/β-catenin信号转导通路在肝癌发生中的作用机制,为肝癌的防治提供新的思路.方法:选取Wnt/β-catenin信号转导通路中上下游关键因子Wnt1、Wnt4、β-catenin、cyclin D1以及c-myc等,应用RT-PCR的方法观察他们在正常肝脏L02细胞和肝癌HepG2细胞中的转录水平.用免疫细胞化学染色方法和Western blot检测研究Wnt/β-catenin信号转导通路中关键的成员β-catenin在上述2个细胞株中的定位和定量表达.结果:在正常的L02肝细胞中,用RT-PCR的方法未检测到Wnt1、Wnt4、cyclin D1以及c-myc的mRNA转录,只有β-catenin的基因被转录表达.同时用免疫细胞化学染色观察到β-catenin在L02细胞膜处存在表达.而在HepG2肿瘤细胞中,不仅检测到β-catenin的基因转录,同时也检测到Wnt1、cyclin D1以及c-myc的mRNA转录,只有Wnt4未转录.用免疫细胞化学的方法观察β-catenin在肿瘤细胞中的表达明显增强,表现为胞膜着色减弱而胞质甚至是胞核的阳性染色.采用Western blot检测也验证了β-catenin蛋白在肿瘤细胞中的表达水平明显高于正常细胞.结论:Wnt/β-catenin信号转导通路在人的肝癌细胞HepG2中存在异常活性,Wnt1可能是导致信号通路激活的始动因素之一.
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MACS系统对小鼠造血干细胞定向分化为未成熟树突状细胞的实验研究
目的:探讨经MACS系统在体外获得大量高纯度未成熟树突状细胞(imDC)的方法,并对其细胞表面标志、形态和功能进行鉴定.方法:对健康C57小鼠的骨髓通过MACS系统分离、纯化CD117+造血干细胞(HSC);使用SCF+IL-3行体外扩增,并采用GM-CSF+IL-4+IL-10诱导其定向分化为imDC;进而在倒置显微镜、扫描电镜以及透射电镜下观察其形态、功能,采用流式细胞计数法检测、鉴定其表面标志物的表达.结果:SCF+IL-3可以分别在3、5、7 d时体外扩增HSC达10.34±1.43倍、22.65±2.71倍、54.39±3.08倍;小鼠HSC可被成功诱导分化为imDC,且具有吞噬功能,表面树突呈毛刺状、较为短小,imDC并表达CD11c+、I-A/I-Elow、CD40-、CD80-、CD86-.结论:本方法可稳定、有效地获得大量高纯度的mDC.
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shRNA表达载体的构建及对HBV复制和表达的抑制
目的:构建shRNA的表达载体,检测针对乙型肝炎病毒(HBV)的shRNA的稳定表达质粒对HBV复制和表达的影响.方法:扩增U6启动子构建shRNA表达载体pU6.针对HBV基因组序列设计并化学合成双链核苷酸克隆到pU6载体得到质粒pU6B/HBVi,脂质体介导转染带有HBV基因组的2.2.15细胞,定量PCR和ELISA法检测pU6B/HBVi对HBV复制和表达的影响.结果:成功构建了shRNA的真核表达载体;针对HBV的pU6B/HBVi质粒对HBV的复制和表达有明显的抑制作用.结论:稳定表达shRNA的pU6B/HBVi质粒可以抑制HBV在2.2.15细胞中的复制和表达.
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短发夹状RNA特异性抑制HeLa细胞的Hax-1基因表达
目的:构建靶向Hax-1基因的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体pGenesil-Hax-1,并探讨siRNA靶向抑制Hax-1基因表达的作用.方法:根据shRNA设计的原则,在Hax-1全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pGenesil-1中,获得可靶向抑制Hax-1基因的重组shRNA表达载体.采用LipofectamineTM2000转染试剂将pGenesil-Hax-1导入HeLa细胞中;分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测干扰效果.结果:半定量PCR及Western blot结果表明,siRNA可使Hax-1 mRNA的转录水平得到显著抑制(P＜0.01),Hax-1蛋白的表达较对照组减少约70%.结论:靶向Hax-1基因的重组shRNA表达载体pGenesil-Hax-1介导的siRNA可显著抑制Hax-1基因在人宫颈癌HeLa细胞中的表达.
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LAIR-1/LAIR-2(CD305/CD306)与配体结合亲和力的比较
目的:LAIR-1/LAIR-2(CD305/306)与配体结合亲和力的比较.方法:应用不同浓度混合的LAIR-1和LAIR-2融合蛋白,同时或先后与配体表达细胞孵育后,用特异性LAIR-1或LAIR-2单克隆抗体(mAb)进行免疫荧光染色和流式细胞术(FCM)分析,比较LAIR-1和LAIR-2融合蛋白与细胞结合的百分率的变化及相互竞争情况.结果:LAIR-1和LAIR-2膜型配体的分布较广泛,人和小鼠LAIR受体与配体的结合具有相互交叉的特点.LAIR-2能够明显阻断LAIR-1与其膜型配体的结合,而LAIR-1对LAIR-2与其配体的结合无影响.结论:LAIR-1和LAIR-2可能结合相同的膜型配体,但LAIR-2结合配体的亲和力明显高于LAIR-1结合的亲和力.此结果为深入探讨LAIR家族免疫调节的分子机制提供重要的实验依据.
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幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性
目的:构建幽门螺杆菌(Hp)UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株,在大肠杆菌中表达UreB-Omp11融合蛋白,并检测其免疫学活性.方法:用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的ureB和omp11基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-omp11融合基因,将融合基因ureB-omp11插入原核表达载体pET30a(+)、pET28a(+)及pMAL-c2X中,筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达,采用Western blot对表达产物进行鉴定,并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白,应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析,纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠,Western blot对免疫小鼠血清进行检测.结果:特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB-omp11克隆入表达载体pET30a(+)、pET28a(+)与pMAL-c2X中;重组菌TB1(pMAL-ureB-omp11)经诱导获得了高效表达的MBP-UreB-Omp11融合蛋白,该融合蛋白可以被Hp免疫小鼠血清和Hp阳性患者血清中的相应抗体所识别,纯化后的融合蛋白纯度达90%以上.通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在Mr 134 000处出现特异杂交带,融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性.结论:成功地构建并筛选出了Hp MELHP27融合蛋白UreB-Omp11的重组疫苗候选株TB1(pMAL-ureB-omp11),为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础.
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体外灌流慢性重型肝炎患者血浆对C3A细胞的细胞色素P4503A活性和表达的影响
目的:通过比较未经灌流处理的重肝血浆及处理过的重肝血浆对CYP3A的影响,阐明C3A细胞安定代谢变化的原因,为未来C3A细胞的改造与功能优化奠定基础.方法:制备血浆和培养C3A细胞;实验分为4组:正常胎牛血浆(NFBP)组,正常人血浆(NHP)组,体外灌流慢性重型肝炎患者血浆(HPP)组,体外未灌流慢性重型肝炎患者血浆(CSHP)组.用分光光度法测定红霉素N-脱甲基酶(ERD)活性即CYP4503A的活性,Western blot法测定CYP4503A4的表达.结果:CSHP组ERD活性低于NFBP组(P＜0.05)及NHP组(P＜0.05),HPP组ERD活性也低于NFBP组(P＜0.05)及NHP组(P＜0.05),HPP组ERD活性高于CSHP组(P＜0.05);CSHP组CYP4503A4的表达低于NFBP组(P＜0.05)及NHP组(P＜0.05),HPP组CYP4503A4的表达也低于NFBP组(P＜0.05)及NHP组(P＜0.05),HPP组CYP4503A4的表达高于CSHP组(P＜0.05).结论:经慢性重型肝炎患者血浆培养的C3A细胞,CYP4503A活性及蛋白表达降低.与之相比,经过体外灌流的慢性重型肝炎患者血浆其C3A细胞CYP4503A活性及蛋白表达有所增加,CYP4503A活性增加可能是导致安定代谢变化的原因.
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脂多糖对星形胶质细胞的生长具有双重性
目的:研究脂多糖(LPS)对星形胶质细胞(AC)生长的影响及其可能的机制.方法:在原代培养的AC中加入不同浓度的LPS作用不同时间,观察AC生长的情况,以及NF-κB通路抑制剂SN50对AC生长的影响.同时以不同浓度的LPS作用24 h后,观察随后8 d AC生长的变化.结果:在LPS作用不同时间中,只有作用24 h后,低剂量的LPS可使AC的生长加快,高剂量的LPS则可抑制AC生长.以LPS作用AC 24 h后,短期内LPS可促进AC的生长,长期则抑制AC生长,且呈剂量依赖性.NF-κB通路抑制剂可阻断LPS对AC生长的影响.结论:低剂量的LPS短期内可促进AC生长,高剂量时则抑制AC生长,而炎症对AC的长期影响是对细胞的生长增殖起抑制作用.其可能的分子机制可能与NF-κB通路激活有关.
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去除白细胞的血液输注可明显降低免疫性输血反应的发率
目的:观察去除白细胞成分的血液输注在预防免疫性发热输血反应中的作用.方法:取保存期分别为7 d、14 d及21 d的红细胞悬液60个U(单位/袋),在无菌条件下,用白细胞过滤器去除血液中的白细胞,取过滤前后的血液标本,检测WBC、RBC、Hb、血浆中的pH值、钾钠离子及游离Hb;选择血液病和肿瘤患者800例,随机分为观察组和对照组各400例,观察组输注去除白细胞的血液,对照组输注未去除白细胞的血液,观察两组的输血反应的发生率.结果:白细胞过滤器对白细胞的去除率为99%,红细胞的回收率为92%,过滤后的血液各项生化指标无明显变化.观察组免疫性发热输血反应的发生率为1.25%,对照组为8.75%.结论:白细胞过滤器具有较高的WBC去除率,对RBC的生物学性质影响较小,输注去除白细胞成分的血液可使免疫性发热输血反应的发生率明显降低.
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HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物四聚体的构建及初步检测应用
目的:构建2种HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物四聚体,并初步用该2种四聚体检测针对不同抗原肽特异性的细胞毒性T细胞(CTL).方法:原核高效表达HLA-A*2402-BSP和β2m蛋白后,分别与乙型肝炎病毒抗原肽Po1756-764和Core117-125在体外复性折叠成可溶性的HLA-A*2402抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体,分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成2种HBV抗原肽四聚体.后进行流式细胞术检测.结果:Dot-ELISA和ELISA检测显示获得了2种具有天然构象的生物素化的HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物单体.结论:构建的2种四聚体可以检测乙型肝炎感染者体内特异性的CTL.
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人核糖体蛋白S15a在胃腺癌中的表达
目的:研究RPS15a在胃腺癌中的表达及意义.方法:免疫组化方法检测RPS15a在100例胃腺癌及癌旁组织中的表达.结果:胃腺癌中RPS15a蛋白阳性率为78.0%(78/100),癌旁组织中RPS15a蛋白阳性率为44.0%(44/100).RPS15a蛋白在胃腺癌组织中表达明显高于癌旁组织(P＜0.05),且与胃腺癌组织浆膜浸润、淋巴结转移有明显相关性(P＜0.05).结论:RPS15a可能在胃腺癌发生、发展中起重要作用.
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不同病程寻常型银屑病患者外周血中CD4+ CD25high调节性T细胞的比较与分析
目的:检测和分析不同病程寻常型银屑病患者外周血CD4+ CD25high调节性T细胞(CD4+ CD25high Treg)水平特点和意义.方法:选取进行期(70例)、稳定期(64例)和消退期(38例)寻常型银屑病患者,知情同意后,取外周抗凝全血,分离单一核细胞,采用流式细胞术检测不同病程寻常型银屑病患者外周血CD4+ CD25high Treg的水平,并统计分析其特点与意义.结果:进行期、稳定期和消退期寻常型银屑病患者组外周血CD4+ CD25high Treg与CD4+淋巴细胞的百分比分别为(2.86±0.9)%、(3.95±0.6)%和(4.77±0.1)%.稳定期和消退期寻常型银屑病患者组明显高于进行期组(t'=8.312,P＜0.01;t=10.126,P=0.000),而消退期组明显高于稳定期组(t'=4.588,P＜0.01).值得注意的是,消退期寻常型银屑病患者组与正常对照组比较,差异显著,消退期组仍低于正常对照组(t=2.281,P=0.0264).结论:不同病程寻常型银屑病患者外周血CD4+ CD25high Treg水平存在显著差异,提示CD4+ CD25high Treg与寻常型银屑病发生和病程发展关系密切.本研究为深入研究寻常型银屑病免疫学发病机制做出了初步的尝试与探索.
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阿尔茨海默病患者血清中抗淀粉样蛋白抗体的免疫耐受
目的:研究阿尔茨海默病(AD)血清中抗Aβ抗体与淀粉样蛋白结合的特性.方法:以AD患者和健康老人的血清作一抗,①用组织淀粉样斑块免疫反应(TAPIR)观察与Tg2576鼠脑内老年斑结合能力;②Western blot检测与Aβ42-GST融合蛋白的结合能力;③将Aβ42与PC12细胞培养,加入健康老人和AD患者的血清后,MTT法观察PC12细胞存活率.结果:AD患者的血清中抗Aβ抗体与成熟老年斑和Aβ42-GST融合蛋白的结合能力较弱;加入AD血清后,PC12细胞的A值较健康老人血清相比下降明显(P＜0.01).结论:AD血清中抗Aβ抗体对淀粉样蛋白可能存在着免疫耐受.
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去黏附化增强抗DR5抗体介导食管癌细胞凋亡及其作用机制
目的:探讨去黏附化对抗死亡受体5(DR5)抗体诱导的食管癌鳞癌EC9706细胞系凋亡的影响及作用机制.方法:用EDTA消化对蓝菌素A预处理或未处理的贴壁生长的食管癌细胞,制备悬浮细胞;利用流式细胞术检测食管癌细胞表面DR5表达及人抗DR5功能抗体诱导的细胞凋亡;利用免疫荧光技术观察食管癌EC9706细胞DR5表达分布.结果:悬浮食管癌细胞对抗DR5的功能性抗体诱导的细胞凋亡的敏感性明显高于铺展者;未经蓝菌素A预处理制备的悬浮食管癌细胞的表面DR5表达明显高于经蓝菌素A处理制备的悬浮者.在铺展的食管癌EC9706细胞,DR5分布于细胞质和细胞膜表面,主要在细胞质,在细胞核没有DR5分布,但在悬浮的食管癌细胞表面DR5表达明显增强.结论:去黏附化增强食管癌细胞对抗DR5功能性抗体诱导细胞凋亡的敏感性,该作用是通过去黏附化增强DR5向细胞表面转运实现的,DR5的膜转运与高尔基体有关.该研究结果对进一步探讨DR5表达分布的机制以及TRAIL和DR5的功能性抗体的抗肿瘤临床应用有一定的指导意义.
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去除Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体原核表达载体的构建及表达
目的:构建和表达不带Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(Diabody[CD3×Pgp]),并测定其生物学活性.方法:利用PCR方法构建不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]原核表达载体,进行原核表达,制备抗抗CD3 scFv亲和层析柱进行纯化,SDS-PAGE鉴定.通过间接免疫荧光法和竞争性免疫荧光结合流式细胞术(FCM)检测生物学活性.结果:无Etag的Diabody[CD3×PgP]表达载体经测序证实其序列正确.SDS-PAGE电泳显示2条带,相对分子质量(Mr)分别为25 000和26 000,与预期Mr相符.去除Etag的Diabody[CD3×Pgp]与K562/A02和Jurkat细胞结合阳性率分别为89.87%和83.95%.竞争结合实验中,与K562/A02和Jurkat细胞竞争后结合率分别为50.25%和43.78%.结论:成功构建了不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]表达载体、进行原核表达及纯化.不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]能特异性结合CD3和PgP靶抗原,Etag标记去除后其生物学活性没有降低.
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抗伏马菌素B1单克隆抗体的制备与特性鉴定
目的:制备抗伏马菌素B1(Fumonisin B1,FB1)单克隆抗体(mAb),并对其进行特性鉴定.方法:人工合成免疫原BSA-FB1,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞融合技术制备抗FB1的mAb,通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选阳性克隆.以间接竞争ELISA法对mAb的敏感性、特异性、亲和力等特性进行检测,并对其效价、亚类、稳定性等特性进行鉴定.结果:获得了1株稳定分泌抗FB1 mAb的杂交瘤细胞(命名为5H12-C6-C2),其亚类为IgG2b,腹水和上清效价分别为1∶1.28×106和1∶3.2×103,亲和常数为3.13×106 M-1.mAb的间接竞争ELISA法灵敏度为0.09088 mg/L,与FB1的类似物FB2有轻微交叉反应,与污染玉米的另外5种真菌毒素ZEN、AFB1、DON、T-2、OA以及载体蛋白BSA和OVA无交叉反应性,稳定性良好.结论:成功地制备了抗FB1特异性mAb,为开展FB1免疫学检测方法的研究提供了有力的工具.
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抗CD1d单克隆抗体的制备及其识别结构域的鉴定
目的:制备抗人CD1d单克隆抗体(mAb)并研究其结合特性.方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术制备鼠源性抗人CD1d mAb.用免疫荧光染色和流式细胞术鉴定其识别位点.结果:获得1株分泌抗CD1d mAb的杂交瘤细胞株.mAb的腹水ELISA效价达10-6,为IgG1亚类,可识别293T细胞转染的CD1d分子的α1结构域.结论:获得1株可特异性识别CD1d α1结构域的mAb,为进一步研究CD1d的结构及功能提供了手段.
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抗禽流感病毒H7亚型血凝素特异性单克隆抗体的研制
目的:研制禽流感病毒H7亚型血凝素特异性单克隆抗体(mAb).方法:以H7亚型禽流感诊断抗原为免疫原免疫6～8周雌性BALB/c小鼠,末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14进行融合.通过HA和HI试验筛选阳性克隆.应用HI试验和Western blot试验测定mAb的反应性和特异性.结果:共获得4株分泌抗AIV H7亚型HAmAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为2E2、2A4、5F5、7G5.这些mAb的腹水HI效价在5×27～5×211之间,其中2E2属于IgM亚类,2A4属于IgG1亚类,5F5、7G5属于IgG2a亚类.Western blot分析结果显示,4株AIV H7亚型HA mAb能与AIV H7蛋白在Mr 75 000处反应,但不与新城疫病毒(NDV)蛋白发生反应,表明这些mAb能特异性识别AIV H7亚型HA.mAb HI反应性测定结果表明:4株mAb中,2E2、5F5、7G5只与H7亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他亚型AIV以及NDV、传染性支气管炎病毒(IBV)反应,显示出良好的特异性;而2A4除了与H7亚型AIV反应外,还与H15N8标准株发生低水平交叉反应.结论:这些mAb不仅为H7亚型AIV的HA结构分析提供了工具,而且为建立快速廉价的H7亚型禽流感诊断方法提供了核心试剂.
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人致肺纤维化因子的重组表达和抗体制备
目的:进行人致肺纤维化因子的原核和真核表达,并利用原核表达蛋白制备兔抗人致肺纤维化因子多克隆抗体.方法:人致肺纤维化因子为同一基因的一组可变剪切产物,将其共有cDNA序列(ChS)插入质粒pQE-30,构建ChS-pQE表达质粒,转化大肠杆菌M15,表达菌株经IPTG诱导,获得大量不可溶的包涵体蛋白.以之为抗原免疫新西兰大白兔,制备出多克隆抗体.对该多克隆抗体初步检测证明获得较高滴度和较高特异性的抗体,并用Western blot鉴定这组cDNA连接到pcDNA3.1D载体后在真核细胞的重组表达.结果:原核表达的不可溶性重组蛋白也能成功地制备出多克隆抗体.结论:成功地表达了人致肺纤维化因子,并制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体,人致肺纤维化因子的表达和功能研究提供了一条途径.
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抗人β防御素3融合蛋白抗体的制备及其活性检测
目的:人抗菌肽β防御素3(HBD3)除具有杀灭多种病原菌的作用外,还参与机体免疫防御的多个过程,本实验的目的是进一步了解HBD3在人体的生物功能.方法:通过将编码HBD3成熟链的基因与载体pGEX-KG相连,表达出谷胱甘肽S转移酶与HBD3(GST-HBD3)的融合蛋白,制备HBD3的抗体.结果:通过Western blot检测及免疫组化方法证实HBD3抗体的制备成功,显示了HBD3蛋白在食道上皮细胞的表达部位.结论:为进一步了解HBD3在人体的功能及其在疾病状态下的改变奠定了坚实的基础.
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IgE及其高亲和力受体与过敏性疾病
随着工业的高速发展,空气污染越来越严重,过敏性疾病的患病率在全球范围内均呈逐年增加的趋势,据估计40%以上的世界人口处于特异性超敏性状态.世界卫生组织(WHO)已将变态(过敏)反应病列为全球重点防治的疾病,世界发达国家和地区已投入了大量的人力及财力进行了深入的研究,变态反应性疾病的防治研究已引起人们极大关注[1].
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转录因子FOXP3与自身免疫性疾病
Foxp3是Forkhead/winged helix家族的新成员,定位于X染色体上,通过forkhead结构域与DNA特定位点结合,调节目的基因的活化与表达.其编码产物为scurfin蛋白,可能是CD4+CD25+调节性T细胞(简称CD4+ CD25+ Treg)特异性标志,对CD4+ CD25+ Treg的增殖分化及功能发挥起重要作用.CD4+ CD25+ Treg同时表达CD4和CD25,介导机体特异性免疫耐受,抑制机体自身免疫性疾病、肿瘤、病毒感染及器官移植免疫等.Foxp3基因突变或缺失可引起风湿、类风湿、系统性红斑狼疮、X-相关综合征等疾病;Foxp3基因过表达可诱导机体对肿瘤、病毒及器官移植等产生免疫耐受.Foxp3表达上调,可维持免疫耐受、抑制排斥反应和自身免疫性疾病;Foxp3表达下调,降低机体免疫耐受,可治疗肿瘤、器官移植及慢性病毒感染.
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乳腺癌治疗的树突状细胞疫苗研究进展
乳腺癌已成为危害妇女健康的常见恶性肿瘤.乳腺癌的主要治疗手段仍为手术、化疗、放疗及内分泌治疗等.但这些方法对于进展期乳腺癌的疗效并不理想,仍有40%的患者死于肿瘤复发和转移[1].因此,人们渴望新的治疗手段来提高治疗效果,改善生活质量.近年来,随着对免疫学的深入研究,以树突状细胞(dendritic cell,DC)为基础构建的乳腺癌治疗疫苗成为研究的热点.
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针对人caspase-8基因的siRNA的载体的构建及其沉寂效应检测
目的:设计并构建针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达载体,观察其对转染细胞中的caspase-8的抑制作用.方法:化学合成用于产生针对caspase-8的发夹状的RNA的寡核苷酸,将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入经Hind Ⅲ和Bgl Ⅱ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,RT-PCR、间接免疫荧光检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果:构建了针对人caspase-8基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-C1和pSUPER-C2,并在人HeLa细胞中有效发挥了对caspase-8基因的干涉作用,而且pSUPER-C1对于caspase-8基因的抑制作用要优于pSUPER-C2.结论:成功地构建了针对人caspase-8基因的siRNA载体,转染HeLa细胞后可抑制caspase-8基因的表达.
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pPICZα-LL37-Fcγ1重组质粒的构建及其在毕赤酵母GS115中的表达
目的:构建pPICZα-LL37-Fcγ1重组表达载体,实现LL37-Fcγ1重组融合蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达,获得功能性抗菌蛋白.方法:通过合成LL37全基因,将其与人IgG1 Fc(Fcγ1)基因相连后,插入到毕赤酵母菌表达载体pPICZα中.电转化毕赤酵母菌GS115后,经Zeocin抗性筛选阳性菌株.用RT-PCR和斑点杂交鉴定目的基因的表达.通过亲和层析法纯化目的蛋白,并以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.用BCA法测定目的蛋白的浓度,鲎试剂鉴定其中和内毒素的能力.结果:成功地构建了pPICZα-LL37-Fcγ1重组质粒,并证明目的基因已整合于毕赤酵母菌的基因组中.通过亲和层析获得具有结合蛋白A及中和内毒素能力的重组融合蛋白LL37-Fcγ1.结论:在毕赤酵母菌GS115中高效表达功能性的LL37-Fcγ1融合蛋白,为进一步研究奠定了基础.
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牛口蹄疫病毒受体通用亚基αv配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备
目的:利用原核细胞表达牛口蹄疫病毒受体通用亚基整联蛋白αv的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体.方法:以含有牛整联蛋白全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到位于αv成熟肽氨基端的LBD基因片段,经酶切消化处理后,与同样酶切处理的原核表达载体pPRoEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRo/αvLBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达αvLBD蛋白.通过SDS-PAGE鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体.通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性.结果:成功构建了pPRo/αvLBD原核表达载体,实现了重组αvLBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其Mr约为40000,主要以包涵体形式存在于菌体中.制备的兔多克隆抗体效价达1∶25 600以上.以Western blot检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性.结论:实现了牛口蹄疫病毒受体通用亚基αvLBD的高效表达和高效价多克隆抗体的制备,为深入研究整联蛋白αv在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础.
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肾上腺髓质素对TGF-β1促肺成纤维细胞增殖和胶原合成的影响
目的:观察肾上腺髓质素(ADM)对转化生长因子β1(TGF-β1)促肺成纤维细胞增殖和胶原合成的影响,探讨ADM在肺血管结构改建和组织损伤修复中可能发挥的作用.方法:采用体外细胞培养方法,培养人胚肺成纤维细胞,免疫组化法鉴定.采用细胞计数、四氮唑盐(MTT)法测定成纤维细胞增殖,3H-脯氨酸掺入法测定成纤维细胞胶原合成与分泌.结果:原代培养人胚肺成纤维细胞,免疫组化染色α-actin阴性,证明本实验所培养的细胞是成纤维细胞.TGF-β1明显促进成纤维细胞增殖和胶原合成.加入TGF-β1,成纤维细胞数和A值分别增加了46.8%和32.03%,胶原合成和分泌增加了54.14%和43.40%(P＜0.01).给予ADM,TGF-β1的促增殖和胶原合成作用受到抑制,加入10-9、10-8、10-7 mol/L ADM,成纤维细胞数和A值分别下降了18.36%和17.7%、31.19%和21.31%、52.83%和40.14%(P＜0.01);胶原合成分别被抑制了16.12%(P＜0.05)、4.52%(P＞0.05)、38.17%(P＜0.01)、16.36%(P＜0.05)、42.30%、26.48%(P＜0.01).结论:ADM可以抑制TGF-β1引起的肺成纤维细胞增殖和胶原合成,提示ADM具有抑制TGF-β1的促血管重塑和纤维化效应.
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鸡C/EBP-α基因表达载体的构建及抗血清制备
目的:构建鸡C/EBP-α基因原核和真核表达载体及制备高效价的抗血清,为在蛋白质水平研究鸡C/EBP-α基因的功能以及与其他脂肪细胞分化调控基因间的时空协同关系奠定基础.方法:采用RT-PCR的方法,根据已知鸡的C/EBP-α基因cDNA序列,获取鸡C/EBP-α基因的cDNA片段,测序正确后分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1和真核怂表达载体pcDNA3中.重组质粒pGEX-4T-1/C/EBP-α转化大肠杆菌BL21(DE3),不同浓度的IPTG诱导后,用SDSPAGE检测蛋白表达情况;真核表达载体pcDNA3/C/EBP-α应用水压转染法,经RT-PCR检测外源C/EBP-α基因在小鼠肝脏中的表达情况,然后采用"DNA prime-protein boost"策略免疫小鼠,制备高效价的抗血清,应用Western blot检测抗血清的特异性.结果:构建了鸡C/EBP-α基因的原核和真核表达载体;SDS-PAGE显示C/EBP-α得到了特异性的表达;RTPCR结果提示C/EBP-α mRNA在小鼠肝脏中表达;ELISA和Western blot结果表明基因免疫小鼠产生了高效价和特异性强的抗血清.结论:成功构建了鸡C/EBP-o基因的原核pGEX-4T-1/C/EBP-α和真核表达载体pcDNA3/C/EBP-α,外源基因C/EBP-α mRNA能在小鼠肝脏中有效表达,同时制备了高效价、特异性强的抗血清.
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大鼠心肌缺血/再灌注损伤基因表达谱特征的初步观察
目的:观察心肌缺血/再灌注损伤前后基因差异表达,探讨缺血/再灌注后心肌细胞损伤的分子生物学机制.方法:提取大鼠缺血/再灌注前后心肌组织mRNA并纯化,用Affymetrix RAT 230A基因表达谱芯片,对表达差异基因进行检测.结果:按差异显著阳性标准,从14000个基因中筛选出缺血/再灌注后差异表达基因179条,其中123条表达上调,56条表达下调,包括原癌基因、细胞周期、信号转导、细胞外基质、细胞骨架蛋白、转录因子、DNA损伤修复基因、凋亡相关蛋白及核糖体蛋白等相关编码基因.结论:用cDNA表达谱芯片分析心肌缺血/再灌注后基因表达,能快速筛选出再灌注损伤相关基因,为临床上更有效地预防缺血/再灌注损伤提供根据.
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截短型人凋亡诱导因子AIF△1-400对HeLa细胞的促凋亡作用
目的:观察人截短型AIF(AIF△1-400)对HeLa细胞的促凋亡作用.方法:在AIF△1-120基因克隆成功的基础上进一步改造,构建截去AIF基因线粒体定位信号、FAD结合结构域和NADH结合结构域(1～400位氨基酸)编码序列的AIF△1-400基因,将其克隆入pcDNA3真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,通过Western blot检测该基因在转染细胞中的表达通过电镜观察截短型分子对肿瘤细胞的具有促凋亡活性.结果:经酶切鉴定与测序证实,AIF△1-400的真核表达载体构建成功.通过Western blot证实截短型基因在HeLa细胞中表达,电镜观察可见转染细胞骨架的破坏和细胞核固缩等凋亡特征.结论:人截短型AIF(AIF△1-400)基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1999 | 01 02 |
| 1995 | 01 02 03 |
| 1994 | 01 02 |
| 1993 | 01 02 03 04 |
| 1992 | 01 02 03 04 |
| 1991 | 01 02 03 04 |
| 1990 | 01 02 |
| 1989 | 01 02 03 04 |
